DE69222438T2

DE69222438T2 - Aids-virus-infektion hemmende zusammensetzung

Info

Publication number: DE69222438T2
Application number: DE69222438T
Authority: DE
Inventors: Masa Hamada; Hiroo Hoshino; Yoko Crescent Ikejiri Oh Ikeda; Shinichi Kondo; Tomio Takeuchi
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1992-12-25
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-12-26
Also published as: ES2108254T3; KR940703656A; DE69222438D1; CA2125568A1; BR9206978A; US5665779A; ZA929974B; EP0653207A4; EP0653207B1; DK0653207T3; ATE158503T1; JPH05178743A; EP0653207A1; WO1993012776A1; CN1074369A

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Hemmung einer Infektion mit einem Virus, der kausal ist für erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom, nämlich dem AIDS-Virus (im weiteren manchmal abgekürzt als HIV), wobei diese Zusammensetzung D-β-Lysylmethandiamin, einem Salz oder Hydrat desselben als aktiven Inhaltsstoff umfaßt. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Hemmung der Infektion von menschlichen T-Zellen mit AIDS-Virus, welches umfaßt, daß menschliche T-Zellen in vitro mit D- β-Lysylmethandiamin, ein Salz oder Hydrat desselben behandelt werden. Diese Erfindung schließt weiterhin die Verwendung von D-β-Lysylmethandiamin, einem Salz oder Hydrat desselben zur Herstellung einer antiviralen Zusammensetzung zur Hemmung der Infektion mit AIDS-Virus ein.

STAND DER TECHNIK

AIDS ist eine Erkrankung, die darauf beruht, daß menschliche T-Zellen mit AIDS-Virus infiziert sind. AIDS hat Probleme in der menschlichen Gesellschaft mit sich gebracht. Es ist über mehrere Mittel zur Inaktivierung von HIV berichtet worden. Alle diese HIV-inaktivierenden Mittel sind jedoch nicht notwendigerweise befriedigend als ein Heilmittel für AIDS. Demgemäß besteht ein herausragendes Bedürfnis, solch ein neues antivirales Mittel zu entwickeln und zur Verfügung zu stellen, das niedrige Toxizität besitzt, aber eine hohe Aktivität zeigen kann, die Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV zu hemmen.
Andererseits ist D-β-Lysylmethandiamin, das von den gegenwärtigen Erfindern schon früher erhalten wurde, ein Antibiotikum, das schwache antibakterielle Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien besitzt. D-β-Lysylmethandiamin hat die einzigartige Struktur, die durch die folgende Formel (I) dargestellt ist,
in der (R) einen stereochemischen Indikator darstellt.
Diese Verbindung ist ein bekanntes Antibiotikum, das von einem Mikroorganismus: Streptomyces nashvillensis produziert wird und über das die gegenwärtigen Erfinder berichtet hatten (siehe "Journal of Antibiotics" Vol 39, No. 3, Seite 476 (1986) und Japanische Patentanmeldung Erstveröffentlichung "Kokai" Sho-62-114947, Beschreibung veröffentlicht am 26. Mai 1987). D-β-Lysylmethandiamin-Hemicarbonat (1/2 H&sub2;CO&sub3;) liegt in der Form eines farblosen Pulvers vor, das hygroskopisch ist, aber keinen exakten meßbaren Schmelzpunkt besitzt. Seine spezifische optische Drehung beträgt [α]D²&sup6;-7,4º (c 0,5 Wasser).
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem ist die Bereitstellung von Verbindungen, die zur Behandlung von AIDS-Virusinfektionen nützlich sind.
Das Problem wird durch die Verwendung von D-β-Lysylmethandiamin gelöst.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Um die oben genannten Ziele zu erreichen, haben wir, die gegenwärtigen Erfinder, umfangreiche Forschungen betrieben. Als Folge davon haben die gegenwärtigen Erfinder nunmehr entdeckt, daß D-β-Lysylmethandiamin, ein Salz oder Hydrat desselben eine hohe Aktivität in der Hemmung der Infektion menschlicher T- Zellen mit HIV zeigt, aber eine niedrige Toxizität gegenüber Säugern besitzt. Somit ist gemäß unseren Experimenten festgestellt worden, daß, wenn menschliche T-Zellen, die mit D-β- Lysylmethandiamin oder einem Salz oder Hydrat desselben behandelt und anschließend in einem Kulturmedium inkubiert worden sind, mit HIV in Kontakt gebracht werden, die Infektion der menschlichen T-Zellen mit HIV unter der Wirkung von D-β-Lysylmethandiamin oder dem Salz oder Hydrat desselben gehemmt werden kann. Daher haben D-β-Lysylmethandiamin, ein Salz und Hydrat desselben eine hohe Aktivität, um die Infektion menschlicher T-Zellen mit HIV zu hemmen, und besitzen, in einem breiten Sinne, eine antivirale Aktivität gegenüber HIV.
Diese Erfindung stellt die Verwendung von D-β-Lysylmethandiamin der Formel (I), eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Hydrates desselben zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung einer Infektion mit AIDS-Virus zur Verfügung.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUR UMSETZUNG DER ERFINDUNG

