DE68929084T2

DE68929084T2 - Arzneimittel zur Verhinderung einer Infektion mit dem für AIDS verantwortlichen Virus

Info

Publication number: DE68929084T2
Application number: DE68929084T
Authority: DE
Inventors: Hiroo Hoshino; Shinichi Kondo; Tomio Takeuchi
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1988-08-22
Filing date: 1989-08-21
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2009-08-22
Also published as: KR900002787A; EP0356330A1; ZA896230B; DK410189D0; DK410189A; DE68929084D1; JPH0256432A; ES2139564T3; ATE185485T1; DK173449B1; JP2643340B2; CA1338703C; EP0356330B1; US5120717A; KR0173972B1

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung einer Infektion mit einem ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus, wobei die Zusammensetzung Benanomicin A oder ein Salz davon als Wirkstoff umfaßt. Die Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung einer Benanomicin A oder ein Salz davon als Wirkstoff umfassenden antiviralen Zusammensetzung ein, wobei die Zusammensetzung zur Inhibierung einer Infektion mit einem ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus verwendbar ist. Die Zusammensetzung kann ebenfalls zur inhibierenden Behandlung eines erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus verwendet werden.
Erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom (nachstehend manchmal nur "AIDS" genannt) erwies sich als eine Krankheit, die aufgrund von Human-T-Zellen, die durch einen ursächlichen Virus im menschlichen Blut infiziert wurden, verursacht wurde. Das Virus, das für das erworbene menschliche Immundefizienzsyndrom ursächlich ist, wird gewöhnlich als erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachendes Virus bezeichnet, was häufig als HIV abgekürzt wird. Es wurde berichtet, daß bestimmte bekannte Verbindungen als ein Mittel zur Inaktivierung von HIV oder als antivirales Mittel gegen HIV verwendbar sind. Jedoch ist nicht jede von diesen Verbindungen als ein verwendbares heilendes Mittel für AIDS notwendigerweise befriedigend.
AIDS ist eine bedeutende Erkrankung, die schwere Probleme in der menschlichen Gesellschaft hervorbringt, und es gibt ernsten Bedarf zur Entwicklung und Bereitstellung eines neuen Arzneimittels, das eine hohe Aktivität zur Verhinderung einer Infektion mit HIV zeigt und das als ein verwendbares Arzneimittel zur therapeutischen oder präventiven Behandlung von Patienten mit AIDS annehmbar ist.
Wir, die hier genannten Erfinder und unsere Mitarbeiter, haben andererseits gefunden, daß, wenn ein Stamm von Actinomycetes, gekennzeichnet als MH193-16F4-Stamm, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, zwei Antibiotika, genannt Benanomicin A und Benanomicin B, in der Kultur erzeugt und akkumuliert werden. Benanomicin A und Benanomicin B sowie Salze davon haben in vivo starke antifungale Wirkung und Benanomicine A und B haben die allgemeine Formel (I):
wobei R eine Hydroxygruppe für Benanomicin A bedeutet und R eine Aminogruppe für Benanomicin B bedeutet.
Benanomicin A und Benanomicin B sowie Salze davon werden in "Journal of Antibiotics", Band 41, Seite 807 (Juni 1988) beschrieben und in der Beschreibung unserer gleichzeitig anhängigen Japanischen Patentanmeldung Nr. 277 692/87, eingereicht am 2. November 1987 (nun offengelegt als Japanische Patentanmeldung, erste Veröffentlichung "Kokai" Nr. 121293/89 am 12. Mai 1989) und in der Beschreibung der entsprechenden US-Patentanmeldung SN 264 888 (eingereicht am 31. Oktober 1988) oder der entsprechenden Europäischen Patentanmeldung Nr. 88-118 253.9, eingereicht am 2. November 1988 (nun offengelegt unter Europäischer Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 0 315 147 A2 am 10. Mai 1989) beschrieben.
Benanomicin A ist eine saure Substanz in Form eines rötlich-braunen Pulvers, das einen Schmelzpunkt höher als 220ºC aufweist und nur schwach in Methanol, Chloroform, Essigsäureethylester und Aceton löslich ist, jedoch in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und alkalischem Wasser löslich ist und in Wasser unlöslich ist. Benanomicin B ist eine amphotere Substanz und Benanomicin B-Hydrochlorid liegt in Form eines rötlich-braunen Pulvers vor, das einen Schmelzpunkt höher als 220ºC und eine spezifische Drehung [α]D&sub2;&sub2; + 360º (c 0,05 Wasser) aufweist und in Chloroform, Essigsäureethylester und Aceton nur schlecht löslich ist, und in Methanol, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Wasser löslich ist.
Wir haben nun gefunden, daß Benanomicin A und Salze davon eine höhere inhibitorische Aktivität gegen die Infektion von Human-T-Zellen mit HIV zeigen und daß sie, insbesondere wenn Human-T-Zellen, die mit Benanomicin A oder einem Salz davon behandelt wurden, in einem Kulturmedium mit HIV in Kontakt gebracht wurden, die Infektion von Human-T-Zellen mit HIV unter der Wirkung von Benanomicin A oder einem Salz davon inhibieren können.
