DE602004010667T2

DE602004010667T2 - Zytotoxische depsipeptide

Info

Publication number: DE602004010667T2
Application number: DE602004010667T
Authority: DE
Inventors: Paco Onzonilla Romero; Leyre Onzonilla Malet; Librada Maria Onzonilla CANEDO; Carmen Colmenar Viejo Cuevas; Jose Colmenar Viejo Fernando Reyes
Original assignee: Instituto Biomar SA
Current assignee: Instituto Biomar SA
Priority date: 2003-06-24
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2024-06-24
Also published as: PT1644403E; EA010585B1; CN1839148A; EP1644403B1; MXPA05013946A; ATE380821T1; IL172538A0; EA200600092A1; JP4554606B2; US20080227765A9; NO20060361L; WO2005000880A2; GB0314726D0; PL1644403T3; IL172538A; CN100448889C; KR20060035633A; CA2529371A1; DE602004010667D1; ES2297441T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Depsipeptidverbindungen, sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Verwendung als Antitumormittel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verschiedene cyclische Peptide, erhalten aus Meeresorganismen, sind offenbart worden (siehe zum Beispiel Rudi A. et al., J. Nat. Prod., 2003, 66, 575–577: „Didmolamide A and B, two new cyclic hexapeptides from the marine Ascidian Didemnum molle" (Didmolamid A und B, zwei neue cyclische Hexapeptide aus dem Meeresmanteltierchen Didemnum molle)).
JP 11180997 offenbart eine Antitumorverbindung der Formel
welche von Streptomyces nobilis erhalten wird. Ihre IC₅₀ in Hela-S3-Zellen beträgt 14 nM.
Krebs ist eine führende Todesursache bei Tieren und Menschen. Verschiedene Anstrengungen sind unternommen worden und werden es noch, um ein Antitumormittel zu erhalten, das aktiv und sicher an Patienten verabreicht werden soll, die an einem Krebs leiden. Das Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, ist, Verbindungen bereitzustellen, die bei der Behandlung von Krebs nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verbindungen der allgemeinen Formel I oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Stereoisomere davon gerichtet:
wobei:
die R₁-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyliden, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind;
die R₃-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind;
die R₄-Gruppen jeweils unabhängig aus NR₂, O und S ausgewählt sind; und
die R₂-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch den Erhalt der Verbindungen der Formel I, einschließlich der Verbindung, die wir IB-01211 nennen, welche die Formel hat:
IB-01211 kann von einem Stamm von Mikroorganismen erhalten werden, der fähig ist, es zu erzeugen. Das bevorzugte Verfahren umfaßt die Schritte, einen Stamm von Mikroorganismen zu kultivieren, der fähig ist, IB-01211 in einem wässerigen Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Salzen unter kontrollierten submersen aeroben Bedingungen zu erzeugen, und dann die Verbindung aus der Kulturbrühe zu gewinnen und zu reinigen.
Andere Verbindungen dieser Erfindung können von IB-01211 abgeleitet werden oder können durch Synthese hergestellt werden. So kann das Oxazol/Thiazol/Imidazol-Fragment der Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Verwendung der Lehre der folgenden Literatur synthetisiert werden: Panek J. S. et al. „Studies directed toward the synthesis of Ulapualide A. Asymmetric Synthesis of the C8-C25 tris-oxazole fragment" ("Studien, gerichtet auf die Synthese von Ulapualid A. Asymmetrische Synthese des C8-C25-tris-Oxazol-Fragments") J. Org. Chem. 1996, 61, 6496–6497; Panek J. S. et al. „Studies directed toward the total synthesis of kabiramide C: asymmetric synthesis of the C7-C19 fragment" („Studien gerichtet auf die Totalsynthese von Kabiramid C; asymmetrische Synthese des C7–C19-Fragments") Tetrahedron Lett. 1998, 39, 6143–6146; Panek J. S. et al. „Synthesis of the fully functionalized tris-oxazole fragment found in metabolites derived from marine organisms" („Synthese des voll funktionalisierten tris-Oxazol-Fragments, gefunden in Metaboliten, abgeleitet von Meeresorganismen") Tetrahedron Lett. 1997, 38, 5445–5448; Pattenden G. "Synthetic studies with natural oxazoles and thiazoles" ("Synthesestudien mit natürlichen Oxazolen und Thiazolen") J. Heterocyclic Chem. 1992, 29, 607–618; Pattenden G. et al. „Synthesis of the tris-oxazole ring system of ulapualides" („Synthese des tris-Oxazol-Ringsystems von Ulapualiden") Synlett. 1990, 36–37; Kiso Y. et al. "Convergent synthesis of (–)-mirabazole C using a chloroimidazolidium coupling reagent, CIP" ("Konvergente Synthese von (–)-Mirabazol C unter Verwendung eines Chlorimidazolidium-Kupplungsreagenzes, CIP") J. Org. Chem. 1996, 61, 3350–3357; Wipf P. et al. "Total synthesis of (–)-thiangazole and structurally related polyazoles" ("Totalsynthese von (–)-Thiangazol und strukturell verwandten Polyazolen") J. Org. Chem. 1995, 60, 7224–7229; Wipf P. et al. "A new synthesis of highly functionalised oxazoles" ("Eine neue Synthese von hoch funktionalisierten Oxazolen") J. Org. Chem. 1993, 58, 3604–3606. Sobald das Oxazol/Thiazol/Imidazol-Fragment synthetisiert ist, wird das aminosaure Fragment durch Verwendung von dem Fachmann bereits bekannten herkömmlichen Verfahren der Peptidsynthese eingeführt.
So können Verbindungen der Formel I einschließlich IB-01211 durch Kuppeln der folgenden Komponenten:
wo R₁, R₂, R₃, R₄ wie definiert sind, Prot^OH eine optionale Schutzgruppe für Hydroxy ist und Prot^NH eine optionale Schutzgruppe für Amino ist, hergestellt werden. Je nach Bedarf können die entsprechenden Schutzgruppen durch andere reaktive Gruppen ersetzt werden, um die gewünschte Kupplung zu fördern, welche typischerweise nacheinander stattfindet, zuerst, um das Oxazol/Thiazol/Imidazol-Fragment mit einem Ende des aminosauren Fragments zu verbinden, und dann, um den Ring zu schließen.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, die eine Verbindung der Formel I oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Stereoisomere davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung ebenfalls auf die Verwendung von Verbindungen der Formel I oder pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Stereoisomeren davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs gerichtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 HPLC/UV-Chromatogramm und UV-Spektrum von gereinigtem IB-01211
2 IR-Spektrum von gereinigtem IB-01211
3 ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem IB-01211
4 ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem IB-01211
5 DEPT-Spektrum von gereinigtem IB-01211
6 COSY-45-Spektrum von gereinigtem IB-01211
7 HMQC-Spektrum von gereinigtem IB-01211
8 HMBC-Spektrum von gereinigtem IB-01211
9 HPLC/MS-Chromatogramm und ESI-MS-Spektrum von gereinigtem IB-01211
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel I, wie sie vorstehend definiert sind.
In diesen Verbindungen können die Substituenten entsprechend der folgenden Anleitung ausgewählt werden:
Alkyl- und Alkoxygruppen haben vorzugsweise von 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Eine stärker bevorzugte Klasse von Alkylgruppen hat 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatome, noch stärker bevorzugt 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome und am meisten bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome. Methyl, Ethyl, Propyl einschließlich Isopropyl, und Butyl einschließlich Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl sind besonders bevorzugte Alkylgruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff Alkyl, wenn nicht anderweitig modifiziert, sowohl cyclische als auch nichtcyclische Gruppen, obwohl cyclische Gruppen mindestens drei Kohlenstoffringglieder umfassen werden.
