KR0173972B1 - 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 저해제 - Google Patents

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Description

인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 저해제

본 발명은 유효성분으로서 베나노마이신 A의 염을 갖는 인체 후천성 면역 부전증후군 바이러스 감염 저해제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 저해에 유용한 유효성분으로 베나노마이신 A는 이의 염을 갖는 항바이러스제를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 베나노마이신 A의 염으로 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염을 저해 치료하는 방법에 관한 것이다.

인체 후천성 면역부전증후군(이후 에이즈라 한다)은 인체 혈액에서 바이러스에 의하여 감염되는 인체 T-세포로 인하여 일어나는 질환으로 알려져 있다. 인체 후천성 면역부전증후군을 일으키는 바이러스는 통상 HIV로 약칭되는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스를 뜻한다. 몇몇 공지 화합물이 HIV 비활성화제 또는 HIV에 대한 항바이러스제로서 유용하다는 것이 보고되었다. 그러나, 이들 화합물은 유용한 에이즈 치료제로서는 만족스럽지 못했다.

에이즈는 인간사회에서 심각한 문제를 가져오는 질환이고, 따라서 HIV 감염저해에 대하여 높은 활성을 나타낼 수 있고 에이즈 환자를 치료 또는 예방치료할 수 있는 유용한 약제인 새로운 약제를 개발 제공하는 것이 강력히 요구되고 있다.

또한, 본 발명자는 MH 193-16F4 균주로 표시되는 악티노마이세트의 균주를 호기성 조건하에 배지에서 배양하였을 때, 베나노마이신 A와 베나노마이신 B로 명명되는 두 항생물질이 배양물에서 생성됨을 알았다. 베나노마이신 A와 베나노마이신 B 및 이들의 염은 생체내에서 강한 하윤성을 나타냄을 알았으며, 베나노마이신 A와B는 다음 일반식(I)로 표시되는 구조식을 가짐을 알았다.

(상기식에서 베나노마이신 A의 경우 R은 수산기이다)

베나노마이신 A와 베나노마이신 B 및 이들의 염은 Journal of Antibiotics41권, P 807 (1988. 6.)과 1987. 11. 2자 출원된 일본특허 제277,692/87호의 명세서(1989. 5. 12자 일본특허출원공개 제121293/89호로 공개)와 이 출원에 해당하는 미국특허출원 SN. 264,888(1988. 10. 31자 출원)의 명세서 또는 1988. 11. 2자 출원한 상기 출원에 해당하는 유럽특허출원 제88-118,253,9호(1989. 5. 10자 유럽 특허출원공보 제0 315 147 A2호로 공개)의 명세서에 서술되어 있다.

베나노마이신 A는 220℃ 이상의 융점을 갖고 메탄올, 클로로포름, 초산에틸과 아세톤에는 겨우 용해하나 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드와 알카리성물에 용해하고 물에 불용인 적갈색 분말형태의 산성물질이다. 베나노마이신 B는 양성 물질이고, 베나노마이신 B 염산염은 220℃ 이상의 융점 고유광회전도 [α]²²+360°(c 0.05, 물)을 갖고 클로로포름, 초산에틸과 아세톤에만 겨우 용해하고 메탄올, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드와 물에 용해하는 적갈색 분말 형태이다.

본 발명자는 베나노마이신 A, 베나노마이신 B와 이들의 염이 HIV로 감연된 인체 T-세포에 대하여 높은 저해성을 나타내고, 특히 배지에서 베나노마이신 A, 베나노마이신 B 또는 이들의 염으로 처리된 인체 T-세포를 HIV와 접촉시켰을 때, HIV로 감염된 인체 T-세포는 베나노마이신 A나 베나노마이신 B 또는 이들의 염의 작용으로 저해될 수 있음을 알았다.

또한, 인체 T-세포와 HIV-감염된 T-세포를 함께 배양함에 의한 인체 T-세포의 신시티움 형성은 베나노마이신 A와 B 및 이들의 염과의 처리로 강하게 저해됨을 알 수 있다.

