CH668974A5 - Antitumor-antibiotikum. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues cy-

clisches Depsipeptid, mit antitumor-antibiotischen Eigenschaften, das hier als Sandramycin bezeichnet wird, und auf 20 seine Herstellung durch Fermentation eines neuen Mikroorganismus der Art Nocardioides, Stamm C49,009, ATCC 39 419 und die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche das neue Antitumor-Antibiotikum enthalten. Diese Erfindung bezieht sich ebenfalls auf den neuen Mikroorganis-25 mus selbst, welcher für die fermentative Erzeugung von Sandramycin dient.

In der US-PS 4 360 458, erteilt am 23. November 1982 an Koshiyama et al., ist ein antitumor-antibakterieller Kom-30 plex, bezeichnet als BBM-928 und seine Herstellung beschrieben; bei der Herstellung wird ein neuer Stamm von Ac-tinomycetes verwendet, der als Stamm G-455-101 (ATCC 31 491) bezeichnet wurde, und später als neuer Stamm des Genus Actinomadura bestimmt und als Actinomadura luzo-35 nensis nov. sp. bezeichnet wurde (siehe «J. Antibiotics», 33 (10), 1098-1102(1980) ).

Die Herstellung, Isolierung, Charakterisierung und Anti-tumoraktivität der BBM-928-Komponenten werden in «J. 40 Antibiotics», 33 (10), 1087-1097 (1980) beschrieben. Die Struktur von BBM-928A, B, C und D (nun als Luzopeptin A, B, C bzw. D bezeichnet) welche die vier Hauptkomponenten des BBM-928-Komplexes darstellen, werden in der US-PS 4 451 456, erteilt am 29. Mai 1984 an Koshiyama et 45 al., beschrieben und weisen folgende Strukturformeln auf:

CH»0

HjC CH) ÇH, HjC C-0H

■svOH .•& co-nh-ch2-co-n-ch2-co-n-ch L

CO-NH-CH-CO-N'^Y,ori '

ch2

0 CO

1

L ch-n-co-ch2-n-co-ch2-nh-cô

H0-C CHa CH, a J

h3c ch3

CO

I

0

CH2

R20r^Y N-C0- ch-nh-co1«n

HO

OCH,

Ri

Luzopeptin A B C D

-COCH3 -COCH3 H

-coch2ch.

-COCH3 H H

-COCH,

3

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Die Luzopeptine A, B, C und D enthalten strukturelle Merkmale, welche 3-Hydroxy-6-methoxychinaldinsäure als Chromophor und 4-Hydroxy-2,3,4,5-tetrahydropyridazin-3-carbonsäure einschliessen, wo die strukturelle Differenz unter den drei Komponenten nur im Ausmass der Acetylierung der Hydroxygruppe in den Tetrahydropyrazinresten verschieden ist.

U' "CONH-CH-CO-N CH,

0

1

CO

O-NHCH.-CO-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues, cy-clisches Depsipeptid mit anlitumor-antibiotischen Eigenschaften, das hier als Sandramycin bezeichnet wird und die folgende Formel aufweist

CH, CH,

CH

ÇH, ÇH,j

N-CHfCO-N-CH

CO I

0

1

CH,

i

N-CO-CH-NHOC

CH-N-CO-CH,-N-CO-CH,NH-CO Ii ' l 1

I CH, CH,

CH

CH, \:H,

Die neue antibiotische Verbindung Sandramycin wird erhalten, indem ein neuer Mikroorganismus, der vorläufig als Art der Gattung Nocardioides klassifiziert wurde, fermentiert wird, das durch den genannten Mikroorganismus produzierte Sandramycin angereichert und das Antibiotikum Sandramycin aus der Kulturbrühe gewonnen wird. Ein bevorzugter Sandramycin produzierender Mikroorganismus ist der Nocardioides sp.-Stamm C49 009, der aus einer aus Mexiko stammenden Bodenprobe isoliert worden ist, und Mutanten davon. Dieser Stamm ist am 25. August 1983 in der American Tvpe Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 als ATCC 39 419, hinterlegt worden.

Der Mikroorganismus

Es folgt eine allgemeine Beschreibung des bevorzugten Mikroorganismus, der das Antitumor-Antibiotikum Sandramycin produziert.

Morphologie

Der Stamm Nr. C49 009 bildet sowohl Substrate als auch aeriale Mycelien (0,4 (.im breit) und das Substrat Mycélium ist lang, gut verzweigt und nach einer Woche in kurze Filamente oder Stäbchen fragmentiert. Der Stamm Nr. C49 009 hat nach kontinuierlicher Kultivierung die Tendenz, seine Fähigkeit, ein aeriales Mycélium zu bilden, zu verlieren. Die Hyphen des Zweiges des aerialen Mycéliums sind spärlich. Mikroskopische Beobachtungen zeigen, dass die aerialen Hyphen am Anfang mehr oder weniger zickzack-förmig sind und sich in lange, gerade Ketten von arthrosphorenähn-lichen zylindrischen Segmenten (0,5 x 1 bis zirka 3 (im) entwickeln, welche später von den durchscheinenden Hyphen abgetrennt werden. Die Oberfläche der sporenähnlichen Segmente ist weich. Der Stamm Nr. C49 009 ist grampositiv und nicht säurefest. Sporangien, motile Sporen und Sklero-tien werden nicht beobachtet.

Zusammensetzung der Zellwand und Zuekerkomponenten der gesamten Zelle

Die Zellwand des Stammes Nr. C49 009 enthält LL-Di-aminopimelinsäure und Glycin als charakteristische Aminosäurekomponenten der Zellwand, die gemäss den Methoden bestimmt wurden, welche beschrieben sind von B. Becker et al. in «Appi. Microbiol.», L3< 236-243 (1965) und T. Yama-guchi in «J. Bacteriol.», 89, 441-453 (1965). Das gesamte Zellhydrolysat zeigt die Gegenwart von Glukose, Mannose und Ribose, wobei jeder diagnostische Zucker fehlt, wie er gemäss den Verfahren bestimmt wurde, die durch M.P. Le-chevalier et al. in «Biol. Actinomycetes Related Organismus», U, 78-92 (1976) umschrieben sind. Die vorherge-25 nannte Zell wandzusammensetzung und die Zuckerkomponenten der gesamten Zelle zeigen, dass der Stamm Nr. C49 009 eine Actinomycetes Art vom Zellwandtyp I ist.