Alkylidengruppen können verzweigt oder unverzweigt sein und haben vorzugsweise von 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Eine starker bevorzugte Klasse von Alkylidengruppen hat von 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatome, noch starker bevorzugt von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome und am meisten bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome. Methyliden, Ethyliden und Propyliden einschließlich Isopropyliden sind besonders bevorzugte Alkylidengruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Alkenyl- und Alkinylgruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben eine oder mehrere ungesättigte Bindungen und von 2 bis etwa 12 Kohlenstoffatome, starker bevorzugt 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatome, noch stärker bevorzugt 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome, sogar noch starker bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome. Die Begriffe Alkenyl und Alkinyl, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen sowohl cyclische als auch nichtcyclische Gruppen, obwohl gerade oder verzweigte nichtcyclische Gruppen im allgemeinen starker bevorzugt werden. In einem allgemeinen Sinn schließen wir Alkyliden in Alkenyl ein, indem sie beide Substituenten mit einer Doppelbindung sind.
Zu geeigneten Arylgruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung gehören Verbindungen mit einfachem und mehrfachem Ring, zu denen Verbindungen mit mehrfachem Ring gehören, die gesonderte und/oder kondensierte Arylgruppen enthalten. Typische Arylgruppen enthalten von 1 bis 3 gesonderte oder kondensierte Ringe und von 6 bis etwa 18 Kohlenstoffringatome. Zu speziell bevorzugten Arylgruppen gehören substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Phenanthryl und Anthracyl.
Zu geeigneten Acylgruppen gehören Alkanoylgruppen, welche von 2 bis etwa 12 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt von 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatome, noch stärker bevorzugt von 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome, sogar noch stärker bevorzugt 2 Kohlenstoffatome haben. Zu anderen Acylgruppen gehören Alkenylacyl, Alkinylacyl, Arylacyl, Heterocyclylacyl.
Zu geeigneten heterocyclischen Gruppen gehören heteroaromatische und heteroalicyclische Gruppen. Geeignete heteroaromatische Gruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten ein, zwei oder drei Heteroatome, ausgewählt aus N-, O- oder S-Atomen, und dazu gehören z. B. Cumarinyl einschließlich 8-Cumarinyl, Chinolinyl einschließlich 8-Chinolinyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidyl, Furyl, Pyrrolyl, Thienyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Indolyl, Benzofuranyl und Benzothiazol. Geeignete heteroalicyclische Gruppen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten ein, zwei oder drei Heteroatome, ausgewählt aus N-, O- oder S-Atomen, und dazu gehören z. B. Tetrahydrofuranyl-, Tetrahydropyranyl-, Piperidinyl-, Morpholino- und Pyrrolidinylgruppen.
Die vorstehend erwähnten Gruppen können an einer oder mehreren verfügbaren Positionen durch eine oder mehrere geeignete Gruppen, wie beispielsweise OR', SR', SOR', SO₂R', NO₂, NHR', N(R')₂, NHCOR', N(COR')₂, NHSO₂R', CN, Halogen, C(=O)R', CO₂R', OC(=O)R', substituiert sein, wobei jede der R'-Gruppen unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus H, OH, NO₂, NH₂, SH, CN, Halogen, C(=O)H, C(=O)Alkyl, CO₂H, substituiertem oder unsubstituiertem C₁-C₁₈-Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem C₂-C₁₈-Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem C₂-C₁₈-Alkinyl und substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, ausgewählt ist.
Zu geeigneten Halogensubstituenten in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung gehören F, Cl, Br und I.
Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezeichnet ein pharmazeutisch verträgliches Salz, einen Ester, ein Solvat, Hydrat oder eine andere Verbindung, welche bei Verabreichung an den Patienten imstande ist, (direkt oder indirekt) eine Verbindung wie hier beschrieben bereitzustellen. Es wird jedoch erkannt, daß nicht pharmazeutisch verträgliche Salze ebenfalls in den Bereich der Erfindung fallen, da diese bei der Herstellung von pharmazeutisch verträglichen Salzen verwendbar sein können. Die Herstellung von Salzen kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren ausgeführt werden.
Zum Beispiel werden pharmazeutisch vertragliche Salze von hier bereitgestellten Verbindungen aus der Stammverbindung, welche eine basische oder saure Einheit enthält, nach herkömmlichen chemischen Verfahren synthetisiert. Im allgemeinen werden derartige Salze zum Beispiel durch Umsetzen der freien Säure- oder Baseformen dieser Verbindungen mit einer stöchiometrischen Menge der geeigneten Base oder Säure in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel oder in einem Gemisch der zwei hergestellt. Im allgemeinen werden nicht-wässerige Medien wie Ether, Ethylacetat, Ethanol, Isopropanol oder Acetonitril bevorzugt. Zu Beispielen der Säureadditionssalze gehören Mineralsäureadditionssalze wie zum Beispiel Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, Sulfat, Nitrat, Phosphat und organische Säureadditionssalze wie zum Beispiel Acetat, Maleat, Fumarat, Citrat, Oxalat, Succinat, Tartrat, Malat, Mandelat, Methansulfonat und p-Toluolsulfonat. Zu Beispielen der Alkaliadditionssalze gehören anorganische Salze wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Calcium- und Ammoniumsalze und organische Alkalisalze wie zum Beispiel Ethylendiamin, Ethanolamin, N,N-Dialkylenethanolamin, Triethanolamin und Salze von basischen Aminosäuren.
Die Verbindungen der Erfindung können in kristalliner Form entweder als freie Verbindungen oder als Solvate (z. B. Hydrate) vorliegen, und es ist beabsichtigt, daß beide Formen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind. Verfahren der Solvatation sind auf dem Fachgebiet im allgemeinen bekannt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch die vorstehend beschriebene Formel I, können Enantiomere abhängig von ihrer Asymmetrie oder Diastereoisomere einschließen. Die einzelnen Isomere und Gemische der Isomere fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind diejenigen der allgemeinen Formel II
wobei R₁-, R₂-, R₃- und R₄-Gruppen die gleiche Bedeutung wie vorstehend definiert haben.
Bevorzugte R₁-Gruppen sind substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl und substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden, starker bevorzugt sind substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₆-Alkyl und substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₆-Alkyliden, noch stärker bevorzugt sind Isopropyl, sec-Butyl und Methylen. Bevorzugte R₂-Gruppen sind H und substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, und starker bevorzugt ist H. Bevorzugte R₃-Gruppen sind H und substituiertes oder unsubstituiertes Aryl und starker bevorzugt sind H und Phenyl. Eine bevorzugte R₄-Gruppe ist O.
Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel I ist die Verbindung IB-01211:
Die bevorzugte Stereochemie der vorstehend erwähnten Verbindung ist die folgende
Die Verbindung IB-01211 wird vorzugsweise von einem Actinomyceten, genannt Stamm ES7-008, erhalten. Eine Kultur dieses Stammes wurde in der Colección Española de Cultivos Tipo an der Universität von Valencia in Spanien unter der Zugangsnummer CECT 3358 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages gemacht.
Der Mikroorganismenstamm ES7-008 steht phylogenetisch der Thermoactinomyces-Gattung nahe. Der Organismus wurde aus einem unidentifizierten Meeresschwamm isoliert. Die taxonomischen Verfahren waren wie folgt.
1. Kolonienmorphologie:

ISP-Medien Nr. 2, 4, 5 und 6: Shirling, B. E., und D. Gotlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313, 1966
ATCC-Medium Nr. 172: American Type Culture Catalog, 17. Auflage, 1989, Rockville, Maryland, USA
Czapek-Agar, Difco
Bennet-Agar, Waksman, S. A., The Actinomycetes Bd. II: 331, 1961
Alle Medien wurden mit 50% ASW ergänzt.

2. Physiologische charakteristische Eigenschaften:

ISP-Medium Nr. 1, Shirling und Gotlieb.
NaCl-Resistenz: ATCC 172 mit 0, 2, 4, 5, 7 und 10% NaCl.
Kohlenstoffnutzung: ISP-9, Shirling und Gotlieb.

3. Analyse der Fettsäuren:

Shirling, B. E., und D. Gotlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313, 1966

4. Zucker-Analyse der ganzen Zelle:

Guerrant, G. O., und C. W. Moss, Anal. Chem. 56: 633, 1984

5. Diaminopinelinsäuren-Analyse:

Hasegaw, T., M. Takizawa und S. Tanida, J. Gen. Appl. Microbiol. 29: 319, 1983.

Alle Kulturen wurden bei 28°C inkubiert und Aufzeichnungen von Ergebnissen wurden wöchentlich bis zu 21 Tage gemacht.
Eine Beschreibung des Organismus ist wie folgt:
Morphologie:
Nach 21 Tagen bei 28°C wurde Wachstum in ISP2 und 172-Nährbrühe, ergänzt mit künstlichem Meerwasser (ASW), beobachtet. Es wurde kein Luftmycel erzeugt. Das Substratmycel war verzweigt. Sporen werden sowohl in fester als auch in flüssigem Medium als Endosporen erzeugt.
Physiologie:
Durch den Stamm ES7-008 wurden keine diffundierbaren Pigmente erzeugt, weder auf festen noch auf flüssigen Medien. Das Optimum der NaCl-Konzentration in dem Medium für optimales Wachstum war in dem 4%–7%-Bereich. Wachstum erfolgte nicht bei 28°C in Abwesenheit von Salz, sogar in reichen Medienzusammensetzungen wie ATCC-172-Medium. Der Bereich der optimalen Wachstumstemperatur war zwischen 28°C–40°C.
Der Stamm ES7-008 kann Glucose, Melibiose, Xylose und Ethanol als Kohlenstoffquellen nutzen. Das Wachstum war schlecht auf Fructose, Saccharose, Rhamnose und Galactose. Der Organismus wuchs nicht auf Arabinose, Mannose oder myo-Inositol.
Chemische Zusammensetzung:
Aminosäuren:
Meso-2,6-Diaminopimelinsäure war in der hydrolysierten ganzen Zelle von Stamm ES7-008 vorhanden.
Zusammensetzung der Fettsäuren:

Die hauptsächlichen Fettsäuren wurden als i-15:0, a-15:0, 15:0, i-16:0, i-17:1, i-17:0 und a-17:0 identifiziert. Die Zusammensetzung der Fettsäuren von Stamm ES7-008 und anderen Actinomyceten-Stämmen ist in der folgenden Tabelle, wo die Zusammensetzung als Prozentgehalt vom Gesamtgehalt der Fettsäuren gegeben ist.

	13:0	i-14:0	14:0	i-15:0	a-15:0	15:0	i-16:1	i-16:0
ES7-008	< 1	< 1	< 1	< 1	64,2	6,29	1,36	< 1
STALBUS	< 1	6,52	< 1	9,88	22,92	< 1	5,50	25,29
SPAMETH	1,21	10,34	< 1	1,86	< 1	4,30	< 1	15,51
SPVIRIDO	< 1	4,04	1,10	18,94	2,71	4,89	< 1	26,44
AMCITRE	< 1	< 1	3,18	< 1	< 1	1,03	< 1	6,37
APBRAZIL	< 1	3,15	< 1	15,46	18,91	2,76	< 1	19,07
AMPDIGIT	< 1	11,57	< 1	11,21	9,96	< 1	2,87	34,23
AMYORIE	< 1	3,40	2,37	19,94	4,66	1,17	< 1	11,85
MNCHALC	< 1	1,68	< 1	8,91	2,29	1,53	1,15	38,23
MNECHCA	< 1	1,17	< 1	6,97	1,24	2,81	< 1	30,88
MNFUSCA	< 1	< 1	< 1	26,56	6,53	< 1	< 1	8,58
SACCAER	< 1	3,06	1,35	14,41	8,62	1,04	5,68	20,07
NOAFRI	1,51	5,43	3,35	4,62	< 1	7,46	3,09	22,18
MTSALMO	< 1	1,12	1,28	6,75	< 1	7,83	7,53	21,58
MTRUBRA	< 1	1,40	1,38	4,12	< 1	3,41	7,27	25,00
MTROSEO	2,03	3,65	5,14	3,86	< 1	9,03	3,02	12,31
AMROSEO	< 1	2,19	1,24	6,73	1,09	6,94	1,43	22,21
MTFERRU	1,03	1,91	1,19	1,94	< 1	6,43	4,12	21,50