D-β-Lysylmethandiamin, das als aktiver Inhaltsstoff oder aktive Verbindung gemäß dieser Erfindung verwendet wird, ist eine wasserlösliche Substanz basischer Natur und kann daher ein Säureadditionssalz mit einer Säure, entweder anorganisch oder organisch, bilden. Die Säuren, die für die Bildung des besagten Säureadditionssalzes verfügbar sind, schließen pharmazeutisch annehmbare anorganische Säuren, wie etwa Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen, sowie pharmazeutisch annehmbare organische Säuren, wie etwa Essigsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Methansulfonssäure und dergleichen, ein.
D-β-Lysylmethandiamin, das gemäß dieser Erfindung verwendet wird, ist gekennzeichnet durch seine niedrige Toxizität gegenüber Säugern. In den Tests zur Abschätzung der akuten Toxizität dieser Verbindung, in denen Mäusen intravenös D-β-Lysylmethandiamin verabreicht wurde, konnten die Mäuse, die eine Applikation von D-β-Lysylmethandiamin erhielten, z.B. eine Dosis von 250 mg/kg D-β-Lysylmethandiamin tolerieren, ohne daß dies ihren Tod mit sich brachte.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung, die D-β-Lysylmethandiamin, ein Säureadditionssalz oder ein Hydrat desselben als inaktiven Inhaltsstoff in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren festen oder flüssigen Trägerstoff für den aktiven Inhaltsstoff enthalten, können in verschiedenen Formen formuliert werden. Die so formulierte Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung zur Hemmung der AIDS-Infektion kann herkömmliche Zubereitungen annehmen, wie etwa Pulver, Körner, Tabletten, Sirupe, Injektionen und dergleichen, zur oralen Verabreichung oder zur parenteralen Verabreichung.
Die folgenden Untersuchungstests wurden durchgeführt, um zu belegen, daß D-β-Lysylmethandiamin eine hohe inhibitorische Aktivität gegenüber der Infektion menschlicher T-Zellen mit HIV, nämlich dem AIDS-Virus, besitzt. Die Vorgehensweise für diese Untersuchungstests ist wie folgt:

Testbeispiel 1

Die inhibitorischen Wirkungen von D-β-Lysylmethandiamin auf die Infektion menschlicher T-Zellen mit HIV wurden in einer ähnlichen Art und Weise untersucht wie bei den Untersuchungsmethoden, die beschrieben sind in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA," 80, 6061-6065 (1983); "J. Antibiot.", 40, 1077-1078, (1987); "J. Antibiot.", 42, 344-346 (1989) and "J. Antibiot." 44, 1228-1236 (1991).
1 x 10&sup5; Zellen/ml MT-4 Zellen (menschliche T-Zelllinie) in phosphatgepufferter Salzlösung wurden auf Costar-Platten mit 48 Näpfen in einer Menge von 0,5 ml/Napf aufgebracht. Zu jedem Napf wurden 0,05 ml einer Lösung der Testverbindung zugegeben, nämlich D-β-Lysylmethandiamin (gelöst mit verschiedenen Konzentrationen von 3, 10, 30 und 100 µg per ml in phosphatgepufferter Salzlösung). Nach Inkubation für 2 Stunden bei 37ºC unter 5 % CO&sub2; wurden die MT-4-Zellen mit 0,05 ml HIV (HTLV-IIIB- Stamm) infiziert, zugegeben in einer Menge der Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 0,025 bis 0,05 in jedem Napf. Die Platten wurden für 4 Tage bei 37ºC unter 5 % CO&sub2; inkubiert, so daß die T-Zellen in der Gegenwart der Testverbindung bei den verschiedenen Konzentration behandelt wurden.
Portionen der inkubierten Kulturen wurden entnommen und die MT-4-Zellen wurden auf Objektträgern ausgestrichen, getrocknet und mit Aceton fixiert. Das Vorhandensein der HIV-Antigen-positiven MT-4-Zellen wurde nachgewiesen mit dem indirekten Immunfluoreszenz-Test [Y. Hinuma et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA," 78, 6476-6480, (1981) und Y. Takeuchi et al., "Gann.", 78, 11-15 (1987)]. Zu diesem Zweck wurden die Zellausstriche, d.h. die Aceton-fixierten Zellausstriche, bei 37ºC für 30 Minuten mit einem Serum von AIDS-Patienten mit einer Verdünnung von 1:10 in phosphatgepufferter Salzlösung, das als der erste Antikörper verwendet wurde, behandelt. Nachdem sie danach mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen worden waren, wurden die MT-4-Zellen bei 37ºC für 30 Minuten mit fluoreszierendem Isothiocyanat-konjugierten Kaninchen-anti-Human-IGG-Serum (Cappel Laboratories, Cocharanville, PA, USA) behandelt, das als der zweite Antikörper eingesetzt wurde. Nachdem die Zellausstriche anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mit einem Deckgläschen abgedeckt waren, wurden die MT-4-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Prozentanteile der Anzahl der Virusantigen-positiven MT-4-Zellen (nämlich der immunfluoreszierenden Zellen, in denen die HIV-assoziierten Antigene vorhanden und exprimiert waren), in der Gesamtzellanzahl wurden berechnet.
Für die Kontrolltests zur Abschätzung der Anzahl der Gesamtzellanzahl im Test wurden die obigen Testschritte ohne Zugabe von D-β-Lysylmethandiamin wiederholt.
Außerdem wurde die Cytotoxizität von D-β-Lysylmethandiamin gegenüber MT-4-Zellen abgeschätzt. Dies wurde so gemacht, daß die MT-4-Zellen variierenden Konzentrationen von zugesetztem D-β-Lysylmethandiamin und in der Abwesenheit von HIV inkubiert wurden, aber in derselben Art und Weise der Inkubation und unter denselben Bedingungen der Inkubation von MT-4-Zellen wie diejenigen, die in den oben genannten Testverfahren zur Untersuchung der Aktivität von D-β-Lysylmethandiamin zur Hemmung der Infektion von T-Zellen mit HIV eingesetzt wurden. Mit dem Symbol "-" in Tabelle 1 unten wird angegeben, daß keine Cytotoxizität beobachtet wurde.
Um die Aktivität von D-β-Lysylmethandiamin zur Hemmung der Infektion von menschlichen T-Zellen, nämlich den MT-4-Zellen, mit HIV abzuschätzen, wurde eine Berechnung der Prozentanteile (T/C, %) der Anzahl (T) der HIV-Antigen-positiven Zellen, gemessen in den oben genannten Tests, in denen die Inkubation von MT-4-Zellen in der Gegenwart der Testverbindung bewirkt wurde, gegenüber der Anzahl (C) der HIV-Antigen-positiven Zellen, gemessen in den oben genannten Kontrolltests, in denen die Inkubation von MT-4-Zellen ohne die Zugabe der Testverbindung bewirkt wurde, vorgenommen. Die Ergebnisse der derartigen Berechnung der T/C Werte (%) sind in Tabelle 1 als Anteil (%) des Vorhandenseins oder Auftretens der HIV-Antigen-positiven Zellen dargestellt. Tabelle 1
Wie aus den Testergebnissen von Tabelle 1 oben klar sein wird, wird bestatigt, daß D-β-Lysylmethandiamin, das gemäß dieser Erfindung verwendet wird, selbst bei einer Konzentration von 100 µg/ml keine Cytotoxizität besitzt und die Anzahl der HIV- Antigen-positiven Zellen bei Konzentrationen von nicht mehr als 100 µg/ml signifikant verringern kann, das heißt, das Vorhandensein der HIV-Virusantigene merklich hemmen kann. 50 % effektive Konzentration (ED&sub5;&sub0;) von D-β-Lysylmethandiamin gegenüber HIV betrug 0,62 µg/ml.
Diese Tatsache zeigt, daß HIV aufgrund des Vorhandenseins von D-β-Lysylmethandiamin in den MT-4-Zellen nicht in der Lage sein wird zu proliferieren, so daß die Entwicklung der HIV- Virusantigene in den menschlichen T-Zellen gehemmt werden kann.
Es ist nunmehr durch vor kurzem durchgeführte Experimente festgestellt worden, daß D-β-Lysylmethandiamin bei einer Konzentration von 100 µg/ml weder irgendeine inhibitorische Aktivität gegenüber reverser Transkriptase von HIV noch irgendeine inhibitorische Aktivität gegenüber Protease von HIV zeigt. Somit ist es offensichtlich, daß D-β-Lysylmethandiamin die Infektion menschlicher T-Zellen mit HIV über einen bisher unbekannten Mechanismus in starkem Maße hemmen kann.
