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Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische
Zusammensetzung zur Inhibierung einer Infektion mit einem ein
erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden
Virus, wobei die Zusammensetzung Benanomicin A oder ein Salz
davon als Wirkstoff umfaßt. Die Erfindung schließt ebenfalls
ein Verfahren für die Herstellung einer Benanomicin A oder
ein Salz davon als Wirkstoff umfassenden antiviralen
Zusammensetzung ein, wobei die Zusammensetzung zur Inhibierung
einer Infektion mit einem ein erworbenes menschliches
Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus verwendbar ist. Die
Zusammensetzung kann ebenfalls zur inhibierenden Behandlung
eines erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom
verursachenden Virus verwendet werden.
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Erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom
(nachstehend manchmal nur "AIDS" genannt) erwies sich als eine
Krankheit, die aufgrund von Human-T-Zellen, die durch einen
ursächlichen Virus im menschlichen Blut infiziert wurden,
verursacht wurde. Das Virus, das für das erworbene
menschliche Immundefizienzsyndrom ursächlich ist, wird gewöhnlich als
erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachendes
Virus bezeichnet, was häufig als HIV abgekürzt wird. Es wurde
berichtet, daß bestimmte bekannte Verbindungen als ein Mittel
zur Inaktivierung von HIV oder als antivirales Mittel gegen
HIV verwendbar sind. Jedoch ist nicht jede von diesen
Verbindungen als ein verwendbares heilendes Mittel für AIDS
notwendigerweise befriedigend.
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AIDS ist eine bedeutende Erkrankung, die schwere
Probleme in der menschlichen Gesellschaft hervorbringt, und es
gibt ernsten Bedarf zur Entwicklung und Bereitstellung eines
neuen Arzneimittels, das eine hohe Aktivität zur Verhinderung
einer Infektion mit HIV zeigt und das als ein verwendbares
Arzneimittel zur therapeutischen oder präventiven Behandlung
von Patienten mit AIDS annehmbar ist.
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Wir, die hier genannten Erfinder und unsere
Mitarbeiter, haben andererseits gefunden, daß, wenn ein Stamm von
Actinomycetes, gekennzeichnet als MH193-16F4-Stamm, in einem
Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, zwei
Antibiotika, genannt Benanomicin A und Benanomicin B, in der
Kultur erzeugt und akkumuliert werden. Benanomicin A und
Benanomicin B sowie Salze davon haben in vivo starke
antifungale Wirkung und Benanomicine A und B haben die allgemeine
Formel (I):
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wobei R eine Hydroxygruppe für Benanomicin A bedeutet und R
eine Aminogruppe für Benanomicin B bedeutet.
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Benanomicin A und Benanomicin B sowie Salze davon
werden in "Journal of Antibiotics", Band 41, Seite 807 (Juni
1988) beschrieben und in der Beschreibung unserer
gleichzeitig anhängigen Japanischen Patentanmeldung Nr. 277 692/87,
eingereicht am 2. November 1987 (nun offengelegt als
Japanische Patentanmeldung, erste Veröffentlichung "Kokai" Nr.
121293/89 am 12. Mai 1989) und in der Beschreibung der
entsprechenden US-Patentanmeldung SN 264 888 (eingereicht am 31.
Oktober 1988) oder der entsprechenden Europäischen
Patentanmeldung Nr. 88-118 253.9, eingereicht am 2. November 1988
(nun offengelegt unter Europäischer Patentanmeldung
Veröffentlichungsnummer 0 315 147 A2 am 10. Mai 1989) beschrieben.
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Benanomicin A ist eine saure Substanz in Form eines
rötlich-braunen Pulvers, das einen Schmelzpunkt höher als
220ºC aufweist und nur schwach in Methanol, Chloroform,
Essigsäureethylester und Aceton löslich ist, jedoch in
Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und alkalischem Wasser löslich
ist und in Wasser unlöslich ist. Benanomicin B ist eine
amphotere Substanz und Benanomicin B-Hydrochlorid liegt in Form
eines rötlich-braunen Pulvers vor, das einen Schmelzpunkt
höher als 220ºC und eine spezifische Drehung [α]D&sub2;&sub2; + 360º (c
0,05 Wasser) aufweist und in Chloroform, Essigsäureethylester
und Aceton nur schlecht löslich ist, und in Methanol,
Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Wasser löslich ist.