	16:1	16:0	i-17:1	i-17:0	a-17:0	17:1	17:0
ES7-008	4,52	< 1	< 1	14,68	4,14	1,45	< 1
STALBUS	< 1	3,75	1,28	3,38	8,60	< 1	< 1
SPAMETH	5,63	8,62	1,08	< 1	< 1	24,02	9,43
SPVIRIDO	< 1	4,43	< 1	2,60	1,58	11,36	8,58
AMCITRE	12,62	40	< 1	< 1	< 1	< 1	1,16
APBRAZIL	2,15	1,79	< 1	2,39	9,64	11,18	2,82
AMPDIGIT	< 1	1,08	< 1	1,28	5,08	4,39	1,64
AMYORIE	5,59	18,41	< 1	2,99	4,44	3,09	2,73
MNCHALC	< 1	1,88	1,49	2,32	2,25	5,43	6,95
MNECHCA	< 1	2,29	1,63	4,11	1,68	12,15	4,90
MNFUSCA	< 1	< 1	7,30	11,89	13,25	2,90	3,37
SACCAER	13,84	6,16	4,55	2,20	5,31	2,02	< 1
NOAFRI	2,69	5,15	2,35	< 1	< 1	8,15	4,75
MTSALMO	1,21	1,97	1,01	< 1	1,07	11,58	5,53
MTRUBRA	2,63	3,89	2,17	1,08	< 1	6,84	4,97
MTROSEO	3,46	6,95	1,17	< 1	< 1	13,51	4,46
AMROSEO	2,21	3,61	2,74	1,03	< 1	10,97	4,33
MTFERRU	2,32	2,34	< 1	< 1	< 1	23,51	5,71

	i-18:1	i-18:0	cis-18:1	18:0
ES7-008	< 1	< 1	< 1	< 1
STALBUS	< 1	1,09	< 1	< 1
SPAMETH	7,11	< 1	4,60	1,04
SPVIRIDO	7,48	< 1	< 1	1,16
AMCITRE	< 1	< 1	14,25	2,82
APBRAZIL	< 1	< 1	3,38	1,06
AMPDIGIT	< 1	1,76	7,60	1,54
AMYORIE	< 1	< 1	6,21	3,04
MNCHALC	14,58	1,31	1,28	2,68
MNECHCA	7,23	< 1	10,05	1,69
MNFUSCA	3,59	< 1	2,33	1,94
SACCAER	< 1	< 1	< 1	1,43
NOAFRI	17,03	< 1	< 1	1,23
MTSALMO	17,34	< 1	< 1	< 1
MTRUBRA	15,44	1,25	< 1	1,61
MTROSEO	18,67	< 1	1,77	< 1
AMROSEO	17,84	< 1	< 1	< 1
MTFERRU	12,15	1,27	1,43	< 1

ES7-008 = Stamm ES25-008; AMCITRE = Actinomadura citrea DSM 43461; AMPDIGIT = Ampullariella digitata ATCC 15349; AMROSEO = Actinomadura roseoviolacea DSM 43144; AMYORIE = Amycolatopsis orientalis DSM 40040; APBRAZIL = Actinoplanes braziliensis ATCC 25844; MNCHALC = Micromonospora chalcea ATCC 31395; MNECHCA = Micromonospora echinospora calichinensis NRRL 15839; MNFUSCA = Micromonospora fusca NRRL B-3298; MTFERRU = Microtetraspora ferruginea DSM 43553; MTROSEO = Microtetraspora roseola ATCC 33579; MTRUBRA = Microtetraspora rubra ATCC 27031; MTSALMO = Microtetraspora salmonea ATCC 33580; NOAFRI = Nocardiopsis africana DSM 43748; SACCAER = Saccharothrix aerocolonigenes NRRL B-3298; SPAMETH = Streptosporangium amethystogenes DSM 43179; SPVIRDO = Streptosporangium viridogriseum ATCC 25242; STALBUS = Streptomyces albus DSM 40313

Zucker:
Die Zuckerstruktur der ganzen Zelle zeigte kein spezifisches Profil.
Phylogenetische Analyse:
Die partielle Sequenz von 16S-rDNA wurde durchgeführt, indem folgenden Standardprozeduren gefolgt wurde. Die DNA des Organismus wurde nach Homogenisierung unter flüssigem Stickstoff extrahiert. Das 16S-rDNA-Gen wurde durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der eubakteriellen Primer 27f und 1492r amplifiziert. Die partiellen Sequenzen wurden unter Verwendung der Primer 357r, 926r und 1492r erhalten. Alle die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden von Lane, D. J., Nucleic acid techniques in bacterial systematics: 115, 1992 beschrieben. Die erhaltene partielle Sequenz war:
Diese Sequenz wurde mit der Genbank-Hinterlegung konfrontiert, wobei der Blastn-Algorithmus verwendet wurde. Die phylogenetischen Studien wurden unter Verwendung der Phylip-Packung, entwickelt von Felsenstein, J. Cladistics 5: 164, 1989, durchgeführt. Ein phylogenetischer Consensus-Baum wurde nach Bootstrapping der Probe konstruiert. Der Stamm ES7-008 wurde mit der Thermoactinomyces-Gruppe gruppiert. Ein differenzierendes Merkmal von Stamm ES7-008 mit Thermoactinomyces ist ein Fehlen von Luftmycel und die Notwendigkeit von Salz zum Wachstum.
Fermentation:
ES7-008 erzeugt die Verbindung IB-01211, wenn es unter kontrollierten Bedingungen in einem geeigneten Medium kultiviert wird. Dieser Stamm wird vorzugsweise in einem wässerigen Nährmedium unter aeroben und mesophilen Bedingungen, vorzugsweise bei 28°C–40°C und bei einem pH im Bereich zwischen 6,0 und 8,0, gezüchtet. Eine breite Vielfalt von flüssigen Kulturmedien kann für die Kultivierung des Organismus verwendet werden. Verwendbare Medien sind diejenigen, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Starke, Dextrin, Zuckermelasse, Glucose, eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie beispielsweise Protein, hydrolysiertes Protein, entfettete Mehle, Maisquellwasser, und verwendbare anorganische Anionen und Kationen, wie beispielsweise Natrium, Magnesium, Kalium, Ammonium, Sulfat, Chlorid, Phosphat, Carbonat, einschließen. Spurenelemente können ebenfalls hinzugegeben werden. Belüftung wird vorzugsweise durch Zuführen von Luft zu dem Fermentationsmedium erreicht. Bewegung wird durch ein mechanisches Rührwerk bereitgestellt. Es wurde gefunden, daß herkömmliche Fermentationstanks zum Ausführen der Kultivierung dieses Organismus gut geeignet sind. Die Zugabe von Nährstoffen und pH-Kontrolle ebenso wie Antischaummittel während der unterschiedlichen Stadien der Fermentation können zum Vergrößern der Produktion und Vermeiden von Schäumen benötigt werden.