Nebenbei bemerkt wurden die oben genannten Tests gleichzeitig unter Verwendung von DDI (nämlich, 2',3'-Dideoxyinosin) wiederholt, das vor kurzem als Arzneimittel zur Behandlung von AIDS eingesetzt worden ist, und es wurde dann festgestellt, daß der ED&sub5;&sub0;-Wert von DDI gegenüber HIV 0,46 µg/ml betrug, was anzeigt, daß DDI die Wirkung der Hemmung der Infektion menschlicher T-Zellen mit HIV im selben Maße zeigt wie diejenige von D-β-Lysylmethandiamin gemäß dieser Erfindung.
Im allgemeinen kann D-β-Lysylmethandiamin entweder oral oder parenteral für seine tatsächliche Verabreichung als ein antivirales Mittel zur Hemmung der Infektion mit HIV oder als ein Mittel zur Inaktivierung von HIV gemäß dieser Erfindung verabreicht werden.
Die aktive Inhaltsstoffverbindung, die gemäß dieser Erfindung verwendet wird, nämlich D-β-Lysylmethandiamin oder ein Salz oder Hydrat desselben, kann allein verabreicht werden, oder sie kann in der Form einer solchen Formulierung wie einer Injektion, eines oralen Präparates, eines Suppositoriums oder dergleichen, die (das) die aktive Verbindung vermischt mit einem Hilfsstoff oder Trägerstoff enthält, verabreicht werden. Alle pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffe oder Trägerstoffe sind für diesen Zweck auswählbar Die Natur und Zusammensetzung des verwendeten Trägerstoffs kann in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und der Verabreichungsweise variieren. Zum Beispiel können Wasser, Ethanol, ein tierisches oder pflanzliches Öl, wie etwa Sojabohnenöl, Sesamöl oder Mineralöl, oder ein synthetisches Öl, als ein flüssiger Trägerstoff verwendet werden. Verwendbare feste Trägerstoffe schließen z.B. einen Zucker, wie etwa Maltose oder Saccharose, eine Aminosäure, wie etwa Lysin, ein Cellulosederivat, wie etwa Hydroxypropylcellulose, ein Polysaccarid, wie etwa Cyclodextrin, ein Salz einer organischen Säure, wie etwa Magnesiumstearat, oder dergleichen ein.
Im Fall der herzustellenden Injektionen ist es im allgemeinen bevorzugt, daß das flüssige Medium der Injektionen physiologische Kochsalzlösung, verschiedene gepufferte Lösungen, eine wäßrige Lösung eines Zuckers, wie etwa Glucose, Inosit oder Mannit, oder eines Glykols, wie etwa Ethylenglykol oder Polyethylenglykol, umfaßt. Es ist auch machbar, ein lyophilisiertes Präparat zu formulieren, das D-β-Lysylmethandiamin, ein Salz oder Hydrat desselben als den aktiven Inhaltsstoff, assoziiert mit einem Hilfsstoff, z.B. einem Zucker, wie etwa Inosit, Mannit, Glucose, Mannose, Maltose oder Saccharose, oder einer Aminosäure, wie etwa Phenylalanin, enthält. Bei Verabreichung kann ein solches lyophilisiertes Präparat in einem geeigneten Lösungsmittel für Injektionen, z.B. sterilisiertem Wasser oder einer intravenös verabreichbaren Flüssigkeit, wie etwa physiologische Kochsalzlösung, wäßriger Glucoselösung, einer wäßrigen Lösung von Elektrolyten oder einer wäßrigen Lösung von Aminosäuren, gelöst sein.
Obgleich der Anteil von D-β-Lysylmethandiamin, der in der formulierten Zusammensetzung vorliegt, in breitem Umfang von einem Präparat zu einem anderen Präparat variieren kann, kann er im allgemeinen in einem Bereich von 0,1-100 Gew.-% vorzugsweise 1-90 Gew.-% liegen. Im Fall der Zubereitung einer Injektion zum Beispiel ist es im allgemeinen wünschenswert, daß die injizierbare Lösung D-β-Lysylmethandiamin als aktiven Inhaltsstoff in einer Konzentration von 0,1-5 Gew.-% enthält. Für orale Verabreichung kann die Verbindung als aktiver Inhaltsstoff in Tabletten, Kapseln, einem Pulver, Körnern in Verbindung mit dem festen Träger formuliert werden oder kann in einer Lösung, einem Trockensirup oder dergleichen in Kombination mit dem flüssigen Trägerstoff formuliert werden. In Kapseln, Tabletten, Körnern oder einem Pulver kann der Anteil von D-β- Lysylmethandiamin als dem aktiven Inhaltsstoff, der darin vorhanden ist, im allgemeinen in einem Bereich von etwa 3-100 Gew.-%, vorzugsweise 5-90 Gew.-%, liegen, wobei der Rest aus einem Trägerstoff besteht.
Die Dosis von D-β-Lysylmethandiamin kann in geeigneter Weise unter Berücksichtigung des Alters, des Körpergewichts, der Symptome der Patienten und dem beabsichtigten therapeutischen Zweck bestimmt werden. Die therapeutische, d.h. wirksame Dosis von D-β-Lysylmethandiamin kann im allgemeinen in einem Bereich von 1-100 mg/kg/Tag für die parenterale Verabreichung und in einem Bereich von 5-500 mg/kg/Tag für die orale Verabreichung liegen. Diese Dosis kann entweder kontinuierlich oder intermittierend verabreicht werden, solange die Gesamtdosis nicht ein spezifisches Niveau übersteigt, das im Hinblick auf die Ergebnisse von Tierversuchen und verschiedenen Umständen festgelegt wurde.
In ähnlicher Weise kann die Gesamtdosis, die mit der parenteralen Verabreichung gegeben wird, natürlich in geeigneter Weise in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg, dem Zustand des Patienten oder Tieres unter der Behandlung, z.B. dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht, der Empfindlichkeit, Nahrungsmitteln oder Ernährung, dem Verabreichungszeitpunkt, dem Verabreichungsweg, gleichzeitig verabreichten Medikamenten, Zuständen des Patienten und der Erkrankung variieren. Die geeignete Dosis und Verabreichungshäufigkeit von D-β-Lysylmethandiamin unter gegebenen Bedingungen muß von einem Facharzt durch Tests zur Bestimmung der optimalen Dosis und im Lichte der obigen Richtlinien bestimmt werden. Diese Anforderungen an die Verabreichung sollten auch auf die orale Verabreichung von D-β-Lysylmethandiamin zutreffen.
Diese Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, die verschiedenen Formen der Zusammensetzung zur Hemmung der Infektion mit HIV gemäß dieser Erfindung zeigen.