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Wir haben nun gefunden, daß Benanomicin A und Salze
davon eine höhere inhibitorische Aktivität gegen die
Infektion von Human-T-Zellen mit HIV zeigen und daß sie,
insbesondere wenn Human-T-Zellen, die mit Benanomicin A oder einem Salz
davon behandelt wurden, in einem Kulturmedium mit HIV in
Kontakt gebracht wurden, die Infektion von Human-T-Zellen mit
HIV unter der Wirkung von Benanomicin A oder einem Salz davon
inhibieren können.
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Wir haben ebenfalls gefunden, daß Syncytiumbildung
von menschlichen T-Zellen durch gleichzeitige Züchtung von
menschlichen T-Zellen mit HIV-infizierten T-Zellen durch die
Behandlung mit Benanomicin A und Salzen davon stark
verhindert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß
Benanomicin A die Adsorption von HIV an die T-Zellen in früheren
Stadien der HIV-Infektion verhindert. Benanomicin A weist
gegen Candida, Cryptococcus oder Aspergillus antifungale
Aktivitäten auf. Diese Pilze wurden häufig bei Patienten mit AIDS
gefunden. Wenn weitere Analysen zeigen, daß Benanomicin A als
ein antivirales Mittel für AIDS verwendet werden kann, kann
somit dessen Verabreichung an Patienten mit AIDS oder
AIDS
verwandtem Komplex, die mit Pilzen infiziert sind oder ein
Risiko für Pilzinfektion tragen, besonders vorteilhaft sein.
In diesem Sinne weisen Benanomicin A und Salze davon eine
Aktivität auf, um die Infektion von menschlichen T-Zellen mit
HIV zu verhindern, und weisen in einem breitem Sinne eine
antivirale Aktivität gegen HIV auf.
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Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird deshalb
eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung der
Infektion mit einem ein erworbenes menschliches
Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus bereitgestellt, das als
Wirkstoff mindestens eines von Benanomicin A mit der allgemeinen
Formel (I) umfaßt
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worin R eine Hydroxylgruppe ist, und Salze davon in
Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den
Wirkstoff.
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In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine
antivirale Zusammensetzung zur Verhinderung von
Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch einen ein
erworbenes menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus
induziert werden, bereitgestellt, das eine wirksame Menge
mindestens eines von Benanomicin und pharmazeutisch
annehmbaren Salzen davon als Wirkstoff in Verbindung mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger für den Wirkstoff umfaßt.
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In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung ein
Verfahren zur Verhinderung einer Infektion von menschlichen
T-Zellen mit einem ein erworbenes menschliches
Immundefizienzsyndrom verursachendes Virus ein, das Behandeln von
menschlichen T-Zellen mit Benanomicin A oder einem
pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in einer Menge, die zur
Verhinderung der Infektion mit dem Virus wirksam ist, umfaßt.
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In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung
außerdem ein Verfahren zur Inhibierung von Syncytiumbildung von
menschlichen T-Zellen, die durch einen ein erworbenes
menschliches Immundefizienzsyndrom verursachenden Virus induziert
werden, das Behandeln der menschlichen T-Zellen mit
Benanomicin A oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in
einer Menge, die wirksam ist, die Syncytiumbildung von
menschlichen T-Zellen, die durch das Virus induziert werden,
ein.
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Die Erfindung schließt weiterhin die Verwendung von
Benanomicin A oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz
davon bei der Herstellung einer antiviralen pharmazeutischen
Zusammensetzung gegen ein ein erworbenes menschliches
Immundefizienzsyndrom verursachendes Virus ein.
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Benanomicin A, das erfindungsgemäß als Wirkstoff
verwendbar ist, ist eine saure Verbindung, die eine
Carboxylgruppe enthält, so daß Benanomicin A durch Umsetzung mit
einer basischen Verbindung verschiedene Salze an seiner
Carboxylgruppe bilden kann. Die Salze, die Benanomicin A an
seiner Carboxylgruppe bilden kann, schließen ein pharmazeutisch
annehmbares Salz (das Carboxylat), wie ein Alkalimetallsalz,
beispielsweise Natriumsalz, und ein Erdalkalimetallsalz,
beispielsweise Calciumsalz, sowie ein Basenadditionssalz (an der
Carboxylgruppe) mit einem pharmazeutisch annehmbaren
organischen Amin, wie Niederalkylaminen, ein.
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Benanomicin A ist durch niedrige Toxizität für
Säugetiere gekennzeichnet. Beispielsweise wurde in den Tests zum
Abschätzen der akuten Toxizität, wobei Mäusen intravenös
Benanomicin A verabreicht wurde, gefunden, daß eine Dosierung
von 600 mg/kg Benanomicin nicht letal war.