Die Verbindung IB-01211 kann hergestellt werden, indem von einem gefrorenen lyophilisierten Mycel von ES7-008 ausgegangen wird. Eine Mycelmasse wird durch Kultivieren der anfänglichen Zellen in Schüttelflaschen mit einem Kulturmedium, enthaltend einige von den vorstehend beschriebenen Bestandteilen, bei mesophilen Temperaturen und unter aeroben Bedingungen erhalten. Dieser Schritt kann mehrere Male wie benötigt wiederholt werden und das gesammelte Material wird als Inokulum verwendet, um einen oder mehrere Fermentationstanks mit dem geeigneten Kulturmedium zu beimpfen. Wenn es gewünscht wird, können diese Tanks zum Entwickeln des Inokulums oder für das Produktionsstadium, abhängig von dem benötigten Nährbrühevolumen, verwendet werden. Manchmal kann das Produktionsmedium verschieden von denen sein, die für die Entwicklung des Inokulums verwendet werden. Typische Medien werden offenbart, die für die Inokulumentwicklung und für die Herstellung von IB-01211 verwendet werden können, sie sind in der folgenden Tabelle.

Inokulummedium		Produktionsmedium
Sojabohnenmehl	5 g	Hefe	5 g
Glucose	1 g	Pepton	1 g
Stärke	24 g	Sojabohnenmehl	3 g
Rindleischextrakt	3 g	Sojabohnenschrot	15 g
Hefeextrakt	5 g	Hefeextrakt	5 g
Trypton	5 g	Trypton	2 g
CaCO₃	4 g	CaCO₃	4 g
NaCl	5 g	NaCl	4 g
Na₂SO₄	7 g	Na₂SO₄	1 g
KCl	0,2 g	KCl	0,5 g
MgCl₂	2 g	MgCl₂	2 g
H₂O	Zu 1 Liter	K₂HPO₄	0,5 g
		H₂O	Zu 1 Liter

Die Herstellung von IB-01211 kann durch Assay der gesamten Nährbrühe gegen Mäuseleukämie P-388 oder durch HPLC überwacht werden.
Die Verbindung IB-01211 kann aus dem Mycelkuchen durch Extraktion mit einem geeigneten Gemisch von Lösungsmitteln wie beispielsweise CHCl₃:CH₃OH:H₂O isoliert werden. Die Aktivität ist in der unteren Schicht konzentriert. Die Extrakte aus zwei wiederholten Extraktionen können vereinigt werden und im Vakuum zur Trockene eingedampft werden.
Die Abtrennung und Reinigung von IB-01211 am dem rohen aktiven Extrakt kann unter Verwendung der richtigen Kombination von herkömmlichen chromatographischen Techniken durchgeführt werden.
Die Fraktionierung kann durch die Antitumoraktivität von Fraktionen, durch TLC, visualisiert mit Vanillin in konzentrierter H₂SO₄, oder durch analytische HPLC mit Photodiodenarray und MS-Detektor geleitet werden. Die HPLC-Analyse wird bei Raumtemperatur unter Verwendung einer analytischen Säule. Symmetry C18 (5 μ) und einer mobilen Phase MeOH:H₂O:HOAc 95:5:1 mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min durchgeführt und bei 260 nm aufgetragen. Bei diesen Bedingungen beträgt die IB-01211-Retentionszeit 5,1 min, wie in 9 gezeigt wird.
Ein wichtiges Merkmal der vorstehend beschriebenen Verbindungen ist ihre Bioaktivität und insbesondere ihre cytotoxische Aktivität. Mit dieser Erfindung stellen wir neue pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Verbindungen, die cytotoxische Aktivität besitzen, und ihre Verwendung als Antitumormittel bereit. So stellt die vorliegende Erfindung weiter pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine Verbindung dieser Erfindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Stereoisomer davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, bereit.
Zu Beispielen pharmazeutischer Zusammensetzungen gehören eine feste (Tabletten, Pillen, Kapseln, Körnchen usw.) oder flüssige (Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) geeignete Zusammensetzung für orale, topische oder parenterale Verabreichung.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Erfindung enthalten, können durch Liposom- oder Nanosphäreneinkapselung, in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder durch andere standardmäßige Zuführungsmittel zugeführt werden.
Die Verabreichung der Verbindungen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, wie beispielsweise intravenöse Infusion, orale Zubereitungen, intraperitoneale und intravenöse Verabreichung geschehen. Wir bevorzugen, daß Infusionszeiten von bis zu 24 Stunden verwendet werden, stärker bevorzugt 1–12 Stunden, wobei 2–6 Stunden am meisten bevorzugt werden. Kurze Infusionszeiten, welche erlauben, daß eine Behandlung ohne Übernachtung im Krankenhaus ausgeführt wird, sind besonders wünschenswert. Jedoch kann eine Infusion 12 bis 24 Stunden oder sogar länger, wenn erforderlich, sein. Infusion kann in geeigneten Intervallen von sagen wir 1 bis 4 Wochen ausgeführt werden.
Die korrekte Dosierung der Verbindungen variiert entsprechend der speziellen Formulierung, der Art der Verabfolgung und dem speziellen Situs, Wirt und Tumor, der behandelt wird. Andere Faktoren wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Zeit der Verabreichung, Geschwindigkeit der Exkretion, Zustand des Wirts, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit sollen in Betracht gezogen werden. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis ausgeführt werden.
Die Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung können mit anderen Arzneimitteln verwendet werden, um eine Kombinationstherapie bereitzustellen. Die anderen Arzneimittel können einen Teil der gleichen Zusammensetzung bilden oder als gesonderte Zusammensetzung zur Verabreichung zur gleichen Zeit oder zu anderer Zeit bereitgestellt werden.
BEISPIELE DER ERFINDUNG
BEISPIEL 1: Herstellung von IB-01211
Inokulum-Entwicklung: Eine gefrorene Kultur von ES7-008 oder eine in eine Vertiefung gewachsene Schrägröhrchenkultur (5 Vol.-%) wird verwendet, um 100 ml eines Impfmediums, wie beschrieben in Tabelle 1, zu beimpfen, das in einer 250-ml-Schüttelflasche enthalten ist. Die Flasche wird während 48 h inkubiert. Ein 2-l-Erlenmeyerkolben mit 500 ml des gleichen Mediums wird mit 10 Vol.-% des Inokulums im ersten Stadium beimpft. Die Flasche wird während 48 h inkubiert.
Fermentationsschritt: 50 l Produktionsmedium, wie beschrieben in Tabelle 1, enthalten in einem 75-l-Fermentationstank, werden mit 2,5 l Inokulum im zweiten Stadium beimpft. Die Fermentation wird während 96 h mit 400 U/min Rühren und einem Luftstrom von 0,5 v/vm ausgeführt.
BEISPIEL 2: Isolierung von IB-01211
8,5 Liter der gesamten geernteten Nährbrühe wurden filtriert, um die Biomasse und andere Feststoffe abzutrennen. Der Mycelkuchen wurde zweimal mit einem Mischlösungsmittel (2,4 l) aus CHCl₃:CH₃OH:H₂O (2:1:1) extrahiert. Die Aktivität war in der unteren Schicht konzentriert. Das organische Lösungsmittel wurde eingeengt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei sich 4,8 g roher Extrakt ergaben.
Der Extrakt wurde auf ein Silikagel-VFC-(Vakuumflashchromatographie)-System aufgebracht, indem ein Gemisch von n-Hexan-EtOAc und EtOAc-MeOH als Elutionsmittel verwendet wurde. Die Fraktionen mit Antitumoraktivität, die IB-01211 (900 mg) enthielten, wurden mit EtOAc-MeOH 1:1, EtOAc-MeOH 1:3 und Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zweimal mit einer Silikagelsäule chromatographiert, wobei CHCl₃-MeOH- und EtOAc-MeOH-Gemische als Elutionsmittel verwendet wurden. Die cytotoxische Aktivität wurde in Fraktionen, eluiert mit CHCl₃-MeOH 96:4 in der ersten Chromatographie (200 mg der reinen Verbindung IB-01211), und in Fraktionen, eluiert mit EtOAc-MeOH 85:15–8:2 in der zweiten Chromatographie (60 mg der reinen Verbindung IB-01211), nachgewiesen.
Weitere Reinigung mit C18-Umkehrphasenchromatographie lieferte 22 mg der reinen Verbindung IB-01211, eluiert mit MeOH.