Formulierungsbeispiel 1

Eine Menge gereinigtes Wasser wurde zu 10 g D-β-Lysylmethandiamin-Hydrochlorid zugegeben. Nach Auflösung der Hydrochloridverbindung in Wasser wurde die so hergestellte Lösung (100 ml) einer Sterilisierungsfiltration unterzogen, indem sie durch einen mikroporösen Filter der Marke "Millipore Filter GS" hindurchgegeben wurde. Ein Milliliter des so erhaltenen sterilen Filtrats wurde in jede 5 ml-Ampulle überführt und anschließend lyophilisiert, um ein lyophilisiertes Präparat zur Injektion zu erhalten, das 100 mg D-β-Lysylmethandiamin-Hydrochlorid pro Ampulle enthielt.

Formulierungsbeispiel 2

5 g D-β-Lysylmethandiamin-Hydrochlorid, 60 g Lactose, 33 g kristalline Cellulose und 2 g Hydroxypropylcellulose wurden gründlich miteinander vermischt. Die resultierende pulverförmige Mischung wurde in eine Walzenpresse (Roller Compactor, Marke) verpreßt und die resultierenden komprimierten Feststoffe wurden anschließend zerbrochen. Das so zerbrochene Material wurde durchgesiebt. Die Fraktion der resultierenden Körner, die Größen zwischen 16 mesh und 60 mesh hatten, wurde als das gewünschte körnige Präparat gesammelt.