Wir haben ebenfalls gefunden, daß Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen durch gleichzeitige Züchtung von menschlichen T-Zellen mit HIV-infizierten T-Zellen durch die Behandlung mit Benanomicin A und Salzen davon stark verhindert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Benanomicin A die Adsorption von HIV an die T-Zellen in früheren Stadien der HIV-Infektion verhindert. Benanomicin A weist gegen Candida, Cryptococcus oder Aspergillus antifungale Aktivitäten auf. Diese Pilze wurden häufig bei Patienten mit AIDS gefunden. Wenn weitere Analysen zeigen, daß Benanomicin A als ein antivirales Mittel für AIDS verwendet werden kann, kann somit dessen Verabreichung an Patienten mit AIDS oder AIDS verwandtem Komplex, die mit Pilzen infiziert sind oder ein Risiko für Pilzinfektion tragen, besonders vorteilhaft sein. In diesem Sinne weisen Benanomicin A und Salze davon eine Aktivität auf, um die Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV zu verhindern, und weisen in einem breitem Sinne eine antivirale Aktivität gegen HIV auf.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird deshalb eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung der Infektion mit einem ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus bereitgestellt, das als Wirkstoff mindestens eines von Benanomicin A mit der allgemeinen Formel (I) umfaßt
worin R eine Hydroxylgruppe ist, und Salze davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den Wirkstoff.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine antivirale Zusammensetzung zur Verhinderung von Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch einen ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus induziert werden, bereitgestellt, das eine wirksame Menge mindestens eines von Benanomicin und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon als Wirkstoff in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den Wirkstoff umfaßt.
In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung einer Infektion von menschlichen T-Zellen mit einem ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachendes Virus ein, das Behandeln von menschlichen T-Zellen mit Benanomicin A oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in einer Menge, die zur Verhinderung der Infektion mit dem Virus wirksam ist, umfaßt.
In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung außerdem ein Verfahren zur Inhibierung von Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch einen ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus induziert werden, das Behandeln der menschlichen T-Zellen mit Benanomicin A oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in einer Menge, die wirksam ist, die Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch das Virus induziert werden, ein.
Die Erfindung schließt weiterhin die Verwendung von Benanomicin A oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon bei der Herstellung einer antiviralen pharmazeutischen Zusammensetzung gegen ein ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachendes Virus ein.
Benanomicin A, das erfindungsgemäß als Wirkstoff verwendbar ist, ist eine saure Verbindung, die eine Carboxylgruppe enthält, so daß Benanomicin A durch Umsetzung mit einer basischen Verbindung verschiedene Salze an seiner Carboxylgruppe bilden kann. Die Salze, die Benanomicin A an seiner Carboxylgruppe bilden kann, schließen ein pharmazeutisch annehmbares Salz (das Carboxylat), wie ein Alkalimetallsalz, beispielsweise Natriumsalz, und ein Erdalkalimetallsalz, beispielsweise Calciumsalz, sowie ein Basenadditionssalz (an der Carboxylgruppe) mit einem pharmazeutisch annehmbaren organischen Amin, wie Niederalkylaminen, ein.
Benanomicin A ist durch niedrige Toxizität für Säugetiere gekennzeichnet. Beispielsweise wurde in den Tests zum Abschätzen der akuten Toxizität, wobei Mäusen intravenös Benanomicin A verabreicht wurde, gefunden, daß eine Dosierung von 600 mg/kg Benanomicin nicht letal war.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die entweder Benanomicin A oder ein Salz davon als Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren festen oder flüssigen Träger für den Wirkstoff enthalten, können in üblicher Weise zu üblichen Formen von medizinischer Zubereitung, wie Pulver, Granulate, Tabletten, Sirupe, Injektionen und dergleichen, zur oralen Verabreichung oder parenteralen Verabreichung formuliert werden.
Die nachstehenden Assaytests wurden durchgeführt, um zu zeigen, daß Benanomicin A eine inhibitorische Aktivität auf die Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV, nämlich dem erworbenen menschlichen Immundefizienzsyndrom, aufweist. Das Verfahren für diese Assaytests ist wie nachstehend:

Tests:

Wirkungen von Benanomicin A, die für die Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV verhindernd sind, wurden in ähnlicher Weise wie zu den in "Proc. Natl. Acad., Sci. USA", 80, 6061-6065 (1983); "J. Antibiot.", 40, 1077-1078, (1987); und "J. Antibiot.", 42, 344-346, (1989), beschriebenen Assayverfahren geprüft.
Etwa 1 · 105 Zellen/ml von MT-4-Zellen (menschliche T-Zellinie) in Phosphat-gepufferter Salzlösung wurden in Costar Titerplatten mit 48 Vertiefungen in einer Menge von 0,5 ml/Vertiefung geimpft. Zu jeder Vertiefung wurden 50 ul Benanomicin A-Lösung (gelöst mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid und verdünnt mit Phosphatgepufferter Salzlösung) gegeben. Zwei Stunden später wurden MT-4-Zellen mit 50 ul HIV (1000-10000 plaquebildende Einheiten) in jeder Vertiefung infiziert. Die Platten wurden 4 Tage bei 37ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert. Die MT-4-Zellen wurden auf Objektträgergläsern ausgestrichen, getrocknet und mit Aceton fixiert. Die Anwesenheit von HIV-Antigen-positiven Zellen wurde durch das indirekte Immunofluoreszenz-Assay [Y. Hinuma et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA," 78, 6476-6480, (1981)] untersucht. Zellausstriche wurden bei 37ºC 30 Minuten mit dem Serum eines AIDS-Patienten bei einer Verdünnung von 1 : 10 in Phosphat-gepufferter Salzlösung als erstem Antikörper behandelt. Nach Waschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung wurden die Zellen bei 37ºC 30 Minuten mit fluoreszierendem Isothiocyanat-konjugiertem Kaninchen-Antihuman-Immunoglobulinserum (Cappel Laboratories, Cochranville, PA, USA) als zweitem Antikörper behandelt. Nachdem die Zellausstriche mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen wurden und mit einem Deckglas bedeckt wurden, wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop geprüft. Die Prozentsätze der Anzahl an viralen Antigen-positiven Zellen (nämlich Immunofluoreszenzzellen, worin die HIV-assoziierten Antigene exprimiert wurden) auf die gesamten Zellen wurden berechnet.
Des weiteren wurde die Cytotoxizität von Benanomicin A gegen die MT-4-Zellen durch Inkubieren der MT-4-Zellen mit variierenden Konzentrationen an zugegebenem Benanomicin A und in Abwesenheit von HIV, jedoch in der gleichen Weise der Inkubation und unter den gleichen Inkubationsbedingungen von MT-4-Zellen, wie jene die in den vorstehend erwähnten Testverfahren zur Bewertung der Aktivität von Benanomicin A für die Inhibierung der Infektion von T-Zellen mit HIV angewendet wurden, geschätzt.
Die Ergebnisse der vorstehenden Tests der Bewertung der inhibitorischen Aktivitäten von Benanomicin A auf die HIV-Infektion sowie die Tests der Schätzung von Toxizitäten dieser Benanomicine werden in einer nachstehenden Tabelle gezeigt. Tabelle
Wie aus den Testergebnissen der vorstehenden Tabelle deutlich wird, wurde bestätigt, daß Benanomicin A bei einer Konzentration von 10 ug/ml frei von Toxizität ist und die Anzahl von viralen Antigen-positiven Zellen signifikant vermindern kann. Folglich wurde bestätigt, daß Benanomicin A bei der Verhinderung einer Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV hochwirksam ist.
Inhibitorische Wirkungen von Benanomicin A auf die Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch HIV eingeleitet wurde, wurden in der gleichen Weise wie in "J. Antibiot.", 42, 344-346 (1989) gemäß dem nachstehenden Verfahren geprüft:
Die Molt-4-Human-T-Zellen wurden in Costar Titerplatten mit 48 Vertiefungen in einer Menge von 100000 Zellen/Vertiefung inokuliert. Benanomicin A oder B Lösung wurde zugegeben. Nach 2 Stunden wurden Molt-4-Zellen, die mit HIV persistent infiziert wurden, bei 15000 Zellen/Vertiefung zugegeben. Die Zahl der Syncytia oder multinukleierten Riesenzellen, die in 5 · 5 mm Raum in j eder Vertiefung nach Züchtung für 24 Stunden gebildet wurde, wurde unter einem Mikroskop gezählt. Zellen, deren Durchmesser ungefähr 5-fach oder größer war, wie jener der Molt-4-Zellen, die nicht gleichzeitig mit HIV erzeugenden Molt-4-Zellen gezüchtet wurden, wurden als Syncytia angesehen.
Benanomicin A inhibierte die Syncytiumbildung der T- Zellen bei Konzentrationen von 10-100 ug/ml.
Im allgemeinen kann Benanomicin A entweder oral oder parenteral in Abhängigkeit von seiner genauen Verabreichung in Form einer antiviralen Zusammensetzung zur Verhinderung der Infektion mit HIV verabreicht werden.