이러한 결과는 베나노마이신 A와 B가 HIV-감염의 초기단계의 T-세포로 HIV의 흡수를 저해하는 것으로 생각된다. 베나노마이신 A와 B는 칸디아, 크립토코쿠스 또는 아스퍼길러스에 대하여 항균성을 갖는다. 이러한 균은 에이즈 환자에게 자주 검출되어 왔다. 따라서, 베나노마이신이 에이즈용 항바이러스제로서 유용함을 더 분석해 보면, 균에 감염되거나 균 감염 위험에 있는 에이즈 또는 에이즈-관련 합병증 환자에 이를 투약하면 특히 유효하다.

이러한 의미에서, 베나노마이신A와 B 및 이들의 염은 HIV로 감연된 인체 T-세포를 저해하는 활성을 가지며, 넓은 의미에서 HIV에 대하여 항바이러스성을 갖는다.

그러므로, 본 발명의 첫 번째 특징에 의하면, 다음 일반식(I)의 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B나 이들의 염의 최소한 하나를 유효성분으로 함유하고 제약적으로 허용될 수 있는 유효성분용 담체를 배합하여 이루어지는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 저해제를 제공한다.

(상기식에서 베나노마이신 A의 경우 R은 수산기이다)

본 발명의 다른 특징에서, 유효성분으로 최소한 하나의 베나노마이신A와 제약적으로 허용될 수 있는 이의 염의 유효량과 제약적으로 허용될 수 있는 유효성분용 담체를 배합하여 이루어진, 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스에 의하여 유도된 인체 T-세포의 신시티움 형성을 저해하는 항바이러스제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징에서, 바이러스 감염을 저해하는데 유효한 양의 베나노마이신 A, 베나노마이신 B또는 제약적으로 허용될 수 있는 이들의 염으로 인체 T-세포를 치료하는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 인체 T-세포를 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 더욱 다른 특징에서, 바이러스에 의하여 유도된 인체 T-세포의 신시티움 형성을 억제하는데 유효한 양의 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B나 제약적으로 허용될 수 있는 이들의 염으로 인체 T-세포를 치료하는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스에 의하여 유도된 인체 T-세포의 신시티움 형성을 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스에 대한 항바이러스제로서 베나노마이신 A, 베나노마이신 B 또는 제약적으로 허용될 수 있는 이들의 염의 용도를 더 포함한다.

본 발명에서, 유효성분으로서 유용한 베나노마이신A는 카르복실기를 함유하는 산성 화합물이므로, 베나노마이신 A는 염기성 화합물과 반응하여 이의 카르복실기에서 여러 가지 염이 형성할 수 있다. 또한 본 발명에서 다른 유효성분으로 유용한 베나노마이신 B는 카르복실기 아미노기를 함유하는 양성 화합물이므로, 베나노마이신 B는 염기성 화합물과 반응하여 이의 카르복실기에서 여러 가지 염을 형성할 수 있고 또한 산성 화합물과 반응하여 이의 아미노기에서 산부가염을 형성할 수 있다. 산성의 베나노마이신 A가 이의 카르복실기에서 형성할 수 있는 염들은 알카리 금속염, 예를들어 나트륨염과 알카리 토류금속염, 예를들어 칼슘염과 같은 제약적으로 허용될 수 있는 염(카르복실레이트) 및 저급알킬아민과 같은 제약적으로 허용될 수 있는 유기 아민과의 염기부가염(카르복실에서)을 포함한다. 양성의 베나노마이신B가 이의 카르복실기 또는 이의 아미노기에서 형성할 수 있는 염은 알카리 금속염과 알카리 토류금속염과 같은 제약적으로 허용될 수 있는 염(카르복실레이트) 및 제약적으로 허용될 수 있는 유기 아민과의 염기 부가염(카르복실기에서)을 포함하고 또한 염산과 같은 제약적으로 허용될 수 있는 무기산 또는 초산, 말산등과 같은 제약적으로 허용될 수 있는 유기산과의 산부가염(아미노기에서)을 포함한다.