Formulierungsbeispiel 3

3 g D-β-Lysylmethandiamin, 12 g kristalline Cellulose, 5 g Cellulose und 0,3 g Magnesiumstearat wurden miteinander in einen V-Mischer vermischt und zu Tabletten verpreßt, die jede 50 mg D-β-Lysylmethandiamin als den aktiven Inhaltsstoff pro Tablette enthielten.
Die Herstellung von D-β-Lysylmethandiamin wurde durchgeführt durch Einimpfen von Streptomyces-nashvillensis-MD743-GF4-Stamm in einem Kulturmedium, das solche Nährstoffquellen enthält, die von üblichen Mikroorganismen verwendet werden können, und anschließendes Kultivieren besagten Stammes, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen. D-β-Lysylmethandiamin wird so produziert und primär in der Kulturbrühe akkumuliert und kann aus der resultierenden Kultur gewonnen werden, insbesondere aus der Kulturbrühe oder deren Filtrat.
Die in für die Kultivierung von besagtem Stamm zu verwendenden Kulturmedium verfügbaren Nährstoffquellen können jede der herkömmlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, die als Nährstoffquellen für die Kultivierung bekannter Stämme von Actinomycetes brauchbar sind. Zum Beispiel können die assimilierbaren Stickstoffquellen Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Maisquellwasser, Natriumnitrat und Ammoniumsulfat einschließen, die kommerziell verfügbar sind. Die assimilierbaren Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate, wie etwa Glucose, Galactose, Stärke, Glyzerin, Maltosedextrin, Saccharose, Lactose oder Sojabohnenöl, und Fette einschließen, die kommerziell verfügbar sind. Das Kulturmedium kann auch anorganische Salze enthalten, wie etwa Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Ammoniumsulfat und Phosphate, sowie verschiedene Aminosäuren. Alle für die Kultivierung bekannter Actinomycetes verfügbaren Nährstoffmaterialien können für die Kultivierung von besagtem MD743-GF4-Stamm verwendet werden, wenn sie von dem D-β-Lysylmethandiamin-produzierenden Stamm nutzbar und für diesen Mikroorganismus zur Herstellung von D- β-Lysylmethandiamin brauchbar sind.
Bei der Kultivierung von besagtem MD743-GF4-Stamm wird die Submers-Flüssigkultivierungsmethode unter Belüftung und Rühren für die Herstellung von D-β-Lysylmethandiamin in kommerziellem Maßstab bevorzugt. Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb des Bereiches von Temperaturen ausgewählt werden, bei denen der D-β-Lysylmethandiamin-produzierende Stamm wachsen kann und das gewünschte D-β-Lysylmethandiamin produzieren kann. Insbesondere kann die Kultivierungstemperatur vorzugsweise bei 25 bis 30ºC liegen. Die Kultivierung des MD743-GF4-Stammes kann üblicherweise fortgesetzt werden, bis D-β-Lysylmethandiamin produziert und in einer genügenden Menge in der resultierenden Kultur akkumuliert ist. Normalerweise kann die Kultivierung für 2 bis 7 Tage bewirkt werden.
D-β-Lysylmethandiamin, seine Säureadditionssalze und Hydrat sind gut löslich in Wasser und können primär im flüssigen Teil der Kulturbrühe des D-β-Lysylmethandiamin-produzierenden Stammes vorhanden sein. D-β-Lysylmethandiamin, das im flüssigen Teil der Kultur vorhanden ist, kann im wesentlichen nicht mit Butanol, Butylacetat, Chloroform und anderen organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, und somit sind die Behandlungen des Brühefiltrats mit diesen organischen Lösungsmitteln verwendbar, falls erforderlich, um aus der Kulturbrühe die unerwünschten Verbindungen oder Verunreinigungen zu entfernen, die darin vorhanden sind. D-β-Lysylmethandiamin, das in der Kulturbrühe oder in wäßrigen Lösungen vorliegt, kann durch Adsorption unter Verwendung verschiedener Arten von Adsorptionsmitteln gewonnen werden. Wenn Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet wird, kann D-β-Lysylmethandiamin in seiner adsorbierten Form von Aktivkohle desorbiert werden, indem es mit schwach saurem Wasser oder schwach saurem wäßrigen Methanol, wäßrigem Propanol, wäßrigem Aceton und dergleichen eluiert wird.