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Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die entweder Benanomicin A oder ein Salz davon als
Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren
festen oder flüssigen Träger für den Wirkstoff enthalten,
können in üblicher Weise zu üblichen Formen von medizinischer
Zubereitung, wie Pulver, Granulate, Tabletten, Sirupe,
Injektionen und dergleichen, zur oralen Verabreichung oder
parenteralen Verabreichung formuliert werden.
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Die nachstehenden Assaytests wurden durchgeführt, um
zu zeigen, daß Benanomicin A eine inhibitorische Aktivität
auf die Infektion von menschlichen T-Zellen mit HIV, nämlich
dem erworbenen menschlichen Immundefizienzsyndrom, aufweist.
Das Verfahren für diese Assaytests ist wie nachstehend:
Tests:
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Wirkungen von Benanomicin A, die für die Infektion
von menschlichen T-Zellen mit HIV verhindernd sind, wurden in
ähnlicher Weise wie zu den in "Proc. Natl. Acad., Sci. USA",
80, 6061-6065 (1983); "J. Antibiot.", 40, 1077-1078, (1987);
und "J. Antibiot.", 42, 344-346, (1989), beschriebenen
Assayverfahren geprüft.
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Etwa 1 · 105 Zellen/ml von MT-4-Zellen (menschliche
T-Zellinie) in Phosphat-gepufferter Salzlösung wurden in
Costar Titerplatten mit 48 Vertiefungen in einer Menge von 0,5
ml/Vertiefung geimpft. Zu jeder Vertiefung wurden 50 ul
Benanomicin A-Lösung (gelöst mit einer Konzentration von 10
mg/ml in Dimethylsulfoxid und verdünnt mit
Phosphatgepufferter Salzlösung) gegeben. Zwei Stunden später wurden
MT-4-Zellen mit 50 ul HIV (1000-10000 plaquebildende
Einheiten) in jeder Vertiefung infiziert. Die Platten wurden 4 Tage
bei 37ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert. Die MT-4-Zellen wurden auf
Objektträgergläsern ausgestrichen, getrocknet und mit Aceton
fixiert. Die Anwesenheit von HIV-Antigen-positiven Zellen
wurde durch das indirekte Immunofluoreszenz-Assay [Y. Hinuma
et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA," 78, 6476-6480, (1981)]
untersucht. Zellausstriche wurden bei 37ºC 30 Minuten mit dem
Serum eines AIDS-Patienten bei einer Verdünnung von 1 : 10 in
Phosphat-gepufferter Salzlösung als erstem Antikörper
behandelt. Nach Waschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung wurden
die Zellen bei 37ºC 30 Minuten mit fluoreszierendem
Isothiocyanat-konjugiertem
Kaninchen-Antihuman-Immunoglobulinserum (Cappel Laboratories, Cochranville, PA, USA) als
zweitem Antikörper behandelt. Nachdem die Zellausstriche mit
Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen wurden und mit
einem Deckglas bedeckt wurden, wurden die Zellen unter einem
Fluoreszenzmikroskop geprüft. Die Prozentsätze der Anzahl an
viralen Antigen-positiven Zellen (nämlich
Immunofluoreszenzzellen, worin die HIV-assoziierten Antigene exprimiert
wurden) auf die gesamten Zellen wurden berechnet.
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Des weiteren wurde die Cytotoxizität von Benanomicin
A gegen die MT-4-Zellen durch Inkubieren der MT-4-Zellen mit
variierenden Konzentrationen an zugegebenem Benanomicin A und
in Abwesenheit von HIV, jedoch in der gleichen Weise der
Inkubation und unter den gleichen Inkubationsbedingungen von
MT-4-Zellen, wie jene die in den vorstehend erwähnten
Testverfahren zur Bewertung der Aktivität von Benanomicin A für
die Inhibierung der Infektion von T-Zellen mit HIV angewendet
wurden, geschätzt.
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Die Ergebnisse der vorstehenden Tests der Bewertung
der inhibitorischen Aktivitäten von Benanomicin A auf die
HIV-Infektion sowie die Tests der Schätzung von Toxizitäten
dieser Benanomicine werden in einer nachstehenden Tabelle
gezeigt.
Tabelle
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Wie aus den Testergebnissen der vorstehenden Tabelle
deutlich wird, wurde bestätigt, daß Benanomicin A bei einer
Konzentration von 10 ug/ml frei von Toxizität ist und die
Anzahl von viralen Antigen-positiven Zellen signifikant
vermindern kann. Folglich wurde bestätigt, daß Benanomicin A bei
der Verhinderung einer Infektion von menschlichen T-Zellen
mit HIV hochwirksam ist.