베나노마이신 A와 베나노마이신 B는 둘다 포유동물에 대하여 저독성인 것이 특징적이다. 예를들면, 쥐의 정맥내에 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B를 투여한 베나노마이신의 급성 독성을 평가하는 시험에서, 베나노마이신의 투여를 받은 쥐는 600㎎/㎏의 베나노마이신 A의 투여량 또는 100㎎/㎏의 베나노마이신 B의 투여량으로 사망예는 없었다.

베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B나 이들의 염을 유효성분으로 함유하고 제약적으로 허용될 수 있는 유효성분용 고체 또는 액체 담체와 배합된 본 발명의 저해제는 통상적인 방법으로 경구 또는 비경구 투여용으로 산제, 과립제, 정제, 시럽, 주사제 등과 같은 일반적 형태의 약제로 제조할 수 있다.

다음의 평가시험은 베나노마이신 A와 베나노마이신 B가 HIV로 감염된 인체 T-세포, 즉, 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스에 대하여 저해성을 갖는 것을 입증하기 위하여 실시했다.

이들 평가시험의 과정은 다음과 같다.

[시 험 예]

HIV로 감연된 인체 T-세포에 대한 베나노마이신 A와 베나노마이신 B의 효과는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6061-6065 (1983); J. Antibiot. 40, 1077-1078 (1987); J.Antibiot, 42, 344-346 (189)에 서술된 평가방법과 유사방법으로 시험했다.

포스페이트 완충염에서 약 1×10⁵세포/㎖의 MT-4 세포(인체 T-세포 일종)를 0.5 ㎖/구멍의 양으로 코스타르 48-구멍판에 넣는다. 각 구멍에 50㎍의 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B 용액(10 ㎎/㎖의 농도로 디메틸술폭시드에 용해되고 포스페이트 완충염으로 희석)을 가한다. 2시간 후, MT-4 세포는 각 구멍에서 50㎍의 HIV(1,000-10,000 플라크-형성단위)로 감염되었다. 판을 5% CO₂하에 37℃에서 4일 동안 배양한다.

MT-4 세포를 슬라이드 유리에 도포하고, 건조하고 아세톤으로 고정한다. HIV 항원 양성 세포의 존재는 간접 면역형광항체법으로 검출한다(Y. Hinuma 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6476-6480 (1981)). 도포된 세포를 첫 항체로서 포스페이트 완충염에서 1:10으로 희석한 에이즈 환자의 혈청으로 30분 동안 37℃에서 처리한다.

포스페이트 완충염으로 세척한 후, 두 번째 항체로서, 형광 이소티오시아 네이트-접합 토끼의 항-인체 면역글로불린 혈청(카펠 라보러토리스, 코크란빌래, PA, USA)으로 30분 동안 37℃에서 세포를 처리한다.

도포된 세포를 포스페이트 완충염으로 세척하고 커버 유리로 커버한 후, 세포를 형광 현미경으로 검사한다.

전체 세포에서 바이러스 항원-세포수의 퍼센트(즉, HIV-연관 항원으로 표시되는 면역 형광 세포)를 계산한다.

더욱이, MT-4 세포에 대한 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B의 세포독성은 HIV 없이 HIV로 감염된 T-세포를 저해하는 베나노마이신 A 또는 B의 활성을 평가하는 상술한 시험과정에 사용된 것과 동일한 MT-4 세포의 배양조건 하에 동일한 배양방법으로 가해진 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B의 농도의 변화에 따라 MT-4 세포를 배양하여 측정한다.

HIV-감염에 대한 베나노마이신 A와 베나노마이신 B의 저해성을 평가하는 상기 시험과 이들 베나노마이신의 세포독성을 측정한 시험의 결과는 다음 표에 표시했다.

상기 표의 시험결과에서 볼 수 있는 바와 같이 베나노마이신 A와 베나노마이신 B는 둘다 10 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성이 없고 바이러스 항원-양성 세포의 수를 현저하게 억제함을 알 수 있다. 따라서 베나노마이신 A와 베나노마이신 B는 둘다 HIV로 감염된 T-세포를 저해하는 높은 활성을 갖는 것이 확인되었다.