Kulturelle und physiologische Charakteristika 30 Der Stamm Nr. C49 009 ist ein Obligat aeorber Actinomycetes und wächst in den meisten beschriebenen Medien gut. Das aeriale Mycélium wird reichlich oder massig gebildet in ISP-Medien der Nr. 31 5 und 7 und in Czapek's Sac-charose-Nitratagar, jedoch spärlich in nährstoffreichen orga-35 nischen Medien wie ISP-Medien der Nr. 2 und 6 oder Ben-nett's Agar. Die Farbe des aerialen Mycéliums ist weiss. Me-lanoid und andere bestimmte Pigmente werden in den beschriebenen geprüften Medien nicht erzeugt. Die Farbe der Rückseite des vegetativen Mycéliums ist ausschliesslich gelb-40 lieh. Es zeigt optimales Wachstum bei 28 ;C, bescheidenes Wachstum bei 15 und 37 C, jedoch kein Wachstum bei 5 und 45 C. Gelatine und Stärke werden zersetzt. Die Tyrosi-nase-Reaktion ist negativ. Das Wachstum wird gehemmt bei der Gegenwart von 7% NaCl oder 0,01% Lysozym. Die kulturellen und physiologischen Charakteristika des Stammes Nr. C49 009 werden in den Tabellen 1 bzw. 2 dargestellt. Der Stamm Nr. C49 009 verwendet die meisten Zucker für sein Wachstum und die Verwendung von Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.

45

50

Tabelle 1

Kulturelle Charakteristika des Stammes Nr. C49 009*

55

Trypton-Hefeextrakt-Brühe: (ISP Nr. 1)

Saccharos-Nitrat-Agar 60 (Czapek-Agar)

Glucose- Asparagin-65 Agar

G: massig; flockig; schwachgelbe Sedimente D: keine G: reichlich

R: gelbweiss (92)*** bis dunkel gräulich gelb (91 ) A: mässig. weiss (263) D: mässig, gelb (87) G: schwach R: gelblich weiss (92) bis schwach gelb (89) A: schwach, weiss (263) D: keine

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4

Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5)

Anorganische Salze-Stârke-Agar (ISP Nr. 4)

Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7)

Nähragar

Hefeextrakt-Malzex-trakt-Agar (ISP Nr. 2)

Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3)

Bennett-Agar

Pepton-Hefeextrakt-Ei-senagar (ISP Nr. 6)

G: mässig

R: schwach gelb (86) bis mässig gelb (87)

A: schwach, weiss (263) D: keine G: mässig

R: blassgelb (89) bis mässig gelb (87)

A: schwach, weiss (263) D: keine G: reichlich

R: blassgelb (89) bis dunkelgelb (88)

A: mässig, weiss (263) D: keine G: mässig R: blassgelb (89)

A: mässig, weiss (263) D: keine G: reichlich

R: blassgelb (89) bis mässig gelb (87)

A: schwach, weiss (263) D: keine G: mässig

R: gelblich weiss (92) bis mässig gelb (87)

A: mässig, weiss (263) D: keine G: mässig

R: blassgelb (89) bis dunkelgelb (88)

A: spärlich bis wenig, weiss

(263)

D: keine G: schwach

R: blassorangegelb (73) bis hellorangegelb (70) A: spärlich, weiss (263) D: keine

C während 3 Wo-

* beobachtet nach Inkubation bei 28 chen

** Abkürzungen: G = Wachstum; R = Farbe der Rückseite; A = aeriales Mycélium; D = diffundierbares Pigment

*** Farbe und Zahl in Klammern gemäss der Farbnorm in «Kelly, K.L. und D.B. Judd: ISCC-NBS color-name Charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept. of Comm. Cir. 553, Washington, D.C. Nov., 1975».

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stammes Nr. C49 009

Test Reaktion Verwendetes Verfah ren oder Medium

Temperaturbereich für Wachstum

Gelatine-Verflüssigung

Stärkehydrolyse

Maximales Wachstum bei 28 C. Massiges Wachstum bei 15 C und 37 C. Kein Wachstum bei 5 und 45 C. verflüssigt hydrolysiert

Bennett-Agar

1% Malzextrakt, 0,4% Hefeextrakt, 0,4% Glucose, 20% Gelatine

Stärke-Agar-Platte

Reaktion in entrahmter Milch

Bildung von s Melanoid-Pig-menten

Tyrosinase-Re-aktion

Nitrat-Reduktion

Nitrat-Reduktion

15 pH-Toleranz

NaCl-Toleranz

20

Lysozym-Tole-ranz

25

Difco entrahmte Milch

Tyrosin-Agar, Pep-ton-Hefeextrakt-Ei-sen-Agar und Tryp-ton-Hefeextraktbrühe Verfahren nach Arai*

Czapek-Saccharose-Nitrat-Brühe 0,5% Hefeextrakt, 1 % Glucose, 0,5% KNO3, 0,1% CaC03 Hefeextrakt-Malzex-trakt-Agar

Grundmedium: 1% Hefeextrakt, 2% lösliche Stärke, 1,5% Agar.

Trypticase-Soja-Brü-he plus 1,5% Agar koaguliert negativ negativ negativ negativ

Wachstum bei pH-Wert 5,0 bis 10,5, kein Wachstum bei pH-Wert 4,5. Wachstum bei 5% NaCl oder weniger, kein Wachstum bei 7% NaCl. empfindlich aber partiell resistent (Wachstum weniger Kolonien bei 0,01 % Lysozym)

* Arai, T and Mikami, «Chromogenicity of Streptomyces», 30 Appi. Microbiol., 23, 402-406 (1972).

Tabelle 3

Kohlenhydrat-Verwertimg des Stammes C49 009

35 Glycerin +

D(—)-Arabinose +

L(+)-Arabinose —

D-Xylose +

D-Ribose +

4ö L-Rhamnose +

D-Glucose +

D-Galactose +

D-Fructose 4-

D-Mannose +

45 L-( —)-Sorbose —

Saccharose +

Lactose +

Cellobiose +

Melibiose +

50 Trehalose +

Raffinose +

D(+)-Melezitose +

lösliche Stärke +

Cellulose —

55 Dulcit —

Inosit +

D-Mannit +

D-Sorbit —

Salicin —

60

Beobachtet nach Inkubation bei 28 C während 3 Wochen.

Grundmedium: Anorganisches Medium nach Pridham-Gottlieb.