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Inhibitorische Wirkungen von Benanomicin A auf die
Syncytiumbildung von menschlichen T-Zellen, die durch HIV
eingeleitet wurde, wurden in der gleichen Weise wie in "J.
Antibiot.", 42, 344-346 (1989) gemäß dem nachstehenden
Verfahren geprüft:
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Die Molt-4-Human-T-Zellen wurden in Costar
Titerplatten mit 48 Vertiefungen in einer Menge von 100000
Zellen/Vertiefung inokuliert. Benanomicin A oder B Lösung wurde
zugegeben. Nach 2 Stunden wurden Molt-4-Zellen, die mit HIV
persistent infiziert wurden, bei 15000 Zellen/Vertiefung
zugegeben. Die Zahl der Syncytia oder multinukleierten
Riesenzellen, die in 5 · 5 mm Raum in j eder Vertiefung nach
Züchtung für 24 Stunden gebildet wurde, wurde unter einem
Mikroskop gezählt. Zellen, deren Durchmesser ungefähr 5-fach oder
größer war, wie jener der Molt-4-Zellen, die nicht
gleichzeitig mit HIV erzeugenden Molt-4-Zellen gezüchtet wurden,
wurden als Syncytia angesehen.
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Benanomicin A inhibierte die Syncytiumbildung der T-
Zellen bei Konzentrationen von 10-100 ug/ml.
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Im allgemeinen kann Benanomicin A entweder oral oder
parenteral in Abhängigkeit von seiner genauen Verabreichung
in Form einer antiviralen Zusammensetzung zur Verhinderung
der Infektion mit HIV verabreicht werden.
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Wenn die erfindungsgemäß verwendete
Wirkstoffverbindung, nämlich Benanomicin A oder ein Salz davon, als das
antivirale Mittel gegen HIV gegeben wird, kann es einzeln
verabreicht werden oder es kann in Form einer Injektion, oralen
Zubereitung, Suppositorium oder dergleichen, das einen
Exzipienten oder Träger damit vermischt enthält, verabreicht
werden. Jeder pharmazeutisch annehmbare Exzipient und Träger ist
für jenen Zweck verfügbar. Die Art und Zusammensetzung des
verwendeten Trägers kann in Abhängigkeit von
Verabreichungsweg und -art schwanken. Beispielsweise können Wasser,
Ethanol, ein tierisches oder pflanzliches Öl, wie Sojabohnenöl,
Sesamöl oder Mineralöl, oder ein synthetisches Öl als
flüssiger Träger verwendet werden. Geeignete feste Träger schließen
beispielsweise einen Zucker, wie Maltose oder Saccharose,
eine Aminosäure, ein Cellulosederivat, wie
Hydroxypropylcellulose, ein Polysaccharid, wie Cyclodextrin, ein Salz einer
organischen Säure, wie Magnesiumstearat oder dergleichen, ein.
Im Fall der Injektionen ist es im allgemeinen bevorzugt, daß
das flüssige Medium zur Injektion physiologische Salzlösung,
eine gepufferte Lösung, eine wässerige Lösung eines Zuckers,
wie Glucose, Inosit oder Mannit, oder ein Glycol, wie
Ethylenglycol oder Polyethylenglycol, umfaßt. Es ist auch
möglich, eine lyophilisierte Zubereitung, die ein Benanomicin
als Wirkstoff enthält, vermischt zusammen mit einem
Exzipienten, beispielsweise einem Zucker, wie Inosit, Mannit,
Glucose, Mannose, Maltose oder Saccharose oder eine Aminosäure,
wie Phenylalanin, zu formulieren. Bei der Verabreichung kann
solche lyophilisierte Zubereitung in einem geeigneten
Lösungsmittel zur Injektion, beispielsweise sterilisiertem
Wasser, oder einer intravenös verabreichbaren Flüssigkeit, wie
physiologischer Salzlösung, wässeriger Lösung von Glucose,
einer wässerigen Lösung von Elektrolyten oder eine wässerige
Lösung von Aminosäuren gelöst werden.