Auf der Grundlage ausführlicher Analyse ihrer verschiedenartigen spektralen charakteristischen Eigenschaften wurde die reine Verbindung als IB-01211 identifiziert. Das UV-Spektrum zeigt Absorption bei 225 nm, 265 nm und 290 nm, wie in 1 angegeben ist. Das Infrarotabsorptionsspektrum wird in 2 der begleitenden Zeichnungen gezeigt. Die ¹H-NMR, ¹³C-NMR und DEPT-Spektren von IB-01211 sind in 3, 4 bzw. 5 angegeben. Die 2D-NMR-Experimente COSY, HMQC und HMBC sind in 6, 7 bzw. 8 angegeben. Das ES-MS-Spektrum von IB-01211 zeigt einen (M+Na)-Peak bei 731, wie in 9 angegeben ist. ¹H- und ¹³C-NMR-Werte der Verbindung IB-01211 sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Position	¹³C (δ)	¹H (δ)
Isoleucin
NH		8,46 (d, 10,6)
αCH	57,3	4,99 (dd, 10,5, 4,4)
βCH	37,8	2,23 (m)
γCH₂	26,6	1,41 (q, 7,5) 1,20 (m)
γCH₃	14,9	1,05 (d, 6,9)
δCH₃	11,9	0,87 (t, 7,2)
CO	173,3
Valin
NH		7,37 (d, 5,4)
αCH	63,6	4,06 (dd, 8,7, 5,6)
βCH	30,2	2,21 (m)
γCH₃	19,5	0,95 (d, 6,8)
γCH₃	20,0	0,99 (d, 6,8)
CO	171,2
Oxazol (1)
NH		8,28 (bs)
αC	127,5
βCH₂	106,8	6,50 (s) 5,88 (s)
2-C	159,9
4-C	130,3
5-CH	139,1	8,2 (s)
Oxazol (2)
2-C	156,1
4-C	136,4
5-CH	136,9	8,16 (s)
Thiazol
2-C	157,8
4-C	142,2
5-CH	119,1	7,90 (s)
Oxazol (3)
2-C	158,6
4-C	130,6
5-CH	137,4	8,27 (s)
Oxazol (4)
2-C	152,0
4-C	129,8
5-C	153,6
1'-C	126,8
2',6'-CH	128,3	8,42 (dd, 7,0, 1,2)
3',5'-CH	128,8	7,49 (m)
4'-CH	130,7	7,47 (m)
CO	161,2

BEISPIEL 3: Biologische in-vitro-Aktivität
Bioassays für Antitumor-Screening

Die Entschiedenheit dieser Assays besteht darin, das Wachstum einer „in vitro"-Tumorzellkultur zu unterbrechen, indem die Zellen fortgesetzt der zu testenden Probe vorgelegt werden. Die folgenden humanen Zell-Linien wurden verwendet: ZELL-LINIEN