65 Abkürzungen: +: positive Verwertung, — : negative Verwertung.

Taxonomie

Der Stamm Nr. C49 009 wird durch seine grampositive

5

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Reaktion, seine nicht-säurefeste Natur, die Fragmentierung des Substratmyceliums, die Bildung eines weissen aerialen Mycéliums, die arthrosporenartige Segmentierung in ganzen Teilen des aerialen Mycéliums und durch die Abwesenheit der Fähigkeit bestimmte Pigmente zu bilden charakterisiert.

Diese Charakteristika, zusammen mit der Gegenwart von LL-Diaminopimelinsäure und Glycin, jedoch die Abwesenheit von diagnostischem Zucker in den Zellwänden, führen zur Einordnung des Stammes C49 009 in die Gattung der Nocardioides (H. Prauser, «Intl. J. Syst. Bacteriol.», 26 58-65 (1976)). Der Stamm Nr. C49 009 unterscheidet sich von den aerialen Mycélium bildenden Actinomycetes der Nocardioform einschliesslich Nocardiopsis dassonvillei, Sac-charopolyspora hirsuta und alle Heterologenarten der Gattung Nocardia durch die diagnostische Aminosäure oder Zucker der Zellwand und durch die diagnostischen physiologischen Eigenschaften, wie beschrieben durch R.E. Gordon et al., «J. Gen. Microbiol.», 109 69-78 (1978) und wie in Tabelle 4 dargestellt. Der Stamm C49 009 unterscheidet sich weiter von der Gattung Streptomyces durch seine sporogene Morphologie des Nocardiae-Typs. Beispielsweise zerfallen die Substrathyphen von Fragmenten des Stammes Nr. C49 009 in Filamente oder Stäbchen. Die arthrosporenähn-lichen Segmente des Stammes Nr. C49 009 sind unterscheidbar von den Sporen von Streptomyces bezüglich des Ortes der Bildung, der Anordnung in der hyphalen Scheide und der Abwesenheit von unterscheidbaren Sporenwänden.

Tabelle 4

Diagnostische phvsiologische Charakteristika des Stammes C49 009

Säurefestigkeit —

Zersetzung von:

Adenin

—

Casein

+

Hypoxanthin

—

Tyrosin

+

Harnstoff

—

Xanthin

Resistenz gegen:

Lysozym

—

Rifampicin

+

Hydrolyse von:

Aesculin

+

Hippurat

+

Stärke

+

Säure aus:

D(-)-Arabinose

+

L(+)-Arabinose

—

Erythrit

—

Glucose

+

Inosit

+

Lactose

+

D-Melezitose

+

Melibiose

+

Methyl-a-glucosid

Raffinose

+

Verwertung von:

Benzoat

—

Ci trat

+

Mucat

—

Succinat

+

Tartrat

Nitrit aus Nitrat Überleben bei 50 C, 8 h

Abkürzungen: + : positives Merkmal, — : negatives Merkmal.

Das Empfindlichkeitsprofil einer Serie von taxon-spezifi-schen Phagen unterscheidet die Stämme der Gattung Nocardioides von den verwandten Gattungen, wie Streptomyces oder Nocardia (vgl. H. Prauser: Host-phage relationships in nocardioform organisms, «In the Biology of Nocardiae», Edit. M. Goodfellow et al., London, New York and San Francisco, Academic Press (1976) ). Die Empfindlichkeit des Stammes Nr. C49 009 gegenüber diesen Actinophagen wurde nicht geprüft, da die Phagen nicht erhältlich waren. Auf Basis von kulturellen und physiologischen Charakteristika gehören die 17 Stämme der Gattung Nocardioides, welche aus Bodenproben, die in verschiedenen Stellen der Welt gesammelt wurden, zu einer einzigen Art, Nocardioides albus. Der Stamm Nr. C49 009 unterscheidet sich von Nocardioides albus bei seiner Verwertung von L-Arabinose und Ino-sit, ist jedoch dem letzteren ähnlich in seinen gesamten kulturellen und physiologischen Eigenschaften. Demzufolge wurde der Stamm Nr. C49 009 vorerst als Art der Gattung Nocardioides klassifiziert.

Die vorliegende Erfindung soll nicht eingeschränkt werden auf die Verwendung des besonderen Stammes Nr. C49 009 oder von Organismen, die vollständig der obengenannten Beschreibung entsprechen. Es sollen insbesondere auch Sandramycin erzeugende Mutanten der genannten Organismen umfasst werden, die aus den beschriebenen Organismen durch bekannte Mittel, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen, Behandlung mit Stickstoffsenfen, Phagenaus-setzung und dergleichen erhältlich sind, sofern die Zugehörigkeit der genannten Mutanten zum nicht mutierten Mikroorganismus bestimmt werden kann.

Herstellung des Antibiotikums

Sandramycin wird hergestellt, indem Nocardioides sp. Stamm Nr. C49 009 (ATCC 39 419) oder ein Mutant davon in einem üblichen Nährmedium kultiviert wird. Der Organismus wird gezüchtet in einem Nährmedium, das bekannte Nährmittelquellen, d.h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gegebenenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren enthält. Für die Herstellung von grossen Quantitäten des Antibiotikums werden erfindungsgemäss submerse aerobe Bedingungen verwendet, obwohl Sandramycin in begrenzten Mengen ebenfalls durch Oberflächen- und Flaschenkulturen erhältlich ist.

Das Nährmittelmedium sollte eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Glucose, Saccharose, Mannose, Fructose, Maisstärke, Maltose, Mannit, Melasse in gereinigtem oder in rohem Zustand enthalten. Das Nährmittelmedium sollte ebenfalls eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, wie beispielsweise Sojabohnenmehl, Fischmehl, Malzextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Gluten-mehl, Baumwollsaat-Embriomehl, Sojamehl, Leinsamenmehl, Baumwollsaatmehl, Kasein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze oder Harnstoff enthalten. Anorganische Nährsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und Spuren von Schwermetallsalzen, wie von Kupfer, Zink, Mangan oder Eisen können ebenfalls dem Nährmedium zugesetzt werden.

Die Fermentationstemperatur sollte im Bereich von 15-37 °C und vorzugsweise im Bereich von 25-30 °C liegen. Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte im Bereich von 5-10,5 liegen und der bevorzugte Bereich ist 6-8,5. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion von Sandramycin in 2-9 Tagen erhalten, in Abhängigkeit von der Temperatur. Wenn eine Tankfermentation ausgeführt werden muss, ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem das Brühenmedium mit einer Neige5

10

15

20

25

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35

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6

platten- oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Mikroorganismus inokuliert wird. Nachdem ein aktives Inokulum auf diese Weise erhalten worden ist, wird es aseptisch in das Medium des Fermentationstankes übergeführt.