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Obwohl der Anteil an Benanomicin A, der in der
formulierten Zusammensetzung vorliegt, von einer Zubereitung zur
anderen Zubereitung stark schwanken kann, kann er im
allgemeinen in einem Bereich von 0,1-100 Gewichtsprozent,
vorzugsweise 1-90 Gewichtsprozent, liegen. Im Fall einer Injektion
ist es beispielsweise erwünscht, daß die injizierbare Lösung
die Verbindung als Wirkstoff in einer Konzentration von 0,1-5
Gewichtsprozent enthält. Zur oralen Verabreichung kann die
Verbindung als Wirkstoff in Tabletten, Kapseln, einem Pulver,
Granulaten in Kombination mit einem festen Träger formuliert
werden oder kann in eine Lösung, einen trockenen Sirup oder
dergleichen in Kombination mit dem flüssigen Träger
formuliert werden. In Kapseln, Tabletten, Granulaten oder einem
Pulver kann der Anteil von Benanomicin als der darin
vorliegende Wirkstoff im allgemeinen in einem Bereich von etwa 3-
100 Gewichtsprozent, vorzugsweise 5-90 Gewichtsprozent
liegen, wobei der Rest von einem Träger gebildet wird.
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Die Dosierung von Benanomicin A kann geeigneterweise
in Anbetracht des Alters, Körpergewichts, Symptoms von
Patienten und beabsichtigten therapeutischen Zwecks bestimmt
werden. Die therapeutische, d. h. wirksame Dosierung von
Benanomicin kann im allgemeinen in einem Bereich von 1-300
mg/kg/Tag für die parenterale Verabreichung und in einem
Bereich von 5-500 mg/kg/Tag zur oralen Verabreichung liegen.
Diese Dosierung kann entweder kontinuierlich oder
unterbrochen, solange die Gesamtdosis nicht einen bestimmten Spiegel
übersteigt, der im Hinblick auf Ergebnisse von Tiertests und
verschiedenen Umständen entschieden wurde, verabreicht
werden. Ähnlich kann die Gesamtdosierung, die in der
parenteralen Verabreichung gegeben wird, natürlich geeigneterweise in
Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, den Zuständen des
Patienten oder zu behandelnden Tiers, beispielsweise dem Alter,
Körpergewicht, Geschlecht, Empfindlichkeit, Nahrung oder
Fut
ter, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, gleichzeitig
verabreichten Arzneimitteln, Zuständen des Patienten und
Erkrankung schwanken. Die geeignete Dosierung und
Verabreichungshäufigkeit eines Benanomicins muß unter gegebenen Bedingungen
von einem Facharzt durch die Untersuchungen zur Bestimmung
der optimalen Dosierung und im Lichte der vorstehenden
Richtlinien bestimmt werden. Diese Erfordernisse zur Verabreichung
gelten ebenfalls für die orale Verabreichung eines
Benanomicins.
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Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die
nachstehenden Beispiele erläutert, die verschiedene Zubereitungsformen
oder erfindungsgemäße Zusammensetzungen zeigen.
Beispiel 1
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Eine Menge von gereinigtem Wasser wurde zu 50
Gewichtsteilen Natriumsalz (das Carboxylat) von Benanomicin A
gegeben, um insgesamt 2000 Gewichtsteile zu ergeben. Nach
Auflösung des Natriumsalzes in Wasser wurde die so
hergestellte Lösung mittels Durchleiten durch ein mikroporöses
Filter mit einem Handelsnamen "Millipore Filter GS"
Sterilisationsfiltration unterzogen. Zwei Gramm des erhaltenen
sterilen Filtrats wurden in jeweils 10 ml-Fläschchen gegeben und
anschließend unter Gewinnung einer lyophilisierten
Zubereitung zur Injektion, die 50 mg Natriumsalz von Benanomicin A
pro Fläschchen enthielt, lyophilisiert.
Beispiel 2
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Fünfzig Gewichtsteile Benanomicin A, 600
Gewichtsteile Lactose, 330 Gewichtsteile kristalline Cellulose und 20
Gewichtsteile Hydroxypropylcellulose wurden sorgfältig
miteinander vermischt. Das sich ergebende pulverförmige Gemisch
wurde mit einer Preßmaschine vom Walzentyp (Roller Compactor,
Handelsmarke) unter Druck gesetzt und anschließend wurden die
sich ergebenden verdichteten Feststoffe zerkleinert. Das so
zerkleinerte Material wurde gesiebt, die Fraktion der
erhal
tenen Granulate, die Größen zwischen 16 mesh und 60 mesh
enthielt, wurde als granuläre Zubereitung gesammelt.
Beispiel 3
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Dreißig Gewichtsteile Benanomicin A, 120
Gewichtsteile kristalline Lactose, 147 Gewichtsteile kristalline
Cellulose und 3 Gewichtsteile Magnesiumstearat wurden in einem V-
Modell-Mischer zusammen vermischt und in Tabletten, die
jeweils 300 mg Benanomicin A als Wirkstoff pro Tablette
enthielten, verpreßt.