HIV에 의하여 유도된 인체 T-세포의 신시티움 형성에서 베나노마이신 A와 베나노마이신 B의 저해 작용은 다음 방법에 따라 J. Antibiot, 42, 344-346 (1989)에 서술된 것과 동일한 방법으로 시험했다.

몰트-4 인체 T-세포를 100,000 세포/구멍의 양으로 코스타트 48-구멍판에 넣은후, 베나노마이신 A 또는 B 용액을 가한다. 2시간 후, HIV로 확실하게 감염된 몰트-4 세포를 15,000 세포/구멍으로 가한다. 24시간 배양한 후 각 구멍에서 5×5㎜ 간격으로 형성된 신시티아 또는 다핵 거대세포의 수를 현미경으로 계산한다. 직경이 HIV-생성 몰트-4 세포와 함께 배양하지 않은 몰트-4 세포 보다 약 5배 또는 그 이상 큰 세포가 신시티아로 생각된다.

베나노마이신 A와 B는 10-100 ㎍/㎖의 농도에서 T-세포의 신시티움 형성을 억제한다.

일반적으로, 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B는 HIV 감염 저해용 항바이러스제의 형태로 실제 투약에 따라 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 의하여 사용된 유효성분 화합물, 즉 베나노마이신 A 또는 B나 이들의 염을 HIV에 대한 항바이러스제로서 사용할 때, 이는 단독으로 투여하거나 부형제 또는 담체와 함께 혼합하여 주사제, 경구제 또는 좌제 등의 형태로 투여할 수 있다. 어떠한 제약적으로 허용될 수 있는 부형제와 담체도 본 목적에 이용할 수 있다. 사용되는 담체의 성질과 조성은 투여방법에 따라 달라진다. 예를들면, 물, 에탄올이나 콩기름, 깨기름 또는 광물성 기름과 같은 동식물유 또는 합성유가 액체 담체로서 사용될 수 있다.

적합한 고체 담체의 예를들면 말토스 또는 수크로스와 같은 당류, 아미노산, 히드록시프로필셀루로즈와 같은 셀루로오즈 유도체, 시클로덱스트린과 같은 폴리삭카리드, 스테아린산 마그네슘과 같은 유기산의 염 등이 있다. 주사제의 경우에, 일반적으로 주사제의 액체매체는 생리 식염수, 완충용액, 글루코스, 이노시톨 또는 만니톨과 같은 당류의 수용액 또는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 이노시톨, 만니톨, 글루코스, 만노스, 말토스 또는 수크로스와 같은 당류나 페닐아라닌과 같은 아미노산의 부형제와 혼합된 유효성분으로서 베나노마이신을 함유하는 동결건조제제로 제조하는 것도 좋다.

이러한 동결건조제제를 투여할 때, 이는 주사용에 적합한 용제, 예를들어 멸균수 또는 생리 식염수와 같은 정맥내-투여 가능한 액체, 글루코스 수용액, 전해질 수용액 또는 아미노산 수용액에 용해시켜서 사용할 수 있다.

제조된 저해제에 존재하는 베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B의 배율이 한제제에서 다른 제제로 광범위하게 변할 수 있어도, 이는 통상 0.1-100 중량%의 범위에 있고, 바람직하기로는 1-90 중량% 이다. 주사제의 경우에, 예를들면, 통상주사가능한 용액은 유효성분으로 화합물 0.1-5 중량%의 농도로 함유하는 것이다. 경구투여시, 유효성분의 화합물은 고체담체와 배합하여 정제, 캡슐, 산제, 과립제로 제조하거나 액체담체와 배합하여 용액 또는 건조 시럽등으로 제조할 수 있다. 정제, 과립제 또는 산제에 있어서, 이에 존재하는 유효성분인 베나노마이신의 비율은 통상 약3-100 중량%이고, 바람직하기로는 5-90 중량% 이며, 나머지는 담체로 형성된다.