Isolierung von Sandramycin

. Bei Beendigung der Fermentation wird das Sandramycin aus dem Kulturmedium gewonnen und in wesentlich reiner Form gemäss dem nachstehend erläuterten Nährstufen-Ver-5 fahren isoliert.

Gesamte Ferementationsbrühe

(1) Extraktion mit Ethylacetat

(2) Zugabe von Diatomeenerde, Filtration

(3) Trennung der Phasen und abdampfen wässrige Phase, roher Antibiotikumextrakt

(1) Extraktion mit wässerigem Methanol und «Skellysolve» B und Trennung der Phasen

«Skellysolve» B-Phase, Wasser-Methanol-Phase (1:9)

verwerfen

(1) verdünnen mit Wasser

Wasser-Methanol-Phase (1:3)

(1) extrahieren mit Tetrachlorkohlenstoff und abdampfen

Rückstand A Wasser-Methanol-Phase (1:3)

(1) verdünnen mit Wasser

Wasser-Methanol-Phase (7:13)

(1) Extraktion mit Chloroform und abdampfen

Rückstand B

Rückstand C

W asser-Methanol-Phase (7:13), verwerfen

(1) Säulenchromatographie der Rückstände A und B unter Verwendung von Diatomeenerde als Träger

(2) amdampfenderToluolfraktion

Sandramycin

(1) Silicagel-Chromatographie

(2) Elution mit einem linearen Gradienten

(1) Umkristallisation gereinigtes Sandramycin

Zur Aufarbeitung gemäss dem vorstehenden Schema wird die gesamte Brühe nach der Fermentation von Nocardioides sp. Stamm Nr. C49 009 zuerst mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Ethylacetat, extrahiert. Filterhilfsmittel, wie «Dicalite» (Warenname der Grefco Inc., Torrance, Ca., für Diatomeenerde) wird vorzugsweise zur Extraktionsmischung gegeben und die Mischung wird dann filtriert, um die unlöslichen Rückstände zu entfernen. Nach der Filtration wird die organische Phase vom Filtrat der Extraktionsmischung entfernt und durch Eindampfen konzentriert, wobei der rohe Extrakt des genannten Antibiotikums erhalten wird. Der rohe Extrakt wird zwischen einem aliphatischen Kohlenwasserstoff-

Lösungsmittel, wie «Skellysolve B» (Warenname von Skelly Oil Co. für isomere Hexane) und 10% Wasserin Methanol verteilt. Die wässrige Methanolphase wird mit einem zusätzlichen Anteil Wasser verdünnt und die erhaltene, ungefähr 60 25% Wasser-in-Methanol-Lösung wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie Tetrachlorkohlenstoff, extrahiert. Die wässrige Methanolphase wird weiter mit Wasser verdünnt und die erhaltene etwa 35% Wasser-in-Methanol-Lö-sung wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chlo-65 roform, extrahiert. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte werden vereinigt und im Vakuum abgedampft, wobei der Rückstand A erhalten wird. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei der Rückstand B

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erhalten wird. Die Rückstände A und B können vereinigt werden und auf einer Säule, die Diatomeenerde, wie «Dicali-te», enthält, unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln von niederer bis hoher Polarität chromatographiert werden. Die gewünschten Fraktionen, die das Antibiotikum enthalten, werden vereinigt und im Vakuum abgedampft, wobei der Rückstand C erhalten wird. Eine weitere Reinigung des Rückstandes C kann erzielt werden durch Niederdruckchromatographie auf Silikagel oder durch Mitteldruck-Hochleistungsfliissigchromatographie der Rückstände D, D', E und E', wie nachstehend im Beispiel 3, Stufe C, beschrieben, unter Verwendung eines linearen Gradienten von Chloroform bis 5% Methanol-in-Chloroform als Elutionsmittel. Die zweckmässigen Fraktionen werden bis zur Trockenheit abdedampft, wobei Sandramycin erhalten wird und die Um-kristallisation aus einem zweckmässigen Lösungsmittelsy-5 stem ergibt reines, kristallines Sandramycin.

Die Struktur von Sandramycin

Sandramycin ist ein cyclisches Depsipeptid, das als Anti-tumor-Antibiotikum wirksam ist und das einen 3-Hydroxy-io chinolin-Kern als Chromophoren und einen Pipecolinsäure-rest enthält. Aus Spektral- und Chemie-Analysen wurde für Sandramycin die folgende Strukturformel ermittelt:

CH, CH,

OH

CONH-CH-CO-N CHj

0

1

CO I

CH-

VCH CH, CH,|

O-NHCH,-CO-N-CH,-C0-N-CH

CO

CH,

CH

-N CH,

N-CO-CH-NHOC.

CO—CH,-N~CO-CH,NH-CO CH,

'.H

Sandramycin ist ein weisser, kristalliner Feststoff, mit einem Schmelzpunkt von 208-212 C, einer Summenformel CwiHTftOiftN^ und einem Molekulargewicht von 1221.3312. Es ist aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff zusammengesetzt. Die Elementaranaly-sendaten sind folgende:

Analyse für CH|H760|()Np-8H->0 berechnet: C, 52,78; H, 6,79; N, 12,31; O (Differenz) 28.12 gefunden: C,52,58; H, 6,27; N, 12,29; O (Differenz) 28,86.

Das Massenspektrum mit hoher Auflösung von Sandramycin wurde mit einem Kratos MS-50-Spektrometer und durch FAB-Ionisierung durchgeführt. Die bestimmte Masse ist die folgende:

Berechnet für (M + H~-Ion: 1221.5579 gefunden für (M + H~-Ion: 1221.5571. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Sandramycin, pelletisiert in KBr, zeigt charakteristische Banden bei folgenden Frequenzen, ausgedrückt in cm-1:

3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520, 1468, 1445, 1420, 1336. 1290,1265, 1235, 1172, 1138, 1092, 1055, 1018, 922, 885, 855 und 838.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Sandramycin wurde in Methanol (0,01798 g/1) unter neutralen, sauren und basischen Bedingungen bestimmt. Es wurden folgende Ab-sorptionsmaxima und Extinktionskoeffizienten beobachtet.