Da D-β-Lysylmethandiamin basischer Natur ist, wird diese Verbindung effizient von einem Kationenaustauschharz adsorbiert und ist mit geeigneten Elutionsmitteln von diesem Harz eluierbar. Die für diesen Zweck verfügbaren Kationenaustauscher schließen Kationenaustauschharze ein, die Carbonsäurefunktionen enthalten, in der H-Form, Na-Form oder NH&sub4;-Form, wie etwa Amberlite IRC-50, Amberlite CG-50 (Handelsnamen, ein Produkt von Rohm & Haas Co., U.S.A.), Lewatit CNP (Handelsname, ein Produkt von Bayer Co., Deutschland) und CM-Sephadex (Handelsname, Produkte von Pharmacia Co., Schweden), entweder allein oder in Vermischung. Das Antibiotikum in seiner von dem Harz adsorbierten Form kann unter Verwendung von saurem Wasser, verdünntem wäßrigen Ammoniak oder wäßrigen Lösungen anorganischer Salze und dergleichen effizient aus dem Harz eluiert werden. Die Elution kann üblicherweise unter Verwendung von 0,2 N - 1 N Salzsäure und 0,5 N - 2 N wäßrigem Ammoniak durchgeführt werden. D-β-Lysylmethandiamin ist im wesentlichen nicht von einem Anionenaustauschharz adsorbierbar, und dies kann zur Neutralisierung saurer Lösungen verwendet werden, die besagte Verbindung enthalten, oder zur Entfernung der sauren Verunreinigungen aus besagter Verbindung.
D-β-Lysylmethandiamin kann in seiner gereinigten Form erhalten werden, indem die oben genannten Extraktionsverfahren und Trennverfahren in richtiger Kombination durchgeführt oder eines oder mehrere dieser Verfahren wiederholt werden.
Mikrobiologische Eigenschaften des D-β-Lysylmethandiamin-produzierenden Stammes, Streptomyces-nashvillensis-MD743-GF4- Stamm, sind im Detail beschrieben in der Beschreibung der vorgenannten japanischen Patentanmeldung erste Veröffentlichung "Kokai" Sho-62-114947. Eine Zusammenfassung der mikrobiologischen Eigenschaften dieses MD743-GF4-Stammes ist unten angegeben.
Unter dem Mikroskop wird beobachtet, daß der MD743-GF4-Stamm verzweigte Substratmycele aufweist, aus denen sich Luf thyphen in der Form von Spiralen entwickeln. Es werden keine Wirbel gebildet. Die Ketten reifer Sporen besitzen eine Kette von mehr als 20 Sporen, und die Sporen haben Abmessungen von 0,6 - 0,7 x 1,4 - 1,7 Mikrons und besitzen glatte Oberflächen. Auf verschiedenen Kulturmedien zeigt der MD743-GF4-Stamm, daß das Wachstum von farblos zu schwachgeiblich brauner oder hellbrauner Farbe gebildet wird, mit der Entwicklung von Lufthyphen weißer bis hellbräunlich grauer Farbe und daß lösliches Pigment nicht in allen Fällen gebildet wird oder lösliches Pigment gelblicher Farbe geringfügig gebildet wird. Die Bildung des Melanoid-Pigmentes ist positiv. Das Ausmaß der proteinzersetzenden Aktivitäten des MD743-GF4-Stammes ist mittel, aber das Ausmaß der stärkehydrolisierenden Aktivitat ist ziemlich stark.
Im Vergleich ist der MD743-GF4-Stamm in guter Übereinstimmung mit einem bekannten Mikroorganismus, Streptomyces-nashvillensis IMC S-0342 (ISP 5314) (siehe das "International Journal of Systematic Bacteriology" Vol 19, Seite 455 (1969)), mit der Ausnahme, daß der MD743-GF4-Stamm keine Nutzung von D-Xylose zeigt, während der IMC-S-0342-Stamm (ISP 5314) Nutzung von D- Xylose zeigt.
Streptomyces-nashvillensis-MD743-GF4-Stamm, der oben erwähnt ist, wurde hinterlegt am 7. September 1985 (als FERM P-8442) und erneut hinterlegt am 25. Dezember 1991 und ist hinterlegt worden in einer anerkannten japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter der Hinterlegungsnummer "FERM P-12676" seit dem 25. Dezember 1991. Der MD743-GF4-Stamm ist nunmehr in besagtem "Fermentation Research Institute" unter der Zugangsnummer "FERM BP-4127" hinterlegt worden, überführt nach dem Budapester Vertrag. Dieses "Fermentation Research Institute" liegt in Tsukuba-City, Ibaragi-ken, Japan.
Als nächstes wird ein Beispiel der fermentativen Herstellung von D-β-Lysylmethandiamin im folgenden Bezugsbeispiel 1 beschrieben.