베나노마이신 A 또는 베나노마이신 B의 투여량은 환자의 나이, 체중, 증상과 의도하는 치료목적에 따라 측정된다. 베나노마이신의 치료적, 즉 유효 투여량은 통상 비경구 투여시는 1-300 ㎎/㎏/일의 범위이고 경구투여의 경우는 5-500 ㎎/㎏/일 이다. 이러한 투여량은 동물 시험결과나 여러 가지 정황을 보아서 결정한 일정량을 전체 투여량이 초과하지 않는 한 계속적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 또한, 비경구 투여시에 주어진 전체 투여량은 투여방법, 환자 또는 피처리 동물의 상황, 예를들면, 나이, 체중, 성별, 감수성, 식이, 투여시간, 투여경로, 병용되는 약제, 환자 또는 질병의 정도에 따라서 적당하게 변할 수 있다. 주어진 조건하에서 베나노마이신의 적합한 투여량과 투여회수는 상기 지침을 기초로 하고 최적 투여량을 결정하는 시험을 통하여 전문의사가 결정하여야 한다. 이러한 투여조건은 베나노마이신의 경구투여에서도 동일하게 적용된다.

본 발명의 따른 여러 가지 형태의 제제 또는 조성물을 나타내는 실시예를 들어 본 발명을 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

일정량의 정제수를 50 중량부의 베나노마이신 A의 나트륨염(카르복실레이트)에 가하여 전체가 2000 중량부가 되게 한다. 나트륨염을 물에 용해시킨 후, 여기서 얻은 용액을 상품명 밀리포어 필터 GS의 미세다공성 필터에 통과시켜 살균여과한다. 얻은 2g의 살균 여액을 각각 10㎖의 병에 넣은 다음 동결건조하면, 병당 베나노마이신 A의 나트륨염이 50㎎ 함유되어 있는 주사제를 얻는다.

[실시예 2 ]

50 중량부의 베나노마이신 A, 600 중량부의 락토스, 330 중량부의 결정 셀루로오즈와 20 중량부의 히드록시프로필 셀루로오즈를 완전하게 혼합한다. 생성된 혼합물 분말을 로울-형 압축기(상표명, 로울러 컴팩터)로 압착한 다음 생성된 압착고체를 분쇄한다. 여기서 분쇄된 물질을 채질하고, 16메쉬 내지 60메쉬 사이의 크기를 갖는 생성된 과립제로서 수집한다.

[실시예 3]

30 중량부의 베나노마이신 A, 120 중량부의 결정 락토스, 147 중량부의 결정 셀루로오즈와 3 중량부의 스테아린산 마그네슘을 V-형 혼합기에서 함께 혼합하고 정제당 300㎎의 유효성분 베나노마이신 A를 함유하는 정제로 압착한다.

[실시예 4]

일정량의 정제수를 30 중량부의 베나노마이신 B 염산염에 가하여 전체가 2000 중량부가 되게 한다. 베나노마이신 B 염산염을 물에 용해시킨 후, 여기서 제조된 용액을 상품명 밀리포어 필터 GS의 미세 다공성 필터로 통과시켜 살균 여과한다.

2g의 살균 여액을 각각 10㎖의 병에 넣은 다음 동결건조 하면 병당 30㎎의 베나노마이신을 함유하는 동결건조된 주사제를 얻는다.

[실시예 5]

50 중량부의 베나노마이신 B 염산염, 600 중량부의 락토스, 330 중량부의 결정 셀루로오즈와 20 중량부의 히드록시 프로필 셀루로오즈를 함께 완전하게 혼합한다. 생성된 혼합물 분말을 로울-형 압착기(상품명, 로울러 컴팩터)에 통과시킨 다음 생성된 압착고체를 분쇄한다. 여기서 분쇄된 물질을 채질하고, 16메쉬 내지 60메쉬 사이의 크기를 갖는 과립부분을 과립제로 수집한다.

[실시예 6]

30 중량부의 베나노마이신 B 염산염, 120 중량부의 결정 락토스, 147 중량부의 결정 셀루로오즈와 3 중량부의 스테아린산 마그네슘을 V-형 혼합기에서 혼합한 다음 정제당 300㎎의 유효성분 베나노마이신 B 염산염을 함유하는 정제로 압착한다.

베나노마이신 A와 B는 새로운 미생물, MH 193-16F4 균주의 배양으로 생성되는 항생물질이기 때문에, 이들 항생물질의 발효제조는 후술할 것이다.