À.max in nm (a)

in CH3OH: 356(8,1), 296(7,5), 229(62,8), 217(63,7) in CTLOH-HC1: 356(8,3), 306(8,1), 228(58,4), 210(62,3) in CHjOH-NaOH: 395(9,2), 301(7,2), 246(59,8).

Ein Protonen-Resonanzspektrum von Sandramycin, aufgelöst in deuteriertem Chloroform, wurde mit einem Bruker Spektrofotometer. Modell WM-360 bei 360 MHz aufgenommen, wobei Tetramethylsilan als Standardsubstanz verwendet wurde. Die beobachteten chemischen Verschiebungen (6-Werte), Kupplungskonstanten (J-Werte in Hz) und Signalbeschreibungen sind folgende:

11,75 (s, 2H, Ar-OH), 9,58 (d, J = 6,39, 2H, ser NH), 8,55 (bs, 2H, gly NH), 7,82 (bs, 2H, Ar-H8), 7,72 (m, 2H, Ar-H5), 7,63 (s, 2H, Ar-H4), 7,52 (m, 4H, Ar-H6 and

Ar-H7), 5,60 (m, 2H, ctH of pip.), 5,56 (d, J= 17,58, 2H sar aCH), 5,28 (m, 2H, ser aCH), 5,01 (d. J = 12,79, 2H, ser 30 ßCH 4,88 (d, J = 12,79, 2H, val aCH), 4.45 (bd. J= 12,79, 4H, ser ßCH and sdy aCH), 4,07 (bd, J= 15.99, 4H, sH of pip. and gly ctCH). 3,76 (bd, J = 12,79, 2H, eH of pip.), 3,58 (d, J = 17,58, 2H. sar CH), 3,14 (s, 6H, N-CH3), 2,96 (s, 6H, N-CH3), 2,06 (m, 2H. val ßCH), 1,82 (bs, 4H, ßCH of pip.), 35 1,68 (bm, 4H, yCH of pip.), 1,57 (bm, 4H, SCH of pip.), 0,94 (d, J= 6,37. 6H. val-CH3), 0,80 (d, J = 6,37, 6H, val-CH3).

Ein Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum von Sandramycin, aufgelöst in deuterisiertem Chloroform, wurde mit einem Jeol-Spektrometer Modell FX90Q bei 22,5 MHz durchgeführt, wobei Tetramethylsilan als Standardsubstanz verwendet wurde. Die beobachteten chemischen Verschiebungen (ppm-Werte), worin jede chemische Verschiebung 2 C-Atome darstellt, und die Zuweisungen sind folgende:

40

45

Nr. Chemische

Zuordnung

Verschiebung

1

171,73

Carbonyl

50 2

168,54

Carbonyl

3

168.37

Carbonyl

4,5

166,91. 166,91

Carbonyls

6

165,39

Carbonyl

7

153,04

3-Hydroxychinolin

C-3

55 8

140,64

C-2

9

133,87

C-8a

10

131,22

C~4a

11

128,61

C-8

12

127,64

C-7

so 13

126,23

C 5

14

125,58

C-6

15

119,45

C-4

16

61,43

N-Methyl-valin aCH

17

27,90

ßCH

65 18

18,58

YCH3

19

17,82

tch3

20

29,42

nch3

21

49,79

Glycin aCH-,

668 974

8

Nr. Chemische Zuordnung Verschiebung

22 41.02 Sarcosin aCH

23 34,08 N-CH,

24 51,74 Serin aCH

25 61,11 ßCHi

26 48,49 Pipecolinsäure aCH

27 27,90 ß-CH,

28 19,34 y-CH,

29 24,11 5-CH,

30 43,07 s-CHo

Die Schlüsselmerkmale der Struktur von Sandramycin, welche es von den Luzopeptinen A, B und C unterscheiden, liegen in der Gegenwart von 3-Hydroxychinalginsäure- und Pipecolinsäureresten anstelle von 3-Hydroxy-6-methoxychi-nalgin- bzw. 4-substituierte Tetrahydropyridazin- 3-carbon-säuregruppen.

Biologische Aktivität von Sandramycin

Die antibakteriellen Aktivitäten von Sandramycin wurden durch eine Versuchsserie des Zweifach-Agarverdün-nungsverfahrens bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt, im Vergleich mit den Aktivitäten von Luzopeptin A und Echinomycin. Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, wirkt Sandramycin stark hemmend auf gram-positive Organismen, wie Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus ebenso wie auf Streptococcus faecalis.

Tabelle 6

Tabelle 5

Antimikrobische Aktivität von Sandramycin minimale Hemmkonzentration (MIC) mcg/ml

5 Test-Organismus

Sandra

Luzo

Echino

mycin peptin A

mycin

B. subtilis (Ree. +)

A22508-2

0,024

0,195

0,049

B. subtilis (Ree. -) A22509-2-2

0,012

0,049

< 0,003

S. aureus 209P-A9497

0,012

0,098

0,012

S. aureus (echinomycin-

resistent) A9628

0,098

0,098

0,78

Strep. faecalis A9611 E. coli A15119

0,024

0.195

0,012

12,5

12,5

12,5

E. coli (actinomycin

empfindlich) A21780

(AS-19)

12,5

12.5

6,25

Sandramycin wurde ebenfalls gegen den transplantierba-ren Mäusetumor P-388-Leukämie getestet und die Resultate sind in Tabelle 6 dargestellt. Die verwendete Methodologie entsprach im allgemeinen den Protokollen des «National Cancer Institute» (Cancer Chemotherapy Rep. Part. 3, 3, 25 1-103 (1972)). Die wesentlichen experimentellen Einzelheiten werden in Tabelle 6 unten angegeben. Es wurden zwei verschiedene Dosierungsdiäten getestet: Einzeldosis am Tag 1 und täglich während 5 Tagen. Nach beiden Plänen scheint die optimale Dosis 0,2 mg/kg/Injektion zu sein.

20

Wirkung von Sandramycin auf P-388-Leukämie

Verbindung

Tumor-Inokulum: Wirt:

Auswertung: Wirkung:

Kriterium:

AWC:

Behandlungsplan

Effekt AWC

Sandramycin d. 1

Sandramycin d. 1 5

Kontrolle

106 Ascites-Zellen i.p. implantiert. DCF]-Mäuse, weiblich MST = mittlere Überlebenszeit % T/C ^ (MST behandelt/MST Kontrolle) x 100 % T/C = 125, betrachtet als signifikante Antitumor-Aktivität mittlere Gewichtsänderung (Behandlung-Kontrolle) in g am 4. Tag.