Bezugsbeispiel 1

Eine Menge Streptomyces-nashvillensis-MD743-GF4-Stamm (FERM P- 12676, jetzt aber "FERM BP-4127"), die in einem Schrägagarmedium inkubiert worden war, wurde in ein flüssiges Kulturmedium eingeimpft, das 2,0 % Galactose, 2,0 % Dextrin, 1,0 % Pepton (verfügbar unter dem Handelsnamen "Bacto-Soytone", ein Produkt von Difco Co.), 0,5 % Maisquellwasser (ein Produkt von Ajinomoto Co.), 0,2 % Ammoniumsulfat und 0,2 % Calciumcarbonat umfaßte, das in 110 ml-Portionen in konische Kolben mit 500 ml- Fassungsvermögen gegeben wurde. Das beimpfte Kulturmedium wurde bei 28ºC für 2 Tage unter Rotationsrütteln (180 UPM) inkubiert, um eine erste Impfkultur bereitzustellen. Diese erste Impfkultur wurde in 2 ml-Portionen in 110 ml-Portionen des flüssigen Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie oben eingeimpft, die in 90 konische Kolben gegeben wurde. Die beimpften Kulturmedien in diesen 90 Kolben wurden für 3 Tage unter denselben Bedingungen für die Inkubation, wie oben beschrieben, inkubiert.
Die so erhaltenen Kulturbrühen wurden gesammelt, vereinigt und filtriert, um 9000 ml des Kulturbrühenfiltrats (pH 6,0, mit einer Potenz von 80 µg/ml) zu ergeben. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule aus 550 ml eines Kationenaustauschharzes, Amberlite IRC-50 (eine Mischung der NH&sub4;-Form und H-Form, 7:3), hindurchgegeben, um Adsorption von dem D-β-Lysylmethandiamin durch das Harz zu bewirken. Die Harzsäule wurde anschließend mit 1100 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 1,2 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden gesammelt, vereinigt (1370 ml) und unter verringertem Druck bis zur Trockne konzentriert, um 636 mg eines Rohpulvers zu erhalten (mit einer Potenz von 644 µg/mg).
Dieses Rohpulver wurde in 10 ml Wasser gelöst und die resultierende wäßrige Lösung wurde durch eine Säule aus 60 ml Amberlite CG-50 (NH&sub4;-Form) zur Adsorption der aktiven Verbindung hindurchgegeben. Diese Harzsäule wurde anschließend mit 120 ml Wasser gewaschen (wobei der Ablauf aus der Kolonne als Fraktionen Nr. 1 bis 18 gesammelt wurde), gefolgt von Waschen mit 300 ml 0,6N wäßrigem Ammoniak (wobei der Ablauf als Fraktionen Nr. 19 bis 60 gesammelt wurde). Schließlich wurde die Harzsäule mit 300 ml 1,2N wäßrigem Ammoniak eluiert, um Fraktionen Nr. 61 bis 101 des Eluats zu ergeben.
Die Fraktionen Nr. 77 bis 95 wurden vereinigt und unter verringertem Druck bis zur Trockne konzentriert und weitergetrocknet, um D-β-Lysylmethandiamin-Hemicarbonat in der Form der farblosen pulverförmigen Substanz zu liefern, die hydroskopisch war. Die Ausbeute betrug 370 mg (mit einer Potenz von 1000 µg/mg) und die Ausbeute, bezogen auf die Kulturbrühe, wurde zu 50,8 % berechnet. Diese Substanz zeigt eine spezifische optische Drehung [α]D²&sup6; -7,4º (c 0,5, Wasser). Wenn diese Substanz Wasser adsorbiert hat, wird sie ein farbloser Sirup.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Wie hierin zuvor beschrieben, ist gemäß dieser Erfindung nunmehr festgestellt worden, daß D-β-Lysylmethandiamin, ein Salz oder Hydrat desselben eine Aktivität zur Hemmung der Infektion mit AIDS-Virus besitzt (dem Virus, der kausal ist für erworbenes menschliches Immundefizienz-Syndrom), nämlich HIV. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die obige Verbindung oder ein Salz oder Hydrat derselben als aktiven Inhaltsstoff enthält, wird bereitgestellt. Es wird erwartet, daß sie ein Heilmittel für die Behandlung von AIDS ist, von dem man heute annimmt, daß es schwierig zu heilen ist.

Claims

1. Verwendung von D-β-Lysylmethandiamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Hydrat desselben zur in- vitro-Behandlung von menschlichen T-Zellen, um ihre Infektion mit AIDS-Virus zu hemmen.

2. Verwendung von D-β-Lysylmethandiamin der Formel

in der das Symbol (R) einen stereochemischen Indikator darstellt, oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Hydrat desselben zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Infektion mit AIDS- Virus.