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Da Benanomicin A durch Züchtung eines neuen
Mikroorganismus MH193-16F4-Stamm hergestellt wurde, wird die
fermentative Erzeugung dieses Antibiotikums hier anschließend
beschrieben.
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Die Herstellung von Benanomicin A kann durch
Inokulieren des MH193-16F4-Stamms von Actinomycetes zu einem
Kulturmedium, das Nährstoffquellen enthält, das von gewöhnlichen
Mikroorganismen genutzt werden kann, und anschließend
Inkubieren des Benanomicin erzeugenden Stamms unter aeroben
Bedingungen ausgeführt werden. Benanomicine A und B werden
erzeugt und hauptsächlich in der Kulturbrühe akkumuliert.
Benanomicine A und B können aus der sich ergebenden Kultur,
insbesondere aus der Kulturbrühe oder dessen Filtrat gewonnen
werden.
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Die Nährstoffquellen, die in dem zu verwendenden
Kulturmedium erhältlich sind, können jede der üblichen
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, die als Nährstoffquellen
für die Züchtung von bekannten Stämmen von Actinomycetes
verwendbar sind. Beispielsweise können die assimilierbaren
Stickstoffquellen Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt,
Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Trockenhefe,
Hefeextrakt, NZ-Amin, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat
und Ammoniumnitrat, die kommerziell erhältlich sind,
einschließen. Die assimilierbaren Kohlenstoffquellen können
Glycerin, Saccharose, Stärke, Glucose, Galactose, Maltose,
Dextrin, Lactose, Melassen, Sojabohnenöl, Fette und Aminosäuren,
die kommerziell erhältlich sind, einschließen. Das
Kulturmedium kann ebenfalls anorganische Salze, wie Natriumchlorid,
Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Cobaltchlorid
und Manganchlorid enthalten. Zusätzlich können ebenfalls
Spurenmengen von Metallsalzen und ein oder mehrere tierische,
pflanzliche oder Mineralöle als Antischäumungsmittel
zugegeben werden.
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Ein flüssiges Züchtungsverfahren ist für die
Erzeugung von Benanomicinen A und B in großem Maßstab bevorzugt.
Die Züchtungstemperatur kann innerhalb des Bereichs von
Temperaturen, bei denen Benanomicin erzeugende Mikroorganismen
wachsen und Benanomicine A und B erzeugen können, ausgewählt
werden. Die Züchtungstemperatur kann im allgemeinen bei 20-
40ºC, vorzugsweise bei 25-37ºC, liegen.
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Zur Gewinnung von Benanomicinen A und B aus der sich
ergebenden Kultur von Mikroorganismen, die Benanomicine A und
B erzeugen können, können Benanomicine A und B aus der Kultur
oder dem Kulturbrühenfiltrat extrahiert werden und dann unter
Verwendung von üblichen Verfahren zur. Gewinnung und
Reinigung, beispielsweise Lösungsmittelextraktion,
Ionenaustauschharzverfahren, adsorptive oder teilweise
Säulenchromatographie, Gelfiltration, Dialyse, Ausfällung und dergleichen
entweder einzeln oder in Kombination gereinigt werden.
Beispielsweise können Benanomicine A und B aus dem inkubierten
mycelialen Kuchen durch Extrahieren mit Aceton-Wasser oder
Methanol-Wasser gewonnen werden. Andererseits können
Benanomicine A und B, die in der Kulturbrühe oder dem Filtrat
erzeugt und akkumuliert wurden, an einem Adsorptionsmittel, wie
ein mikroporöses, nicht-ionisches, harzartiges
Adsorptionsmittel, beispielsweise "DIAION HP-20" (Handelsname,
synthetisches, harzartiges Adsorptionsmittel, hergestellt von
Mitsubishi Kasei Corporation, Japan), adsorbiert werden. Wenn
zusätzlich die Kulturbrühe oder das Brühenfiltrat mit einem
organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist,
beispielsweise Butanol, Essigsäureethylester oder
derglei
chen, extrahiert wird, werden Benanomicin A und B-Substanzen
in die organische Lösungsmittelphase extrahiert.
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Für die Erzeugung von Benanomicinen A und B ist es
bevorzugt, daß der MH193-16F4-Stamm in einem Kulturmedium
unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37ºC
vorzugsweise 3 bis 10 Tage gezüchtet wird, um Benanomicin A
und Benanomicin B in der erhaltenen Kulturbrühe herzustellen
und zu akkumulieren, die Kulturbrühe wird filtriert und das
erhaltene Kulturbrühenfiltrat wird durch eine Säule eines
Adsorptionsmittels geleitet, um die Adsorption von Benanomicin
A und Benanomicin B durch das Adsorptionsmittel zu bewirken,
und Benanomicin A und Benanomicin B werden durch
chromatographisches Eluieren der Säule mit Adsorptionsmittel, an das
Benanomicine A und B adsorbiert sind, aufgetrennt.
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Die gegenseitige Isolierung und weitere Reinigung von
Benanomicinen A und B, das chromatographische Verfahren mit
der Verwendung eines Adsorptionsmittels, wie Kieselgel
("WAKOGEL C-300", Handelsname, Produkt von Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.) und Aluminiumoxid oder ein
Gelfiltrationsmittel "Sephadex LH-20" (Handelsname; Produkt von Pharmacia
AB) oder dergleichen können geeignet sein.
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Benanomicine A und B, wie vorstehend beschrieben in
der Kultur erzeugt, können als Benanomicine A und B als
solche in deren freien Form isoliert werden.
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Der Stamm MH193-16F4 wurde bei einer zugelassenen
Japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research
Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of
International Trade and Industry, Japanese Government unter
der Hinterlegungsnummer FERM P-9529 seit dem 21. August 1987
hinterlegt. Der Stamm MH193-16F4 wurde nun in dem
"Fermentation Research Institute" bezüglich des Budapester Vertrags
unter der Hinterlegungsnummer "FERM BP-2051" hinterlegt.
Diese japanische Hinterlegungsstelle befindet sich in Tsukuba-
City, Ibaragi-ken, Japan.
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Wenn eine Benanomicine A oder dessen konzentrierte
Lösung enthaltende Lösung mit einer basischen Verbindung,
beispielsweise einer anorganischen Base, einschließlich einer
Alkalimetallverbindung, wie Natriumhydroxid oder
Kaliumhydroxid, einer Erdalkalimetallverbindung, wie Calciumhydroxid
oder Magnesiumhydroxid, und einem Ammoniumsalz sowie einer
organischen Base, wie Ethanolamin, Triethylamin oder
Dicyclohexylamin, während des Verlaufs von einem der Schritte zur
Gewinnung, beispielsweise während der Extraktion, Isolierung
oder Reinigung, behandelt wird, kommt es vor, daß Benanomicin
A zu den entsprechenden Salzen, die dann in Form solcher
Salze oder Salz abgetrennt oder isoliert werden können,
umgewandelt wird.
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Die nachstehenden Beispiele 4-5 erläutern die
fermentative Erzeugung von Benanomicin A.
Beispiel 4
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Die Menge einer gefüllten Schlaufe von MH193-16F4-
Stamm (identifiziert als FERM BP-2051), die in einem
Schrägagarmedium inkubiert wurde, wurde in 80 ml eines flüssigen
Kulturmediums, umfassend 1,0% Stärke und 3,0% Sojabohnenmehl
(pH 7,0 vor der Sterilisation), das gesondert in einem
Sakaguchi-Kolben mit 500 ml Fassungsvermögen angeordnet wurde,
inokuliert. Das inokulierte Kulturmedium wurde 3 Tage unter
Rotationsschütteln (135 U/min) bei 28ºC 3 Tage unter
Bereitstellung einer ersten Impfkultur inkubiert. Die erhaltene
erste Impfkultur wurde in 3 ml-Portionen in 80 ml Portionen des
flüssigen Kulturmediums mit der gleichen wie vorstehend
beschriebenen Zusammensetzung, die getrennt in vielen
Sakaguchi-Kolben angeordnet wurden, inokuliert. Die inokulierten
Kulturmedien wurden 3 Tage unter den gleichen wie vorstehend
beschriebenen Inkubationsbedingungen inkubiert, um die zweite
Impfkultur zu ergeben. Die sich ergebende zweite Impfkultur
(2 Liter) wurde dann zu einem Kulturmedium (50 Liter) der
gleichen Zusammensetzung wie vorstehend, die bei 120ºC 15
Minuten sterilisiert wurde und in einem Behälterfermenter mit
100 l Fassungsvermögen angeordnet wurde, inokuliert. Das so
inokulierte Kulturmedium wurde dann 2 Tage bei 28ºC unter
Be
lüftung mit einer Geschwindigkeit von 50 l Luft pro Minute
und unter Rühren bei 200 U/min gezüchtet, um submerse
Züchtung des MH193-16F4-Stamms unter aeroben Bedingungen zu
bewirken und eine dritte Impfkultur zu erhalten. Die erhaltene
dritte Impfkultur (12 Liter) wurde in ein produktives
Kulturmedium (300 Liter), umfassend 2,0% Glycerin, 1,5%
Sojabohnenmehl (kommerziell unter einem Handelsnamen "Esusan Meat"
erhältlich, ein Produkt von Ajinomoto Co. Ltd., Japan), 0,0025%
K&sub2;HPO&sub4;, 0,1125% KH&sub2;PO&sub4;, 0,005% CoCl&sub2;6H&sub2;O, 0,03% Silikonöl
"KM72" (ein Antischäumungsmittel, ein Handelsname eines
Produkts von Shinetsu Chemicals Co., Ltd., Japan) und 0,01%
eines Tensids "Adekanol" (ein Handelsname, Produkt von Asahi
Denka Kogyo Co. Ltd., Japan), das vorher bei 125ºC 30 Minuten
sterilisiert wurde und in einem Behälterfermenter mit 570 l
Fassungsvermögen angeordnet wurde, inokuliert.
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Die Züchtung erfolgte 7 Tage unter Rühren bei 300
U/min bei 28ºC und unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit
von 150 l Luft pro Minute für die ersten 24 Stunden der
Züchtung und anschließend mit einer Geschwindigkeit von 300 l
Luft pro Minute nach der 24-stündigen Züchtung. Nachdem die
Züchtung vollständig war, wurde die erhaltene Kulturbrühe mit
Diatomeenerde als Filtrierhilfe vermischt und dann filtriert
unter Gewinnung von 250 l des Kulturbrühenfiltrats (pH 6,0).
Beispiel 5
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Das in dem vorstehenden Beispiel 4 erhaltene
Kulturbrühenfiltrat (250 l) wurde durch eine Säule von 15 l eines
mikroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharzes "DIAION HP-
20" geleitet unter Bewirkung von Adsorption der aktiven
Substanzen durch das Adsorptionsmittel. Nachdem die
Adsorptionsmittelsäule mit 100 l Wasser und mit 45 l 50%igem wässerigen
Methanol gewaschen wurde, wurde die Adsorptionsmittelsäule
mit 45 l 70%igem Methanol und anschließend mit 90 l trockenem
Methanol eluiert, so daß die erste Fraktion (53 l), zweite
Fraktion (38 l) und dritte Fraktion (27 l) des
Elutionsmittels getrennt erhalten wurden. Die erste Fraktion, die die
aktive Substanz enthielt, wurde unter vermindertem Druck auf
3 l konzentriert, gefolgt von Einstellung auf pH 3,5 mit
verdünnter Salzsäure unter Abscheidung eines Niederschlags von
roter Farbe. Der Niederschlag wurde durch Filtration
gesammelt und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet,
wobei 152 g eines rohen braunen Pulvers, das hauptsächlich
Benanomicin A umfaßte, erhalten wurde.
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150 Gramm des ungereinigten Pulvers wurden in 600 ml
Dimethylformamid gelöst. Nach Sättigung der erhaltenen Lösung
mit Wasserdampf bei Raumtemperatur für 3 Tage in einem
Exsickator wurde ein kristalliner Niederschlag abgeschieden. Der
Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und dann unter
vermindertem Druck getrocknet unter Gewinnen von 29 g
Benanomicin A-Dimethylformamid-Solvat. Die zweite Fraktion des
Elutionsmittels wurde auf die gleiche Weise wie die erste
Fraktion verarbeitet, wodurch 14 g Benanomicin
A-Dimethylformamid-Solvat erhalten werden.
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Ein Gramm des erhaltenen Benanomicin
A-Dimethylformamid-SoTvats aus der ersten Fraktion wurde in
Dimethylsulfoxid (5 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise
unter Rühren in 300 ml Methanol gegeben, gefolgt von Rühren
für 10 Minuten unter Abscheiden eines Niederschlags von
rötlich-brauner Farbe. Der Niederschlag wurde ausfiltriert und
dann unter vermindertem Druck getrocknet unter Bereitstellung
von 935 mg eines gereinigten Benanomicin A als
rötlichbraunes Pulver.
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Eine Lösung von Benanomicin A (82,7 mg) in einem
Gemisch von 10 ml Wasser und 1,1 ml 0,1M NaOH wurde
lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 3 ml Methanol gelöst und an
einer Sephadex LH-20 Säule (300 ml), entwickelt mit Methanol,
chromatographiert unter Gewinnung von Benanomicin A
Natriumsalz (75,8 mg).