Dosis, IP

MST

MST

g

Überle mg/kg/Inj.

Tage

% T/C

Tag 4

bende

Tag 5

3.2

toxisch toxisch

-2,8

0/6

1,6

11,5

128

-1,3

6/6

0,8

10,0

111

-1,6

6/6

0,4

11,0

122

-0,7

6/6

0,2

14,5

161

-1,4

6/6

0,1

11,0

122

-0,9

6/6

0,05

10,0

III

-0,6

6/6

0,025

9,5

106

-0,2

6/6 2/6

1,6

toxisch toxisch

-1,7

0,8

6,0

67

-1,4

5 <6

0,4

11,0

122

-1,3

6/6

0,2

12,0

133

-1,7

5/6

0,1

11,5

128

-0,8

6/6

0,05

8,5

94

-1,8

6/6

0,025

10,0

III

-1,4

5/5

0,0125

10,5

117

-0,9

6/6

Kochsalz

9,0

-

0,2

10/10

lösung

Wie aus den vorstehend genannten antimikrobiellen- und 60 Mäusetumordaten hervorgeht, ist Sandramycin nützlich als Antibiotikum und ebenfalls als Antitumormittel für die Hemmung von bösartigen Tumoren bei Mensch und Säugetier, wie die P-388-Leukämie.

Die Erfindung umfasst ebenfalls pharmazeutische Zu-65 sammensetzungen, die einen wirksamen antimikrobiellen oder tumorhemmenden Anteil Sandramycin enthalten. Üblicherweise werden sie mit einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel formuliert. Sol-

9

668 974

che Zusammensetzungen können ebenfalls andere aktive an-timikrobielle oder antitumoraktive Wirkstoffe enthalten und können in jede pharmazeutische Form verarbeitet werden, die für den gewünschten Weg der Verabreichung zweckmässig ist. Beispiele von solchen Zusammensetzungen umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Körner, flüssige Zusammensetzungen für die orale Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere, oder Zubereitungen für die parenterale Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können ebenfalls zu festen sterilen Zusammensetzungen verarbeitet werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder in irgend einem sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor Gebrauch aufgelöst werden können.

Für die Verwendung als antimikrobielles Mittel wird Sandramycin oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon in solcher Weise verabreicht, dass der aktive Bestandteil grösser ist als die minimale Hemmkonzentration für den besonderen Organismus, welcher behandelt wird. Für die Verwendung als Antitumormittel können die optimalen Dosen und Diäten von Sandramycin, die einem Menschen oder einem Säugetier zu verabreichen sind, leicht vom Fachmann festgestellt werden. Es muss selbstverständlich berücksichtigt werden, dass die tatsächlich verwendete Dosis von Sandramycin entsprechend der besonders formulierten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung und der Lage des Leidens, des Wirts und der zu behandelnden Krankheit variiert werden muss. Es müssen viele Faktoren, welche die Wirkung der Droge beeinflussen, in Betracht gezogen werden, einschliesslich Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Weg der Verabreichung, Grad der Ausscheidung, Bedingung des Patienten, Drogenkombinationen, Empfindlichkeiten auf die Wirkung und Ernsthaftigkeit des Leidens.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. «Skellysolve B» ist ein im Handel erhältliches Lösungsmittel auf Petrolbasis (Skelly Oil Co.), das isomere He-xane enthält und einen Siedepunkt von 60-69 C aufweist. «Dicalite» ist Diatomeenerde, die von Grefco Inc., Torrance, Californien hergestellt wird. Alle Temperaturangaben beziehen sich auf C wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1 Fermentation von Sandramycin

A. Schüttelflaschen-Fermentation:

Nocardioides sp. Stamm Nr. C49 009, ATCC 39 419 wurde ernährt und in Kultur-Reagenzgläser mit Hefe-Malz-extraktagar in Schräglage transferiert. Dieses Medium besteht aus 4,0 g Glucose, 4,0 g Hefeextrakt, 10,0 g Malzextrakt und 20,0 g Agar und wird mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter gebracht. Mit jedem Transfer wurde die Agar-Schrägkultur während 7 d bei 27 °C inkubiert. Zur Herstellung eines Inokulums für die Produktionsphase wurde das gewachsene Mycel von der Schrägkultur in einen 500 ml Er-lenmeyer-Kolben transferiert, der 100 ml steriles Medium, bestehend aus 30,0 g Glucose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Baumwollsamenembriomehl und 3,0 g CaC03, verdünnt auf 1 Liter mit entionisiertem Wasser, enthielt. Diese vegetative Kultur wurde bei 27 °C während 48 h auf einem Gyrotory-Reihenschüttler (Modell G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) inkubiert, gestellt auf 210 Umdrehungen/min, wobei ein Kreis mit 5,1 cm Durchmesser beschrieben wurde. 4 ml der vegetativen Kultur wurden in einem 400 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert, welcher 100 ml steriles Produktionsmedium enthielt das aus 20,0 g Saccharose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Leinsamenmehl und 5;0 g CaC03 in entionisiertem Wasser, aufgefüllt auf 1 Liter, enthielt. Die Produktionskultur wurde bei 27 C auf einem gleichen Schüttler, wie er für die vegetative Kultur verwendet wurde, inkubiert, wobei auf 250 Umdrehungen/min gestellt wurde. Nach 96 h wurde die Produktionskultur für die Isolierung von Sandramycin geerntet.

B. Bench-top-Fermentation:

Für die Herstellung von Sandramycin in einem Bench-top-Fermenter wurden 400 ml vegetative Kultur, wie in Beispiel 1 A beschrieben, in einen Fermenter (Microgen Model SF-116, New Brunswick Scientific Co., Inc.) transferiert, der

10 1 Produktionsmedium, das aus 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenmehl, 1 g (NH4)2S04 und 5 g CaC03 pro Liter entionisiertem Wasser enthielt. Die Temperatur wurde auf 27 °C gehalten, der Schüttelgrad entsprach 300 Umdrehungen/min und die Lufteinleitgeschwindigkeit betrug 8 1/min. Nach 202 h Inkubation wurde Sandramycin aus der Kultur isoliert.