베나노마이신 A와 B의 제조는 방선균인 MH 193-16F4 균주를 통상의 미생물에 의하여 이용될 수 있는 영양원 함유 배지에 접종시킨 다음 호기성 조건하에 상기 베나노마이신-생산균을 배양시켜서 행한다. 베나노마이신 A와 B를 배양액에서 생산 축적한다. 베나노마이신 A와 B는 배양물, 특히 배양액 또는 이의 여액으로부터 회수한다.

사용하는 배지에서 이용할 수 있는 영양원으로서 공지의 방선균을 배양하는 데 유용한 통상의 탄소원과 질소원이 있다.

예를들면, 동화 질소원은 시판되고 있는 콩가루, 펩톤, 육즙, 옥수수 침지액, 면실분, 땅콩가루, 건조효모, 효모추출물, NZ-아민, 카제인, 질산나트륨, 황산암모늄과 질산암모늄이 있고, 동화 탄소원은 시판되고 있는 글리세린, 수크로스, 전분, 글루코스, 갈락톡스, 말토스, 덱스트린, 락토스, 몰라세스, 콩기름, 지방과 아미노산이 있다. 또한, 배지는 염화나트륨, 인산염, 탄산칼슘, 황산마그네슘, 염화코발트와 염화망간과 같은 무기염이 있다.

더욱이, 미량의 금속염, 소포제로서 하나 또는 그 이상의 동식물유 또는 광물섬유를 첨가할 수 있다.

베나노마이신 A와 B의 대량 생산에는 액체 배양법이 바람직하다. 배양온도는 베나노마이신-생산균이 발육할 수 있고 베나노마이신 A와 B를 생산 할 수 있는 온도 범위에서 선택한다.

배양온도는 통상 20-40℃이고, 바람직하기로는 25-37℃이다.

베나노마이신 A와 B를 생산할 수 있는 미생물의 배양물로부터 베나노마이신 A와 B를 회수하기 위하여, 일반적인 회수 및 정제법, 예를들어, 용제 추출법, 이온-교환 수지법, 흡착 또는 분배 칼럼 크로마토그라피법, 겔 여과법, 투석법, 침전법 등을 단독 또는 결합으로 사용하여 베나노마이신 A와 B를 배양물 또는 배양액에서 추출한 후 정제한다. 예를 들면 베나노마이신 A와 B를 배양 균체로부터 아세톤-물 또는 메탄올-물로 추출하여 얻을 수 있다. 또한, 배양액 또는 여액에 생산 축적된 베나노마이신 A와 B는 미소다공성 비이온 수지 흡착제인 흡착제 DIAION HP-20(상품명; 일본 미쯔부시 화성사의 합성수지 흡착제)에 흡착시킬 수 있다. 또한, 배양액 또는 여액을 물과 혼합할 수 없는 유기용제, 예를 들어 부탄올, 초산에틸 등으로 추출할 때, 베나노마이신 A와 B 물질은 유기 용제층에서 추출한다.

베나노마이신 A와 B의 제조에 있어서, MH 193-16F4 균주를 호기성 조건하에 25-37℃의 온도로, 3-10일 동안 배양하여 생성된 배양액에서 베나노마이신 A와 B를 생산 축적하고, 배양액을 여과하고 배양여액을 베나노마이신 A와 B를 흡수하는 흡착제 칼럼으로 통과시키고, 흡착된 베나노마이신 A와 B를 함유하는 흡착제컬럼을 크로마토그라피로 용출하여 베나노마이신 A와 B를 분리하여 회수한다.

베나노마이신 A와 B를 서로 단리하고 더 정제하기 위하여는, 실리카 겔(상품명, WAKOGEL C-300, 일본 Wako Pure Chimical Ind., Ltd. 제품)과 알루미나 또는 겔-여과제 Sephadex LH-20 (상품명; Pharmacia AB 제품)등과 같은 흡착제를 사용한 크로마토그라피법으로 할 수 있다.

전술한 배양물에서 생성된 베나노마이신 A와 B는 이들의 유리 형태로서 베나노마이신 A와 B로 단리시킬 수 있다.

또한, MH 193-16F4 균주는 일본 정부의 국제 상공부 산업과학 기술부, 발효연구소인 기탁소에 기탁번호 EERM P-9529로 기탁되어 있다. 현재 MH 193-16F4는 기탁번호 FERM BP-2051로 부다페스트 조약 기구의 발효 연구소에 기탁되어 있다.

베나노마이신 A와 B를 함유하는 용액 또는 이의 농축액을 재취 공정의 조작에서 예를 들어 추출, 단리 또는 정제공정에서 수산화나트륨 또는 수산화 칼륨과 같은 알카리 금속 화합물, 수산화 칼슘 또는 수산화 마그네슘과 같은 알카리 토류 금속 화합물과 암모늄염을 포함한 무기염기; 및 에탄올아민, 트리에틸아민 또는 디시클로헥실아민과 같은 유기 염기와 처리할 때, 베나노마이신 A와 B는 대응하는 염으로 변화하여 이의 염 형태로 분리 또는 단리된다.

다음 실시예 7-9는 베나노마이신 A와 B의 발효제조를 예시한 것이다.

[실시예 7]

한천 사면 배지에서 배양한 MH 193-16F4 균주(FERM BP-2051과 동일)를 500㎖ 용량의 경사구 플라스크에 넣은 1.0%의 전분과 3.0%의 콩가루로된 80㎖의 액체 배지(살균전 pH 7.0)에 접종시키고, 접종된 배지를 흔들면서(135rpm) 3일동안 28℃에서 배양하여 제1종 배양을 얻는다. 얻은 제1종 배양을 3㎖ 부분씩 상기와 동일한 조성을 갖는 80㎖-부분의 액체배지에 접종하고, 이를 여러개의 경사구 플라스크에 분리하여 넣는다. 접종된 배지를 상기와 동일한 배양조건하에서 3일간 배양하여 제2종 배양을 얻는다.

생성된 제2종 배양(2리터)을 120℃에서 15분 동안 살균된 상기와 동일한 조성을 갖는 배지(50리터)에 접종한 다음 100ℓ 용량의 배양조에 넣는다. 이렇게 접종된 배지를 50ℓ/분의 통기량과 200rpm의 교반하게 2일 동안 28℃에서 배양한 다음 호기성 조건하에 MH 193-16F4의 액침 배양으로 제3종 배양을 얻는다.

125℃에서 30분간 미리 살균하고 570ℓ-용량의 배양조에 넣은 2.0%의 글리세린, 1.5%의 대두분(상품명; Esusan Meat로 시판되고 있는 일본 아지노모도 회사제품), 0.0025%의 KHPO, 0.1125%의 KHPO, 0.005%의 COCl·6H0, 0.03%의 실리콘유 KM 72 (상품명; 소포제, 일본 시네쥬 화학회사)와 0.01%의 계면활성제Adekanol(상품명; 일본 아시히 덴카 고교회사 제품)로 이루어진 배지(300리터)에 생성된 제3종 배양(12리터)을 접종하고, 28℃에서 7일 동안 최초 배양 24시간에는 통기량 150ℓ/분으로, 배양 24시간 후에는 통기량 300ℓ/분으로 배양한다.

배양종료 후, 얻은 배양액을 여과조제로서 규조로와 혼합한 후 여과하면 250ℓ의 배양여액(pH 6.0)을 얻는다.

[실시예 8]

상기 실시예 7에서 얻은 배양여액(250ℓ)을 15ℓ의 미세다공 비이온 흡착제 수지 DIAION HP-20의 칼럼으로 통과시켜 흡착제에 활성물질을 흡착시킨다.

흡착제 칼럼을 100ℓ의 물과 45ℓ의 50% 수성 메탄올로 세척한 후, 흡착제 칼럼을 45ℓ의 70% 수성 메탄올로 용출한 다음 90ℓ의 건조 메탄올로 용출하여, 용출액의 제1분획(53ℓ), 제2분획(38ℓ)과 제3분획(27ℓ)을 분리하여 얻는다. 활성물질을 함유하는 제1분획을 감압하에 3ℓ로 농축한 다음, 묽은 염산으로 pH 3.5로 조정하면 적색 침전물이 침전한다. 침전물을 여과하여 수집한 다음 감압하에 건조하면, 주로 베나노마이신 A로 이루어지는 152g의 조 갈색 분말을 얻는다.