Name	ATCC Nr.	Gewebe	Charakteristische Eigenschaften
K-562	CCL-243	Leukämie	Erythroleukämie (Pleuraerguß)
A-549	CCL-185	Lunge	Lungenkarzinom „NSCL"
SK-MEL-28	HTB-72	Melanom	malignantes Melanom
HT-29	HTB-38	Kolon	Kolonadenokarzinom
DU-145	HTB-81	Prostata	Prostatakarzinom, nicht-androgene Rezeptoren
LNCaP	CRL-1740	Prostata	Prostataadenokarzinom, mit androgenen Rezeptoren
PC-3	CRL-1435	Prostata	Prostataadenokarzinom
BT-474	HTB-20	Brust	Brustadenokarzinom
MX-1		Brust	Brustadenokarzinom
Hs746t	HTB-135	Magen	Magenkarzinom
SK-HEP-1	HTB-52	Leber	Leberadenokarzinom
SK-OV-3	HTB-77	Eierstock	Eierstockadenokarzinom (malignante Asciten)
PANC-1	CRL-1469	Pankreas	pankreatisches Epitheloidkarzinom
5637	HTB-9	Blase	Blasenkarzinom
FADU	HTB-43	Rachen	Plattenepithelkarzinom
786-O	CRL-1932	Niere	primäres Nierenzelladenokarzinom
NCI-H187		SCL
Y-79	HTB-18	Retinoblastom	Retinoblastom
SW694	HTB-91	Fibrosarkom	Fibrosarkom
CHSA		Chondrosarkom	Chondrosarkom
OSA-FH		Osteosarkom	Osteosarkom
SK-N-MC	HTB-10	Neuroblastom	Neuroepitheliom
TT	CRL-1803	Schilddrüse	medulläres Schilddrüsekarzinom
SW-579	HTB-107	Schilddrüse	Schilddrüsenkarzinom
HL-60	CCL-240	promyelozytisch	Leukämie
H9	HTB-176	Lymphom	T-Zellen-Lymphom
MC116	CRL-1649	Lymphom	Lymphom

Hemmung von Zellwachstum mit Zählen von Zellen
Der Tetrazolium-Assay MTS basiert auf metabolischer Reduktion von MTS zu solubilisierten Formazankristallen durch die metabolisch aktiven Mitochondrien von lebenden Zellen. Aus diesem Grund 1 schließt die Methodik Zählen der Zell-Linien, basierend auf Färbung der Lebensfähigkeit, ein, um zu gewährleisten, daß Zellkonzentrationen korrigiert werden, um 100% lebende Zellen in jeder Vertiefung zu erlauben, an Stelle von Coulter-Zählung oder geschätzten Verdünnungen, basierend auf Standardwachstumskurven.
Medium, das Arzneimittel enthielt, wurde am Ende der Behandlung entnommen und Kulturplatten ein Mal mit PBS gespült. Danach wurden die Zellen in 200 μl arzneimittelfreiem Medium bis zu 72 Stunden inkubiert. Nach geeigneter Inkubationszeit wurden 25 μl MTS+PMS-Lösung in jede Mikrotitervertiefung gegeben und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann aus dem Inkubator entnommen und für 5 Minuten auf dem Plattenschüttler plaziert (bedeckt zum Schutz vor Licht). Optische Dichten wurden bei 490 nm auf dem Spektrophotometer-Plattenlesegerät abgelesen. Die Werte wurden unter Verwendung von Softmax analysiert.
Die Werte werden als IC₅₀-Potenzen dargestellt, berechnet aus den polynomischen Regressionskurven 3. Ordnung unter Verwendung von Microsoft Excel und dann manuell interpoliert.

Die folgende Tabelle veranschaulicht Werte zu der biologischen Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Cytotoxische Aktivität (mol/l) von IB-01211

Blase	5637	3,39E-7
Brust	BT-474	5,37E-7
Brust	MX-1	8,62E-7
Kolon	HT-29	8,17E-7
Magen	Hs746t	6,92E-7
Leber	SK-HEP-1	6,64E-7
NSCL	A549	9,18E-7
Eierstock	SK-OV-3	9,46E-7
Pankreas	PANC-1	4,24E-7
Rachen	FADU	6,64E-7
Niere	786-O	6,92E-7
Prostata	PC-3	6,21E-7
Prostata	DU-145	4,8E-7
Prostata	LNCAP	6,5E-7
SLC	NCI-H187	2,97E-8
Retinoblastom	Y-79	9,32E-8
Melanom	Mel-28	5,08E-7
Fibrosarkom	SW 694	7,2E-7
Chondrosarkom	CHSA	3,53E-7
Leukämie/Lymphom	HL-60	1,41E-7
Leukämie/Lymphom	K562	6,36E-7
Leukämie/Lymphom	H9	1,84E-7
Leukämie/Lymphom	MC116	3,39E-6
Osteosarkom	OSA-FH	7,2E-7
Neuroblastom	SK-N-MC	5,37E-7
Schilddrüse	TT	4,38E-6
Schilddrüse	SW-579	4,52E-7

BEISPIEL 4: Biologische in-vivo-Aktivität
In-vivo-Analyse von IB-01211 in Xenotransplantaten von humanem Brust-, Kolon- und nicht-kleinzelligen Lungentumor
Tumorimplantation
Zu verschiedenen Zeiten wurden drei humane Tumorzell-Linien MX-1 (Brust), HT-29 (Kolon) bzw. LX-1 (nicht-kleinzellige Lunge) subcutan in gesonderte Gruppen von weiblichen thymuslosen Empfängermäusen als kleine Beimpfung von ungefähr 2–3 mm³ implantiert. Jeder Tumortyp wurde dann im Inneren des Tieres wachsen gelassen, um eine mittlere Größe der Gruppe von 100 ± 15 mm³ zu erreichen, zu welcher Zeit Tumor-tragende Mäuse in Gruppen randomisiert wurden (Tag der Stadiumeinteilung). Der Tag der Stadiumeinteilung fiel auch mit dem Tag 0 zur Arzneimitteldosierung zusammen.
Häufigkeit und Weg der Verabreichung des Testgegenstands
Der Testgegenstand wurde als einzelne intravenöse (iv) Bolus-Injektion (d. h. QDx1) am Tag der Stadiumeinteilung (Tag 0) verabreicht.
Tumor-Messungen
Die Tumor-Belastung wurde für alle Tiere während der gesamten Studie unter Verwendung eines Calipers bestimmt und die Häufigkeit war mindestens zweimal pro Woche.
Datenanalyse
Protokolle und Kriterien für Arzneimittelaktivität wurden von denen abgeleitet, die vom National Cancer Institute für Tumorsysteme ähnlich denjenigen, verwendet in diesen Studien, aufgestellt wurden (NIH-Veröffentlichung Nr. 84-2635, In-vivo-Krebsmodelle 1976–1982). Statistische Analyse von Tumorvolumina wurde für jede Gruppe von Arzneimittel-behandelten Tieren entsprechend dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test, basierend auf Vergleichen mit der Vehikel-Kontrollkohorte innerhalb des gleichen Experiments, durchgeführt.
Tumorlängen (L) und -breiten (W) wurden in Millimetern (mm) unter Verwendung von Calipern gemessen, aufgezeichnet und das Tumorvolumen wurde durch die Formel: Volumen (mm³) = L × W² × 0,5 berechnet. Individuelle Werte wurden für jede Tumor-tragende thymuslose Maus und den spezifizierten Tag der Messung (Tag D) bestimmt. An dem Tag der Tumor-Stadiumeinteilung (Tag 0) wurde das Tumorvolumen eines behandelten Tieres (T₀1) von dem entsprechenden Tumorvolumen an jedem Beobachtungstag (T_D1) abgezogen. Dies stellte die Veränderung (Δ) im Tumorvolumen für die behandelte thymuslose Maus bereit (ΔT1 = T_D1 – T₀1). Die Veränderung in den Tumorvolumina wurde für jedes Mitglied der Kontrollkohorte (ΔC) in einer ähnlichen Weise wie vorstehend berechnet.

Die Ergebnisse von Tumorxenotransplantaten sind nachstehend in der Tabelle aufgeführt. Bei Randomisierung (Tag 0) war das mittlere Volumen der Tumormasse 100 ± 15 mm³ und das „Netto-Tumorwachstum" ist eigentlich eine Differenz zwischen der Größe des Tumors am Tag X und der am Tag 0. Der Parameter SEM wird allgemein in der Statistik verwendet und steht für den Standardfehler des Mittelwerts in einer Verteilung von N (Größe) experimentellen Werten. Kinetik des Netto-Tumorwachstums nach in-vivo-Verabreichung von IB-01211 bei Xenotransplantaten von humanem Brust-Tumor (MX-1-Zell-Linie).

Testgegenstand	einzelne Dosis (mg/kg)	Tag 3		Tag 6		Tag 10
Testgegenstand	einzelne Dosis (mg/kg)	Netto-TumorWachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-TumorWachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-Tumorwachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*
Vehikel-Kontrolle	-	124 ± 30	-	252 ± 20	-	780 ± 129	-
IB-01211	1,0	5 ± 3	0,0952^§	113 ± 62	0,0952^§	450 ± 137	0,3810
IB-01211	1,5	†	-	†	-	†	-

*P < 0,05, statistisch signifikant (entsprechend dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test: gegebene Gruppe, verglichen mit der Vehikel-Kontrollkohorte).
^§P > 0,05, aber < 0,096, Trend zu statistischer Signifikanz.
† Hohe Mortalität verhinderte sinnvolle statistische Analyse.

Testgegenstand	einzelne Dosis (mg/kg)	Tag 1		Tag 4		Tag 8
Testgegenstand	einzelne Dosis (mg/kg)	Netto-Tumorwachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-Tumorwachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-Tumorwachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*
Vehikel-Kontrolle	-	7 ± 10	-	46 ± 14	-	126 ± 32	-
IB-01211	0,5	26 ± 11	0,3095	53 ± 28	0,6905	162 ± 34	0,8413

*P < 0,05, statistisch signifikant (entsprechend dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test: gegebene Gruppe verglichen mit der Vehikel-Kontrollkohorte).
N. T., nicht getestet.

Testgegenstand	einzelne Dosis (mg/kg)	Tag 3		Tag 6		Tag 10
		Netto-Tumor-wachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-Tumor-wachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*	Netto-Tumor-wachstum ± SEM (mm³)	P-Wert*
Vehikel-Kontrolle	-	166 ± 30	-	307 ± 85	-	467 ± 77	-
IB-01211	1,0	68 ± 29	0,0556§	234 ± 11	0,6905	561 ± 60	0,2222
	1,5	11 ± 19	0,0079*	121 ± 51	0,0556§	309 ± 71	0,2222

*P < 0,05, statistisch signifikant (entsprechend dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test: gegebene Gruppe verglichen mit der Vehikel-Kontrollkohorte).
^§P > 0,05, aber < 0,06, Trend zu statistischer Signifikanz.

In der Schlußfolgerung demonstrierte die Verbindung IB-01211 mit einer entsprechenden maximal tolerierten Dosis (MTD) von 3,5 mg/kg bei herkömmlichen CD-1-Mäusen signifikante Antitumorwirkung in vivo gegen einen humanen nicht-kleinzelligen Lungentumor mit einer Dosis von 0,43 MTD und zeigte einen Trend zu Signifikanz gegen Brusttumor mit einer Dosis von 0,29 MTD, aber nicht gegen Kolontumor mit einer Dosis von 0,14 MTD.

Claims

Verbindung mit der allgemeinen Formel I:
wobei die R₁ jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyliden, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind; die R₃-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind; die R₄-Gruppen jeweils unabhängig aus NR₂, O und S ausgewählt sind; und die R₂-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Stereoisomer davon.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel II:
wobei die R₁ jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyliden, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind; die R₃-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Cyano, Hydroxyl, Nitro, Azido, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, einer substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Gruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind; die R₄-Gruppen jeweils unabhängig aus NR₂, O und S ausgewählt sind; und die R₂-Gruppen jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, substituiertem oder unsubstituiertem Alkoxy und substituiertem oder unsubstituiertem Acyl, ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die R₃ jeweils unabhängig aus substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl und substituiertem oder unsubstituiertem Alkyliden ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die R₂ jeweils unabhängig aus H und substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die R₃ jeweils unabhängig aus H und substituiertem oder unsubstituiertem Aryl ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die R₄ jeweils O sind.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit der folgenden Formel
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Stereoisomer davon.
Verbindung nach Anspruch 7 mit der folgenden Stereochemie
Verfahren zum Erzeugen einer Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, welches Synthetisieren eines Oxazol/Thiazol/Imidazol-Fragments und Einführen eines aminosauren Fragments umfaßt.
Verfahren zum Herstellen einer Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, welches Kultivieren eines Stammes eines Mikroorganismus, fähig, sie zu erzeugen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die hergestellte Verbindung IB-01211 mit der Formel:
ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Mikroorganismus ein Actinomycet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus der im wesentlichen reine Kulturstamm ES7-008, erhältlich unter der Zugangsnummer CECT 3358 von der Colección Española de Cultivos Tipo an der Universität von Valencia, Spanien, ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Stereoisomer davon und ein Verdünnungsmittel oder einen Träger, die pharmazeutisch verträglich sind.
Verwendung einer Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Stereoisomers davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.