C. Tankfermentation:

Für die Pilot-plant-Herstellung von Sandramycin wurden 2 1 vegetative Kultur (hergestellt gemäss dem Verfahren nach Beispiel 1 A) in einen Fermenter transferiert, der 301 eines Produktionsmediums enthielt, das aus 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenmehl, 1 g (NH4)2S04 und 5 g CaC03 pro Liter entionisiertem Wasser enthielt. Die Inkubationstemperatur betrug 26,5 C und die Lufteinleitgeschwindigkeit betrug 80 1/min, der Schüttelgrad betrug 375 Umdrehungen/min und der Gegendruck betrug eine Atmosphäre. Nach 183 h wurde geerntet für die Isolierung von Sandramycin.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung voti Sandramycin

Stufe A: Extraktion

Rohe Fermentationsbrühe (ungefähr 8 1) wurde in einen 20 1 Polyethylentank (48 cm Durchmesser oben, 44 cm Durchmesser unten, 55 cm Höhe), der unten mit einem Hahn ausgerüstet war, gebracht. Ein gleiches Volumen Ethylacetat wurde zugegeben. Die Mischung wurde mit einem luftgetriebenen Rührwerk mit einer guten Mischgeschwindigkeit während 30 min gerührt. Ungefähr 6 1 (2 kg) «Dicalite» wurden zugegeben und gemischt. Die Mischung wurde mit einem «Dicalite»-Pfropfen in einer Buchner-Nut-sche Nr. 12 filtriert. Das Filtrat wurde in einer 19 1 Lösungsmittelflasche, die mit einem Vakuumabzug ausgerüstet war, gesammelt. Das Material wurde mit 21 Ethylacetat gewaschen. Das Filtrar wurde in einen 20 1 Scheidetrichter transferiert, wobei sich die Phasen trennten. Der Ethylacetat-extrakt wurde entfernt und im Labormassstab in einem Glas-Rotationsverdampfer mit kontinuierlichem Zufluss auf

11 konzentriert. Das Konzentrat wurde weiter in einem Rotationsverdampfer abgedampft zu einem viskosen Öl, wobei 1,94 g Rohextrakt erhalten wurde.

Stufe B: Flüssig-flüssig-Verteilung des Rohextraktes

Der Rohextrakt aus Stufe A (1,94 g) wurde in einer Mischung von 200 ml Methanol und 200 ml «Skellysolve B» gelöst. Die zweiphasige Lösung wurde in einen 1 Liter-Scheidetrichter übergeführt und mit 22 ml Wasser verdünnt. Die Mischung wurde geschüttelt und die resultierenden Phasen liess man auftrennen. Das wässrige Methanol (untere Phase) wurde in einen zweiten 1 Liter-Scheidetrichter übergeführt und zwei mal mit 200 ml aliquoten Anteilen «Skellysolve B» extrahiert. Das Lösungsmittel «Skellysolve B» wurde vorher mit einem gleichen Volumen 10%igem Wasser-in-Methanol gesättigt. Die wässrige Methanolphase wurde mit 44 ml Wasser verdünnt und 3 mal mit 200 ml Portionen Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Der Tetrachlorkohlenstoff wurde vorher mit einem gleichen Volumen 50% Wasser-in-Me-thanol gesättigt. Die wässrige Methanolphase wurde mit 41 ml Wasser verdünnt und 3 mal mit 200 ml Portionen Chloroform extrahiert. Das Chloroform war vorher mit ei5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

668 974

10

nem gleichen Volumen 35% Wasser-in-Methanol gesättigt worden. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte wurden vereinigt und mit einem Rotationsverdampfer im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft, wobei 595 mg Rückstand A erhalten wurde. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockenheit eingedampft, wobei 458 mg Rückstand B erhalten wurden.

Stufe C: Verreibung der Rückstände A und B

Der Rückstand A (547 mg) und der Rückstand B (389 mg) die in Stufe B erhalten wurden, wurden vereinigt und in 30 ml einer Mischung von zwei Teilen Chloroform und einem Teil Methanol aufgelöst. Zur Lösung wurde «Dicalite» (17,4 g) gegeben und dann wurde durch Zugabe von 200 ml «Skellysolve B» eine Aufschlämmung hergestellt. Die Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer im Vakuum abgedampft. Das zurückbleibende Pulver wurde in 500 ml Toluol aufgeschlämmt und in eine 4,1 cm innere Weite x 45,7 cm Flash-Chromatographiesäule gepackt. Das «Dicalite» wurde in ein Bett gepackt, wobei der Fluss unter Druck erfolgte (N2-39,2 kPa/5,7 psi). Als das Packungslösungsmittel die Bettoberfläche erreichte, wurde der Fluss unterbrochen und der Druck der Säule entspannt. Eine Schicht Ottawa-Sand (ungefähr 2 cm) wurde auf die Oberfläche gegeben. Die Säule wurde dann unter Stickstoffdruck eluiert mit den folgenden elutropen Serien: Toluol (500 ml); Di-ethylether (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetra-hydrofuran (500 ml); und Methanol (500 ml). Das Toluol-elutionsmittel und das Packungsfiltrat wurden vereinigt (ungefähr 1 Liter) und zur Trockenheit im Vakuum auf einem Rotationsverdampfer abgedampft, wobei 0,699 g Rückstand C erhalten wurde.

Stufe D: Säulenchromatographie von Rückstand C

Eine 2,0 cm innere Weite x 30 cm Glenco-Säule wurde unter Aufschlämmung mit 37 g Woelm-Silicagel (0,060-0,200 mm, 70-230 mesh) in Chloroform gepackt. Der Rückstand C (0,699 g) auf Stufe C wurde in 5 ml Chloroform aufgelöst und oben auf die Säule appliziert. Die Probe liess man in das verpackte Säulenbett einsickern. Der Raum zwischen dem oberen Säulenende und dem Silicagelbett wurde mit Standard-Ottawa-Sand gefüllt. Die Säule wurde mit einem Glenco-Gradientenmischapparat verbunden und die Elution begann mit einem 21 linearen Gradienten von Chloroform bis 5% Methanol-in-Chloroform, wobei 20 x 100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde bis zur Trockenheit im Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde in 3 ml einer Mischung von zwei Teilen Chloroform und einem Teil Methanol gelöst. Aliquote Anteile (2 [il) jeder Fraktion wurden auf Analtech-Silicagel GHLF-Dünnschichtchromatographie-Platten aufgetupft. Die Platten wurden mit 5% Methanol- in-Chloro-form entwickelt und unter 254 nm und 360 nm Ultraviolettlicht betrachtet. Die Fraktion 6 wurde als homogen beurteilt. Der kristalline Rückstand der Fraktion 6 wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert, wobei 215 mg Sandramycin erhalten wurden. Dieses Material wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert, wobei 188 mg reines Sandramycin mit einem Schmelzpunkt von 208-212 C erhalten wurden.