Wenn die erfindungsgemäß verwendete Wirkstoffverbindung, nämlich Benanomicin A oder ein Salz davon, als das antivirale Mittel gegen HIV gegeben wird, kann es einzeln verabreicht werden oder es kann in Form einer Injektion, oralen Zubereitung, Suppositorium oder dergleichen, das einen Exzipienten oder Träger damit vermischt enthält, verabreicht werden. Jeder pharmazeutisch annehmbare Exzipient und Träger ist für jenen Zweck verfügbar. Die Art und Zusammensetzung des verwendeten Trägers kann in Abhängigkeit von Verabreichungsweg und -art schwanken. Beispielsweise können Wasser, Ethanol, ein tierisches oder pflanzliches Öl, wie Sojabohnenöl, Sesamöl oder Mineralöl, oder ein synthetisches Öl als flüssiger Träger verwendet werden. Geeignete feste Träger schließen beispielsweise einen Zucker, wie Maltose oder Saccharose, eine Aminosäure, ein Cellulosederivat, wie Hydroxypropylcellulose, ein Polysaccharid, wie Cyclodextrin, ein Salz einer organischen Säure, wie Magnesiumstearat oder dergleichen, ein. Im Fall der Injektionen ist es im allgemeinen bevorzugt, daß das flüssige Medium zur Injektion physiologische Salzlösung, eine gepufferte Lösung, eine wässerige Lösung eines Zuckers, wie Glucose, Inosit oder Mannit, oder ein Glycol, wie Ethylenglycol oder Polyethylenglycol, umfaßt. Es ist auch möglich, eine lyophilisierte Zubereitung, die ein Benanomicin als Wirkstoff enthält, vermischt zusammen mit einem Exzipienten, beispielsweise einem Zucker, wie Inosit, Mannit, Glucose, Mannose, Maltose oder Saccharose oder eine Aminosäure, wie Phenylalanin, zu formulieren. Bei der Verabreichung kann solche lyophilisierte Zubereitung in einem geeigneten Lösungsmittel zur Injektion, beispielsweise sterilisiertem Wasser, oder einer intravenös verabreichbaren Flüssigkeit, wie physiologischer Salzlösung, wässeriger Lösung von Glucose, einer wässerigen Lösung von Elektrolyten oder eine wässerige Lösung von Aminosäuren gelöst werden.
Obwohl der Anteil an Benanomicin A, der in der formulierten Zusammensetzung vorliegt, von einer Zubereitung zur anderen Zubereitung stark schwanken kann, kann er im allgemeinen in einem Bereich von 0,1-100 Gewichtsprozent, vorzugsweise 1-90 Gewichtsprozent, liegen. Im Fall einer Injektion ist es beispielsweise erwünscht, daß die injizierbare Lösung die Verbindung als Wirkstoff in einer Konzentration von 0,1-5 Gewichtsprozent enthält. Zur oralen Verabreichung kann die Verbindung als Wirkstoff in Tabletten, Kapseln, einem Pulver, Granulaten in Kombination mit einem festen Träger formuliert werden oder kann in eine Lösung, einen trockenen Sirup oder dergleichen in Kombination mit dem flüssigen Träger formuliert werden. In Kapseln, Tabletten, Granulaten oder einem Pulver kann der Anteil von Benanomicin als der darin vorliegende Wirkstoff im allgemeinen in einem Bereich von etwa 3- 100 Gewichtsprozent, vorzugsweise 5-90 Gewichtsprozent liegen, wobei der Rest von einem Träger gebildet wird.
Die Dosierung von Benanomicin A kann geeigneterweise in Anbetracht des Alters, Körpergewichts, Symptoms von Patienten und beabsichtigten therapeutischen Zwecks bestimmt werden. Die therapeutische, d. h. wirksame Dosierung von Benanomicin kann im allgemeinen in einem Bereich von 1-300 mg/kg/Tag für die parenterale Verabreichung und in einem Bereich von 5-500 mg/kg/Tag zur oralen Verabreichung liegen. Diese Dosierung kann entweder kontinuierlich oder unterbrochen, solange die Gesamtdosis nicht einen bestimmten Spiegel übersteigt, der im Hinblick auf Ergebnisse von Tiertests und verschiedenen Umständen entschieden wurde, verabreicht werden. Ähnlich kann die Gesamtdosierung, die in der parenteralen Verabreichung gegeben wird, natürlich geeigneterweise in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, den Zuständen des Patienten oder zu behandelnden Tiers, beispielsweise dem Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Empfindlichkeit, Nahrung oder Fut ter, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, gleichzeitig verabreichten Arzneimitteln, Zuständen des Patienten und Erkrankung schwanken. Die geeignete Dosierung und Verabreichungshäufigkeit eines Benanomicins muß unter gegebenen Bedingungen von einem Facharzt durch die Untersuchungen zur Bestimmung der optimalen Dosierung und im Lichte der vorstehenden Richtlinien bestimmt werden. Diese Erfordernisse zur Verabreichung gelten ebenfalls für die orale Verabreichung eines Benanomicins.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele erläutert, die verschiedene Zubereitungsformen oder erfindungsgemäße Zusammensetzungen zeigen.

Beispiel 1

Eine Menge von gereinigtem Wasser wurde zu 50 Gewichtsteilen Natriumsalz (das Carboxylat) von Benanomicin A gegeben, um insgesamt 2000 Gewichtsteile zu ergeben. Nach Auflösung des Natriumsalzes in Wasser wurde die so hergestellte Lösung mittels Durchleiten durch ein mikroporöses Filter mit einem Handelsnamen "Millipore Filter GS" Sterilisationsfiltration unterzogen. Zwei Gramm des erhaltenen sterilen Filtrats wurden in jeweils 10 ml-Fläschchen gegeben und anschließend unter Gewinnung einer lyophilisierten Zubereitung zur Injektion, die 50 mg Natriumsalz von Benanomicin A pro Fläschchen enthielt, lyophilisiert.

Beispiel 2

Fünfzig Gewichtsteile Benanomicin A, 600 Gewichtsteile Lactose, 330 Gewichtsteile kristalline Cellulose und 20 Gewichtsteile Hydroxypropylcellulose wurden sorgfältig miteinander vermischt. Das sich ergebende pulverförmige Gemisch wurde mit einer Preßmaschine vom Walzentyp (Roller Compactor, Handelsmarke) unter Druck gesetzt und anschließend wurden die sich ergebenden verdichteten Feststoffe zerkleinert. Das so zerkleinerte Material wurde gesiebt, die Fraktion der erhal tenen Granulate, die Größen zwischen 16 mesh und 60 mesh enthielt, wurde als granuläre Zubereitung gesammelt.

Beispiel 3

Dreißig Gewichtsteile Benanomicin A, 120 Gewichtsteile kristalline Lactose, 147 Gewichtsteile kristalline Cellulose und 3 Gewichtsteile Magnesiumstearat wurden in einem V- Modell-Mischer zusammen vermischt und in Tabletten, die jeweils 300 mg Benanomicin A als Wirkstoff pro Tablette enthielten, verpreßt.
Da Benanomicin A durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus MH193-16F4-Stamm hergestellt wurde, wird die fermentative Erzeugung dieses Antibiotikums hier anschließend beschrieben.
Die Herstellung von Benanomicin A kann durch Inokulieren des MH193-16F4-Stamms von Actinomycetes zu einem Kulturmedium, das Nährstoffquellen enthält, das von gewöhnlichen Mikroorganismen genutzt werden kann, und anschließend Inkubieren des Benanomicin erzeugenden Stamms unter aeroben Bedingungen ausgeführt werden. Benanomicine A und B werden erzeugt und hauptsächlich in der Kulturbrühe akkumuliert. Benanomicine A und B können aus der sich ergebenden Kultur, insbesondere aus der Kulturbrühe oder dessen Filtrat gewonnen werden.
Die Nährstoffquellen, die in dem zu verwendenden Kulturmedium erhältlich sind, können jede der üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, die als Nährstoffquellen für die Züchtung von bekannten Stämmen von Actinomycetes verwendbar sind. Beispielsweise können die assimilierbaren Stickstoffquellen Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Trockenhefe, Hefeextrakt, NZ-Amin, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, die kommerziell erhältlich sind, einschließen. Die assimilierbaren Kohlenstoffquellen können Glycerin, Saccharose, Stärke, Glucose, Galactose, Maltose, Dextrin, Lactose, Melassen, Sojabohnenöl, Fette und Aminosäuren, die kommerziell erhältlich sind, einschließen. Das Kulturmedium kann ebenfalls anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Cobaltchlorid und Manganchlorid enthalten. Zusätzlich können ebenfalls Spurenmengen von Metallsalzen und ein oder mehrere tierische, pflanzliche oder Mineralöle als Antischäumungsmittel zugegeben werden.
Ein flüssiges Züchtungsverfahren ist für die Erzeugung von Benanomicinen A und B in großem Maßstab bevorzugt. Die Züchtungstemperatur kann innerhalb des Bereichs von Temperaturen, bei denen Benanomicin erzeugende Mikroorganismen wachsen und Benanomicine A und B erzeugen können, ausgewählt werden. Die Züchtungstemperatur kann im allgemeinen bei 20- 40ºC, vorzugsweise bei 25-37ºC, liegen.
Zur Gewinnung von Benanomicinen A und B aus der sich ergebenden Kultur von Mikroorganismen, die Benanomicine A und B erzeugen können, können Benanomicine A und B aus der Kultur oder dem Kulturbrühenfiltrat extrahiert werden und dann unter Verwendung von üblichen Verfahren zur. Gewinnung und Reinigung, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschharzverfahren, adsorptive oder teilweise Säulenchromatographie, Gelfiltration, Dialyse, Ausfällung und dergleichen entweder einzeln oder in Kombination gereinigt werden. Beispielsweise können Benanomicine A und B aus dem inkubierten mycelialen Kuchen durch Extrahieren mit Aceton-Wasser oder Methanol-Wasser gewonnen werden. Andererseits können Benanomicine A und B, die in der Kulturbrühe oder dem Filtrat erzeugt und akkumuliert wurden, an einem Adsorptionsmittel, wie ein mikroporöses, nicht-ionisches, harzartiges Adsorptionsmittel, beispielsweise "DIAION HP-20" (Handelsname, synthetisches, harzartiges Adsorptionsmittel, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan), adsorbiert werden. Wenn zusätzlich die Kulturbrühe oder das Brühenfiltrat mit einem organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist, beispielsweise Butanol, Essigsäureethylester oder derglei chen, extrahiert wird, werden Benanomicin A und B-Substanzen in die organische Lösungsmittelphase extrahiert.
Für die Erzeugung von Benanomicinen A und B ist es bevorzugt, daß der MH193-16F4-Stamm in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37ºC vorzugsweise 3 bis 10 Tage gezüchtet wird, um Benanomicin A und Benanomicin B in der erhaltenen Kulturbrühe herzustellen und zu akkumulieren, die Kulturbrühe wird filtriert und das erhaltene Kulturbrühenfiltrat wird durch eine Säule eines Adsorptionsmittels geleitet, um die Adsorption von Benanomicin A und Benanomicin B durch das Adsorptionsmittel zu bewirken, und Benanomicin A und Benanomicin B werden durch chromatographisches Eluieren der Säule mit Adsorptionsmittel, an das Benanomicine A und B adsorbiert sind, aufgetrennt.
Die gegenseitige Isolierung und weitere Reinigung von Benanomicinen A und B, das chromatographische Verfahren mit der Verwendung eines Adsorptionsmittels, wie Kieselgel ("WAKOGEL C-300", Handelsname, Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Aluminiumoxid oder ein Gelfiltrationsmittel "Sephadex LH-20" (Handelsname; Produkt von Pharmacia AB) oder dergleichen können geeignet sein.
Benanomicine A und B, wie vorstehend beschrieben in der Kultur erzeugt, können als Benanomicine A und B als solche in deren freien Form isoliert werden.
Der Stamm MH193-16F4 wurde bei einer zugelassenen Japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government unter der Hinterlegungsnummer FERM P-9529 seit dem 21. August 1987 hinterlegt. Der Stamm MH193-16F4 wurde nun in dem "Fermentation Research Institute" bezüglich des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer "FERM BP-2051" hinterlegt. Diese japanische Hinterlegungsstelle befindet sich in Tsukuba- City, Ibaragi-ken, Japan.
Wenn eine Benanomicine A oder dessen konzentrierte Lösung enthaltende Lösung mit einer basischen Verbindung, beispielsweise einer anorganischen Base, einschließlich einer Alkalimetallverbindung, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, einer Erdalkalimetallverbindung, wie Calciumhydroxid oder Magnesiumhydroxid, und einem Ammoniumsalz sowie einer organischen Base, wie Ethanolamin, Triethylamin oder Dicyclohexylamin, während des Verlaufs von einem der Schritte zur Gewinnung, beispielsweise während der Extraktion, Isolierung oder Reinigung, behandelt wird, kommt es vor, daß Benanomicin A zu den entsprechenden Salzen, die dann in Form solcher Salze oder Salz abgetrennt oder isoliert werden können, umgewandelt wird.
Die nachstehenden Beispiele 4-5 erläutern die fermentative Erzeugung von Benanomicin A.

Beispiel 4

Die Menge einer gefüllten Schlaufe von MH193-16F4- Stamm (identifiziert als FERM BP-2051), die in einem Schrägagarmedium inkubiert wurde, wurde in 80 ml eines flüssigen Kulturmediums, umfassend 1,0% Stärke und 3,0% Sojabohnenmehl (pH 7,0 vor der Sterilisation), das gesondert in einem Sakaguchi-Kolben mit 500 ml Fassungsvermögen angeordnet wurde, inokuliert. Das inokulierte Kulturmedium wurde 3 Tage unter Rotationsschütteln (135 U/min) bei 28ºC 3 Tage unter Bereitstellung einer ersten Impfkultur inkubiert. Die erhaltene erste Impfkultur wurde in 3 ml-Portionen in 80 ml Portionen des flüssigen Kulturmediums mit der gleichen wie vorstehend beschriebenen Zusammensetzung, die getrennt in vielen Sakaguchi-Kolben angeordnet wurden, inokuliert. Die inokulierten Kulturmedien wurden 3 Tage unter den gleichen wie vorstehend beschriebenen Inkubationsbedingungen inkubiert, um die zweite Impfkultur zu ergeben. Die sich ergebende zweite Impfkultur (2 Liter) wurde dann zu einem Kulturmedium (50 Liter) der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend, die bei 120ºC 15 Minuten sterilisiert wurde und in einem Behälterfermenter mit 100 l Fassungsvermögen angeordnet wurde, inokuliert. Das so inokulierte Kulturmedium wurde dann 2 Tage bei 28ºC unter Be lüftung mit einer Geschwindigkeit von 50 l Luft pro Minute und unter Rühren bei 200 U/min gezüchtet, um submerse Züchtung des MH193-16F4-Stamms unter aeroben Bedingungen zu bewirken und eine dritte Impfkultur zu erhalten. Die erhaltene dritte Impfkultur (12 Liter) wurde in ein produktives Kulturmedium (300 Liter), umfassend 2,0% Glycerin, 1,5% Sojabohnenmehl (kommerziell unter einem Handelsnamen "Esusan Meat" erhältlich, ein Produkt von Ajinomoto Co. Ltd., Japan), 0,0025% K&sub2;HPO&sub4;, 0,1125% KH&sub2;PO&sub4;, 0,005% CoCl&sub2;6H&sub2;O, 0,03% Silikonöl "KM72" (ein Antischäumungsmittel, ein Handelsname eines Produkts von Shinetsu Chemicals Co., Ltd., Japan) und 0,01% eines Tensids "Adekanol" (ein Handelsname, Produkt von Asahi Denka Kogyo Co. Ltd., Japan), das vorher bei 125ºC 30 Minuten sterilisiert wurde und in einem Behälterfermenter mit 570 l Fassungsvermögen angeordnet wurde, inokuliert.
Die Züchtung erfolgte 7 Tage unter Rühren bei 300 U/min bei 28ºC und unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 150 l Luft pro Minute für die ersten 24 Stunden der Züchtung und anschließend mit einer Geschwindigkeit von 300 l Luft pro Minute nach der 24-stündigen Züchtung. Nachdem die Züchtung vollständig war, wurde die erhaltene Kulturbrühe mit Diatomeenerde als Filtrierhilfe vermischt und dann filtriert unter Gewinnung von 250 l des Kulturbrühenfiltrats (pH 6,0).

Beispiel 5

Das in dem vorstehenden Beispiel 4 erhaltene Kulturbrühenfiltrat (250 l) wurde durch eine Säule von 15 l eines mikroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharzes "DIAION HP- 20" geleitet unter Bewirkung von Adsorption der aktiven Substanzen durch das Adsorptionsmittel. Nachdem die Adsorptionsmittelsäule mit 100 l Wasser und mit 45 l 50%igem wässerigen Methanol gewaschen wurde, wurde die Adsorptionsmittelsäule mit 45 l 70%igem Methanol und anschließend mit 90 l trockenem Methanol eluiert, so daß die erste Fraktion (53 l), zweite Fraktion (38 l) und dritte Fraktion (27 l) des Elutionsmittels getrennt erhalten wurden. Die erste Fraktion, die die aktive Substanz enthielt, wurde unter vermindertem Druck auf 3 l konzentriert, gefolgt von Einstellung auf pH 3,5 mit verdünnter Salzsäure unter Abscheidung eines Niederschlags von roter Farbe. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 152 g eines rohen braunen Pulvers, das hauptsächlich Benanomicin A umfaßte, erhalten wurde.
150 Gramm des ungereinigten Pulvers wurden in 600 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Sättigung der erhaltenen Lösung mit Wasserdampf bei Raumtemperatur für 3 Tage in einem Exsickator wurde ein kristalliner Niederschlag abgeschieden. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und dann unter vermindertem Druck getrocknet unter Gewinnen von 29 g Benanomicin A-Dimethylformamid-Solvat. Die zweite Fraktion des Elutionsmittels wurde auf die gleiche Weise wie die erste Fraktion verarbeitet, wodurch 14 g Benanomicin A-Dimethylformamid-Solvat erhalten werden.
Ein Gramm des erhaltenen Benanomicin A-Dimethylformamid-SoTvats aus der ersten Fraktion wurde in Dimethylsulfoxid (5 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise unter Rühren in 300 ml Methanol gegeben, gefolgt von Rühren für 10 Minuten unter Abscheiden eines Niederschlags von rötlich-brauner Farbe. Der Niederschlag wurde ausfiltriert und dann unter vermindertem Druck getrocknet unter Bereitstellung von 935 mg eines gereinigten Benanomicin A als rötlichbraunes Pulver.
Eine Lösung von Benanomicin A (82,7 mg) in einem Gemisch von 10 ml Wasser und 1,1 ml 0,1M NaOH wurde lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 3 ml Methanol gelöst und an einer Sephadex LH-20 Säule (300 ml), entwickelt mit Methanol, chromatographiert unter Gewinnung von Benanomicin A Natriumsalz (75,8 mg).

Claims

1. Verwendung von Benenomicin A der Formel

wobei R eine Hydroxygruppe ist, oder von Salzen davon, zur Herstellung einer antiviralen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung einer Infektion mit einem ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus.

2. Verwendung von Benanomicin A oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, nach Anspruch 1, zur Herstellung einer antiviralen Zusammensetzung zur Verhinderung der durch einen ein erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus induzierten Synzytium-Bildung von menschlichen T-Zellen.