150g의 조 분말을 600㎖의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 생성용액을 데시케이터에서 3일 동안 실온에서 수증기로 포화시키면, 결정성 침전물이 침전된다.

침전물을 여과하여 수집한 다음 감압하에 건조하면, 29g의 베나노마이신 A-디메틸포름아미드 용매화합물을 얻는다. 용출액의 제2 분획도 제1 분획과 동일한 방법으로 진행하면 14g의 베나노마이신 A-디메틸포름아미드 용매 화합물을 얻는다.

상기 제1 분획에서 얻은 1g의 베나노마이신 A-디메틸포름아미드 용매 화합물을 디메틸술폭시드(5㎖)에 용해시킨다. 생성용액을 교반하면서 300㎖의 메탄올에 적가한 다음, 10분 동안 교반하면 적갈색의 침전물이 침전된다. 침전물을 여과한 다음 감압하에 건조하면, 적갈색 분말인 935㎖의 정제된 베나노마이신 A를 얻는다.

10㎖의 물과 1.1㎖의 0.1 M NaOH의 혼합물에 용해한 베나노마이신 A(82.7㎎)용액을 동결건조한다.

잔사를 3㎖의 메탄올에 용해시키고 메탄올로 전개되는 Sephadex LH-20 칼럼(300㎖)에서 크로마토그라피 하면 베나노마이신 A 나트륨염(75.8㎎)을 얻는다.

[실시예 9]

실시예 8에서 얻은 용출액의 제3 분획을 감압하에 1.5ℓ로 농축한 다음, 묽은 염산으로 pH 3.5로 조정하면, 적색 침전물을 얻는다. 침전물을 여과하여 수집한 다음 감압하에 건조하면 베나노마이신 B를 함유하는 98g의 조 갈색 분말을 얻는다. 이 조 분말 1g을 40℃에서 10㎖의 디메틸포름아미드에 용해시키고 생성용액을 디메틸포름아미드에 침지시킨 1ℓ의 겔-여과제, Sephadex LH-20의 칼럼으로 통과시킨 다음, Sephadex 칼럼을 디메틸포름아미드로 전개시킨다. 용출액을 6㎖-분획으로 수집한다. 활성물질을 함유하는 분획 번호 64-72를 수집하고, 혼합한 다음 감압하에 농축건조하면, 베나노마이신 B-디메틸포름아미드 용매화합물로 된 657㎎의 조 갈색 분말을 얻는다.

300㎎의 이 조 분말을 100㎖의 메탄올에 용해시키고, 1㎖의 IN 염산을 첨가한 후, 용액을 감압하에 농축 건조시킨다. 갈색의 생성된 조 분말을 3㎖의 디메틸술폭시드에 용해시킨다. 생성용액을 200㎖의 클로로포름에 교반하면서 적가한 다음, 20분 동안 교반하면, 적갈색 침전물이 침전된다. 침전물을 여과하여 수집한 다음 감압하에 건조하면, 정제된 258㎎의 베나노마이신 B 염산염을 얻는다.

Claims (2)

1. 다음 일반식(I)으로 표시되는 베나노마이신 A와 이의 염중 최소한 하나를 유효성분으로하여 제약적으로 허용될 수 있는 유효성분용 담체와 배합하여 이루어짐을 특징으로 하는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스 감염 저해제.

   

   (상기식에서 베나노마이신 A의 경우 R은 수산기이다)
2. 유효량의 베나노마이신 A와 제약적으로 허용될 수 있는 염중 최소한 하나를 유효성분으로하여 제약적으로 허용될 수 있는 유효성분용 담체와 배합하여 이루어짐을 특징으로 하는 인체 후천성 면역부전증후군 바이러스에 의하여 유도되는 인체 T-세포의 신시티움 형성을 저해하는 항바이러스제.