Analyse für CfioH76Oi6Np 8H20:

berechnet: C, 52,78; H, 6,79; N, 12,31 gefunden: C, 52,58; H, 6,29; N, 12,29.

Beispiel 3

Isolierimg und Reinigung von Sandramycin in grösserem Massstab

Stufe A: Extraktion und Flüssigverteilung des Rohextraktes

Bei Wiederholung der Isolierungsverfahren, die in Beispiel 2 Stufen A und B beschrieben sind, wurden 1,12 g Rückstand A und 3,03 g Rückstand B aus der gesamten Fermentationsbrühe (8 1) erhalten.

5 Stufe B: Trituration der Rückstände A und B

Der in Stufe A erhaltene Rückstand A ( 1,12 g) wurde in 300 ml einer Mischung von zwei Teilen Chloroform und einem Teil Methanol aufgelöst. Zur Lösung wurden «Dicalite» (20 g) zugegeben. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trok-io kenheit im Vakuum in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml Toluol aufge-schlämmt und erneut zur Trockenheit eingedampft. Dies wurde ein zweites mal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde in 300 ml «Skellysolve B» aufgeschlämmt und zur 15 Trockenheit in einem Rotationsverdampfer eingedampft. Dies wurde ein zweites mal wiederholt. Der «Dicalite»-Rückstand wurde in 300 ml «Skellysolve B» aufgeschlämmt und in eine Flash-Chromatographiesäule mit den Massen 4,1 cm innere Weite x 45,7 cm gepackt. Das «Dicalite» 20 stand während dem Packen unter Druck (N2-39,3 kPa/5,7 psi) bei gleichzeitigem Durchfluss. Oben auf das Bett wurde eine Schicht Ottawa-Sand (ungefähr 2 cm) gepackt. Die Elution begann unter Stickstoffdruck durch die folgenden elutropen Serien: «Skellysolve B» (500 ml); Toluol (500 ml); 25 Diethylether (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetrahydrofuran (500 ml); und Methanol (500 ml). Das Elutionsmittel Toluol wurde bis zur Trockenheit im Vakuum in einem Rotationsverdampfer abgedampft, wobei 912.7 mg 30 Rückstand D erhalten wurden.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass der darin verwendete Rückstand A ersetzt wurde durch 3,03 g Rückstand B, wobei 766,7 mg Rückstand E aus dem Elutionsmittel Toluol erhal-35 ten wurden.

Das vorstehend in Beispiel 3 in den Stufen A und B beschriebene Verfahren wurde mit der Ausnahme wiederholt, dass die erhaltenen und darin verwendeten Rückstände A und B durch 1,5 g bzw. 1,97 g Rückstand A' bzw. B' ersetzt 40 wurden, wobei 993,9 mg Rückstand D' bzw. 693 mg Rückstand E' aus dem Elutionsmittel Toluol erhalten wurden.

Stufe C: Säulenchromatographie der Rückstände D und E

Eine Glenco-Säule mit den Massen 2 cm innere Weite x 45 30 cm wurde durch Aufschlämmung mit 40 g Woelm-Silicagel (0,063-0,200 mm, 70-230 mesh) in Chloroform gepackt. Die Säule wurde in ein Mitteldruck HPLC-System eingefügt und mit Chloroform equilibriert. Die Rückstände D, D', E und E' aus Stufe B wurden vereinigt (ungefähr 3,366 g) und so in 6 ml Chloroform aufgelöst. Die Lösung wurde auf eine 15 ml Probeschlaufe aufgezogen. Die Probeschlaufe wurde in das Mitteldruck HPLC-System eingefügt und die Probe wurde auf die Säule mit 201 Chloroform gepumpt. Die Elution begann mit 2 1 eines linearen Gradienten aus Chloro-55 form bis 5% Methanol-in-Chloroform, wobei 17 x 117 ml Fraktionen gesammelt wurden. Aliquote Anteile (6 jj.1) jeder Fraktion wurden durch Dünnschichtchromographie getestet, wobei 5% Methanol-in-Chloroform als Elutionsmittel verwendet wurden und die Platte mit 366 nm Licht betrachtet 60 wurde. Die Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trok-kenheit eingedampft, wobei 2,166 g Rückstand F erhalten wurden. Die Fraktionen 7-12 wurden vereinigt und zur Trockenheit im Vakuum mit einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand (953 mg) wurde in 6 ml Chlo-65 roform aufgelöst und wie vorstehend beschrieben rechroma-tographiert, wobei 21 eines linearen Gradienten von Chloroform bis 1,5% Methanol-in-Chloroform verwendet wurden und 20 x 100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Frak-

11

668 974

tionen 9 20 wurden vereinigt und bis zur Trockenheit in einem Rotationsverdampfer abgedampft, wobei 860 mg Rückstand G erhalten wurden.

Die Rückstände F und G wurden vereinigt und aus

Chloroform-Methanol umkristallisiert, wobei 1,985 g reines Sandramycin erhalten wurde, welches identisch war mit dem Produkt, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 2 erhalten worden war.

Claims (7)

1. 668 974
2. 2. Sandramycin gemäss Anspruch 1 als Mittel gegen bakterielle Infektionen.

   2

   PATENTAN SPRÜCHE 1. Sandramycin der Formel

   OH

   CONH-CH-CO-N ÇH,

   O

   CH, CH,

   r... CH

   ÇH, ÇH,J

   0-NHCH,-C0-N-CH,-C0-N-CH

   I

   CO

   CO

   I i

   ÇH—N—CO—CHj-N-CO-CHjNH-CO

   CH CH» CH»

   crf", tH,
3. 3. Sandramycin gemäss Anspruch 1 als Mittel gegen bösartige Tumore, die auf Sandramycin empfindlich sind.
4. 4. Verfahren für die Herstellung des Antitumor-Antibio-tikums Sandramycin gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sandramycin produzierender Stamm von Nocardioides sp. nov. mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC

   39 419 oder ein Mutant davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert wird.
5. 5. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Nocardioides sp. ATCC 39 419, der befähigt ist, das Antitumor-Antibiotikum Sandramycin gemäss der Formel im Anspruch 1 in nachweisbarer Qualität herzustellen, wenn er unter submersen Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert wird.
6. 6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen antibakteriell wirksamen Anteil Sandramycin gemäss Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel.
7. 7. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen tumorhemmend wirksamen Anteil Sandramycin gemäss Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel.