JPH07316145A

JPH07316145A - 新規な６−オキサビシクロ［３．２．０ヘプタンのスピロ誘導体、抗腫瘍剤、ヒト腫瘍細胞に対する選択的細胞障害剤、該誘導体の生産菌及びその製造方法

Info

Publication number: JPH07316145A
Application number: JP11139794A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Murakami; 裕村上; Taku Kato; 卓加藤; Mitsuru Niwano; 満庭野
Original assignee: Kobe Steel Ltd
Current assignee: Kobe Steel Ltd
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 1995-12-05

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】抗腫瘍作用を有し且つヒト腫瘍細胞に対する
高い選択的細胞障害作用を有する薬剤を提供する。【構成】下記式［式中、Ｒ¹ 、Ｒ² およびＹは、それぞれ同一または異
なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒドロキ
シ（低級）アルキル基または保護されたヒドロキシ（低
級）アルキル基であり、Ｘはヒドロキシ基、保護された
ヒドロキシ基、低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
ルキル基または保護されたヒドロキシ（低級）アルキル
基を意味する］で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体、及び医薬として許容
される担体を含有する抗腫瘍剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な６−オキサビシ
クロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体、該誘導体
を有効成分とする抗腫瘍剤及びヒト腫瘍細胞に対する選
択的細胞障害剤、及び該誘導体を生産する微生物、並び
に該誘導体を高収率で製造する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】我国においては、１９８１年以降死因の
第１位は悪性腫瘍（癌）であり、現在毎年２０万人近く
の人が癌で死亡している。この様な事情に鑑みて、癌の
原因究明、癌の予防・診断方法、治療法の開発等に関す
る研究が幅広く行われている。現在行われている癌の治
療法としては、外科手術、化学療法、放射線療法が挙げ
られるが、これらのうち化学療法剤（抗腫瘍剤）につい
ては、その作用機序や作用部位の違いから下記の様に分
類されている。

【０００３】（ｉ）腫瘍細胞のヌクレオチド合成系、Ｄ
ＮＡ合成系、細胞の有糸分裂等に影響を与えて腫瘍細胞
の増殖を阻止する作用を有する薬剤：アルキル化剤（シ
クロホスファミド，メルファラン，チオテパ等）、代謝
拮抗薬（５−フルオロウラシル等）、微生物由来の抗腫
瘍性抗生物質（放線菌由来のブレオマイシン、マイトマ
イシンＣ、ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ等；担
子菌由来のレンチナン、シゾフィラン、クレスチン
等）、金属錯体（シスプラチン、カルボプラチン等）
等。

【０００４】（ii）腫瘍細胞の増殖促進因子を抑制する
作用を有する薬剤：ホルモン剤（クエン酸タモキシフェ
ン等）等。（iii ）生体防御機構のもつ抗腫瘍作用を高める作用を
有する薬剤：細菌製剤、制癌多糖体、インターフェロン
等。これらの抗腫瘍剤の大部分は、正常細胞と腫瘍細胞との
間に存在する何らかの質的もしくは量的な差を利用し
て、腫瘍細胞の増殖を直接的または間接的に阻害する性
質（即ち、選択毒性）を有している。しかしながら、腫
瘍細胞はもともと自己の細胞から発生・分化したもので
あるので、抗腫瘍剤における選択毒性は、外的異物であ
る細菌等を対象とする抗感染薬に比べて低いことが多
い。換言すれば、腫瘍細胞に対して障害を起こす物質
は、ほとんどの場合正常細胞に対しても何らかの障害作
用を示すのである。従って抗腫瘍剤の開発においては、
腫瘍細胞のみに高い障害作用を示す様な、即ち高度な選
択毒性を有する薬剤の開発が望まれている（ファルマシ
アレビューNo.23, pp.71-80 (1987)）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は以上のような
問題に鑑みてなされたものであり、その第一の目的は、
抗腫瘍作用を有し且つヒト腫瘍細胞に対する高い選択的
細胞障害作用を有する薬剤を提供することである。ま
た、本発明の第二の目的は、この様な薬剤の有効成分を
効率良く生産する能力を有する微生物を提供することで
ある。更に本発明の第三の目的は、上記有効成分を高収
率で製造する方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の新規な６−オキ
サビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体は、
式（１）

【０００７】

【化２】

【０００８】［式中、Ｒ¹ 、Ｒ² およびＹは、それぞれ
同一または異なって、低級アルキル基、低級アルケニル
基、ヒドロキシ（低級）アルキル基または保護されたヒ
ドロキシ（低級）アルキル基であり、Ｘはヒドロキシ
基、保護されたヒドロキシ基、低級アルキル基、ヒドロ
キシ（低級）アルキル基または保護されたヒドロキシ
（低級）アルキル基を意味する］で示される。

【０００９】好ましくは、上式（１）の化合物は下式
（２）で表される。

【００１０】

【化３】

【００１１】本発明の抗腫瘍剤は、上式（１）で示され
る６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ
誘導体、及び医薬として許容される担体を含有すること
に要旨を有するものである。また、本発明のヒト腫瘍細
胞に対する選択的細胞障害剤は、上記６−オキサビシク
ロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体、及び医薬と
して許容される担体を含有することに要旨を有するもの
である。

【００１２】本発明の微生物は、クリソスポリウム属に
属し、上記６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン
のスピロ誘導体を生産する能力を有する微生物クリソス
ポリウムｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗである。本発明の
６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘
導体の製造方法は、クリソスポリウム属に属し、上記６
−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導
体を生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養
物中に６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのス
ピロ誘導体を生産蓄積させ、これを採取することに要旨
を有するものである。

【００１３】

【作用】本発明者らは、微生物由来の新規な抗腫瘍活性
物質を得る目的で、種々の不完全菌、子嚢菌及び担子菌
を分離して研究を行った結果、兵庫県の六甲山で採集し
た腐朽材より分離した不完全菌が、その培養物中に抗腫
瘍活性を有する化合物（即ち、６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体）を大量に生産
することを見出し、その化学構造を解明することによっ
て本発明を完成したのである。

【００１４】６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタ
ン骨格を有する化合物については既に公知であるが、そ
の構造中にスピロ骨格を有する化合物はこれまで報告さ
れたことがなく、本発明者等によって初めて見い出され
た新規な化合物である。また、本発明者等は、上記６−
オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体
が抗腫瘍活性ヒト腫瘍細胞に対する高い選択的細胞障害
作用を有すること、クリソスポリウム属に属する微生物
が上記化合物を高収率で生産する能力を有することを見
いだして、本発明を完成したのである。

【００１５】まず、本発明の６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体について説明する。上
記本発明のスピロ誘導体は上式（１）で示される化合物
であり、式中、Ｒ¹、Ｒ² およびＹはそれぞれ同一また
は異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒド
ロキシ（低級）アルキル基または保護されたヒドロキシ
（低級）アルキル基であり、Ｘはヒドロキシ基、保護さ
れたヒドロキシ基、低級アルキル基、ヒドロキシ（低
級）アルキル基または保護されたヒドロキシ（低級）ア
ルキル基を意味する。

【００１６】ここで、「低級」とは、特に指示がなけれ
ば、炭素原子１個ないし６個（もしくは低級アルケニル
基の場合には２個ないし６個）、好ましくは炭素原子１
個ないし４個（もしくは低級アルケニル基の場合には２
個ないし４個）を意味するものである。好適な「低級ア
ルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル
等の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられ、それらの
中でさらに好ましい例としては（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アルキル
基が挙げられ、最も好ましくはメチル基である。

【００１７】好適な「低級アルケニル基」としては、ビ
ニル基、１−プロペニル基、アリル基、１−メチルアリ
ル基、１または２または３−ブテニル基、１または２ま
たは３または４−ペンテニル基、１または２または３ま
たは４または５−ヘキセニル基のような直鎖または分枝
鎖のアルケニル基が挙げられ、より好ましい例としては
（Ｃ₂ −Ｃ₄ ）アルケニル基が挙げられ、基も好ましく
は１−プロペニル基である。

【００１８】好適な「ヒドロキシ（低級）アルキル基」
としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒド
ロキシプロピル、１−（ヒドロキシメチル）エチル、１
−ヒドロキシ−１−メチルエチル、ヒドロキシブチル、
ヒドロキシペンチル、ヒドロキシヘキシル基等の様な、
ヒドロキシ基を有する直鎖または分枝鎖低級アルキル基
が挙げられ、それらの中で好ましい例としてヒドロキシ
（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アルキル基が挙げられる。

【００１９】好適な「保護されたヒドロキシ（低級）ア
ルキル基」としては、常用のヒドロキシ保護基で保護さ
れた上記ヒドロキシ低級（アルキル）基が挙げられる。
ここで、上記常用のヒドロキシ保護基としては、好まし
くは低級アルケニルオキシカルボニル基およびフェニル
（またはニトロフェニル）（低級）アルコキシカルボニ
ル基；Ｃ₆ −Ｃ₁₀アル（低級）アルキル基（例えばベン
ジル、ベンズヒドリル、トリチル等のモノ−またはジ−
またはトリフェニル（低級）アルキル基等）等が挙げら
れる。

【００２０】このような意味における「保護されたヒド
ロキシ（低級）アルキル基」のさらに好ましい例として
は、｛フェニル（またはニトロフェニル）（Ｃ₁ −Ｃ
₄ ）アルコキシ｝カルボニルオキシ（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アル
キル基及びＣ₂ −Ｃ₄ アルケニルオキシカルボニルオキ
シ（Ｃ₁ −Ｃ₄ ）アルキル基が挙げられる。好適な「保
護されたヒドロキシ基」としては、上記保護されたヒド
ロキシ（低級）アルキル基の説明で述べた様な常用のヒ
ドロキシ保護基で保護されている保護されたヒドロキシ
基が挙げられる。

【００２１】上式（１）で示される６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体のうち、最も好
ましい化合物は、式（１）において、Ｒ¹ ＝Ｒ² ＝Ｙが
メチル基であり、Ｘがヒドロキシ基である化合物、すな
わち上式（２）で示される化合物である。この化合物
は、７，７−ジメチル−５−ヒドロキシ−３−オキソ−
６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタン−４−スピ
ロ−１’−｛２’−オキソ−４’−（１−プロペニル）
−３’−シクロブテン｝と命名される（分子量＝２４
８，分子式＝Ｃ₁₄Ｈ₁₆Ｏ₄ ）。

【００２２】上式（２）で示される本発明の化合物は、
以下の表１に示す様な理化学的性質を有する。

【００２３】

【表１】

【００２４】なお、図１は上式（２）で示される化合物
の高速原子衝撃質量スペクトルを、図２は紫外線吸収ス
ペクトルを、図３はプロトン核磁気共鳴スペクトルを、
図４はカーボン核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ示す。
次に、本発明の抗腫瘍剤およびヒト腫瘍細胞に対する選
択的細胞障害剤（以下、これらを総称して単に薬剤と略
記する場合がある）は、有効成分として上記６−オキサ
ビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を含有
し、これに医薬として許容される無機担体もしくは有機
担体を加えて固体、半固体、または液体の形で、経口投
与剤または非経口投与剤の剤型に製剤化する。

【００２５】本発明の薬剤は、この様に経口剤及び非経
口剤のいずれの形態でも提供可能であり、投与経路や投
与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。経口
投与に適した剤型としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒
剤、軟・硬カプセル剤、ペレット剤、舌下剤、各種液剤
等が例示され、非経口に適した剤型としては、注射剤、
点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、スプレ
ー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本発明
の有効成分を製剤化させるには常用に従えばよく、界面
活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩
衝剤、懸濁剤、等張剤、その他常用の医薬として許容さ
れる担体を適宜使用する。

【００２６】本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、治
療の種類、投与方法、患者の年齢、体重、患者の症状、
腫瘍の種類や部位、更には進行の程度等を考慮して適宜
決定されるものであるが、有効成分である式（１）で示
される６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのス
ピロ誘導体として、一般に大人では、非経口投与の場合
（静脈投与、筋肉投与等）、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋ
ｇ／日の範囲であり、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ
／日であり、経口投与の場合は約０．５〜２０ｍｇ／ｋ
ｇ／日の範囲であり、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ／
日の範囲である。

【００２７】更に、本発明の微生物は、クリソスポリウ
ム属に属し、上式（１）で示される６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を生産する能力
を有する微生物であり、その様な例として例えばクリソ
スポリウムｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗが挙げられる。
以下に、上記菌株ｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗに関する
菌学的性質を示す。

【００２８】（１）菌の分離本菌株は、兵庫県の六甲山で採取した腐朽材を用いて、
木材腐朽菌の分離に通常用いられる方法で単離した。即
ち、上記腐朽材の試料（ピンセット１つまみ分）を火炎
処理後、ブナ木粉（１００メッシュの篩いを通過したも
の）２．０％と寒天１．６％を含有する培地（ＷＡ培
地）に接種し、１〜２週間培養した。生育した菌体を、
ピンセットあるいは白金耳を用いて新しい培地に接種す
る単菌分離操作を行うことによりコロニーを分離し、目
的とする菌株を単離した。

【００２９】（２）菌の形態的性質菌糸は、ポテト−デキストロース培地（ＰＤＡ培地）及
び麦芽エキス寒天培地上でよく発達し、隔壁が観察され
る。菌糸は白色〜灰白色を呈し、その表面は滑面であ
る。胞子（分生子）は隔壁が膨らむことによって栄養菌
糸に沿って生じ、次いで隔壁により分離する。分生子は
菌糸上に頂生するか、もしくはその長軸に沿って種々の
位置に形成される。

【００３０】（３）各種培地における培養的性質各種培地における培養的性質を表２に示す。なお、後記
する観察結果はすべて特に特記しない限り、２８℃、７
日間の条件下における各培地での結果である。

【００３１】

【表２】

【００３２】（４）生理学的・化学分類学的性質ポテト−デキストロース培地を用いた、ｐＨ及び温度条
件の結果を以下に示す。最適生育条件生育最適ｐＨ：４〜６生育最適温度：約２７℃ 生育の範囲ｐＨ生育域：２〜１０温度生育域：１０〜４０℃ 上記（１）〜（４）に記載した本菌株の菌学的性状を要
約すると以下の通りである。即ち、菌糸は隔壁を有し、
菌糸の色は白色〜灰白色を呈し、表面は平滑である。分
生子は壁が膨らむことによって栄養菌糸に沿って生じる
か、樹状に分岐した分生子柄の先端に生じる。培養上の
諸性質としては、各種培地上で菌糸は白色系の色調を呈
し、褐色の可溶性色素を生産する。これらの結果から、
本菌株はデビッドマロックによる分類（カビの分離・培
養と同定、５０〜８９頁、１９８３年）により、クリソ
スポリウム属に属する菌種であると考えられ、クリソス
ポリウムｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗ（Chrysosporium
sp. No. 632-3-W ）と命名して工業技術院生命工学工業
技術研究所へ寄託した（ＦＥＲＭＰ−１４２５４，受
託日：平成６年３月３０日）。

【００３３】以上、６−オキサビシクロ［３．２．０］
ヘプタンのスピロ誘導体生産菌についてクリソスポリウ
ムｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗを例に挙げて説明した
が、これに限定されず、クリソスポリウム属に属し、６
−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導
体を生産する能力を有する菌株は全て本発明の範囲内に
包含される。

【００３４】本発明の６−オキサビシクロ［３．２．
０］ヘプタンのスピロ誘導体の製造方法は、クリソスポ
リウム属に属し、これを生産する能力を有する微生物を
培地に培養して培養物中に６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を生産蓄積させて採取
する方法であり、この方法によって６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を高収率で得る
ことが可能である。以下に、その方法を詳述する。

【００３５】まず、クリソスポリウム属に属し、６−オ
キサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を
生産する能力を有する微生物を培地に培養する。上記微
生物の培養においては、通常の不完全菌を培養する方法
が一般に用いられる。即ち、培地としては、微生物が同
化し得る炭素源、消化し得る窒素源、更には必要に応じ
て無機塩等を含有する栄養培地が使用される。ここで、
上記同化し得る炭素源としては、グルコース、フルクト
ース、マルトース、キシロース、マンニット、グリセリ
ン、糖蜜、澱粉、デキストリン、コーンスチープリカー
等の炭水化物が挙げられ、上記消化し得る窒素源として
は、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆
粉、大豆蛋白分解物、カゼイン、アミノ酸、尿素、ＮＺ
−アミン、コーンスチープリカー、フィッシュミール等
の有機窒素源；硝酸塩、アンモニウム塩等の無機窒素化
合物が挙げられ、上記無機塩としてはナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等
が挙げられる。これらの各炭素源、窒素源及び無機塩
は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて用いら
れる。更に必要に応じて、本菌株の生育や６−オキサビ
シクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の生産を
促進する目的で、重金属（Ｆｅ，Ｃｕ等）、微量栄養源
（ビタミン類等）、発育促進物質（パントテン酸、ビオ
チン等）、前駆物質（メバロン酸、ピロリン酸等）等を
添加してもよい。

【００３６】上記菌株の培養は通常、振盪培養または通
気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、工
業的規模で培養を行うには深部通気撹拌培養が好まし
い。培養温度は１０〜４０℃が好ましく、２５〜３０℃
がより好ましい。培養液のｐＨは、菌体の増殖を高める
ためにも弱酸性〜中性（ｐＨ５〜７）にすることが好ま
しい。培養時間は、液体培養の場合、通常４〜７日間で
あるが、好ましくは培養物中の６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の蓄積量が最大
に達したときに培養を終了させる。上記した培地組成、
培地の液性、培養温度、培養時間及び撹拌速度、通気量
等の培養条件は、使用する菌株の種類や外部条件等に応
じて最適条件を適宜選択して行えばよい。なお、液体培
養において発泡が生じるときは、シリコン油、植物油、
界面活性剤等の消泡剤を適宜使用することが好ましい。

【００３７】この様にして得られた培養物中に蓄積され
た６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ
誘導体は、主として培養濾液中に含まれるので、遠心分
離や濾過によって培養濾液と菌体を分離し、培養濾液か
ら６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ
誘導体を抽出・精製することが好ましい。培養濾液から
６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘
導体を抽出するには、メタノール、エタノール、ｎ−ブ
タノール、アセトン、クロロホルムその他の有機溶媒；
水；またはリン酸緩衝液等を、単独でまたはこれらを２
種以上組み合わせたものからなる混合液を用いることが
好ましい。得られた粗製の抽出物は、更に疎水性物質の
精製に通常用いられる方法、例えばシリカゲル、アルミ
ナ等の担体を用いたカラムクロマトグラフィーによって
精製することができる。この様な方法によって、６−オ
キサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を
高収率で得ることができる。

【００３８】以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、下記実施例は本発明を制限するものではな
く、前・後記の趣旨を逸脱しない範囲で変更実施するこ
とは全て本発明の技術的範囲に包含される。

【００３９】

【実施例】以下の実施例及び製剤例は、すべて上式
（２）で示される６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘ
プタンのスピロ誘導体｛以下、式（２）のスピロ誘導体
と略記する｝について行ったものである。実施例１：式（２）のスピロ誘導体の製造（ａ）式（２）のスピロ誘導体生産菌の培養直径９０ｍｍのシャーレ上に調製したポテト−デキスト
ロース寒天培地に、クリソスポリウムｓｐ．Ｎｏ．６３
２−３−Ｗ株の斜面培養物（ポテト−デキストロース寒
天斜面培地上で２８℃で７日間培養したもの）を１白金
耳接種し、２８℃で７日間培養し、培養物を得た。５０
０ｍＬ容エルレンマイヤーフラスコにポテト−デキスト
ロース液体培地（ｐＨ５．０）１００ｍＬを滅菌調製
し、これに上記培養物の１／５量を接種した後、ロータ
リーシェーカー（２００ｒｐｍ）を用いて２８℃で７日
間培養し、種母を得た。

【００４０】次に、１０Ｌ容ジャーファーメンターにポ
テト−デキストロース液体培地６Ｌを滅菌調製した後、
これに上記方法で得られた種母５００ｍＬを無菌的に移
植し、２８℃で５日間培養（空気通気量：毎分３Ｌ、撹
拌速度：３００ｒｐｍ）して、培養液５．４Ｌを得た。（ｂ）培養物からの式（２）のスピロ誘導体の抽出図５に、上記培養物から式（２）のスピロ誘導体を抽出
して精製する工程の一例を示す。以下、同図を参照しな
がら、この工程を詳細に説明する。

【００４１】まず、上記（ａ）で得られた培養液５．４
Ｌを減圧濃縮し、５００ｍＬにまで濃縮した。次にこの
濃縮物にアセトン２Ｌを撹拌しながら徐々に加え、８０
％アセトン溶液とした後、遠心分離を行った。得られた
アセトン抽出液を減圧乾固して８０％アセトン抽出物５
５ｇを得た。上記８０％アセトン抽出物をクロロホル
ム：メタノール：水＝５：６：４の二層液々分配で分配
し、式（２）のスピロ誘導体を含むクロロホルム抽出物
４．５ｇを得た。

【００４２】（ｃ）抽出物からの式（２）のスピロ誘導
体の精製上記（ｂ）で得られたクロロホルム抽出物を、予めクロ
ロホルムで充填したシリカゲルカラム（内径５０ｍｍ、
長さ２７．５ｃｍ）に吸着させ、クロロホルムで洗浄し
た後、クロロホルム中のメタノール濃度を１％、１０
％、５０％、１００％と上げていくステップワイズ方式
で溶出させた。得られた溶出液のうち、クロロホルム溶
出画分を減圧乾固し、溶出物２５０ｍｇを得た。この溶
出物を、シリカゲルカラム（内径５０ｍｍ，長さ２５ｃ
ｍ）を用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（溶出
は、ｎ−ヘキサン：エタノール＝９９：１のアイソクラ
ティック方式で行う）にかけ、波長２２０ｎｍの紫外部
吸収で式（２）のスピロ誘導体に該当するピークを有す
る画分を集めた。この画分を減圧乾固することにより、
式（２）のスピロ誘導体の純品１１ｍｇを得た。

【００４３】実施例２及び比較例：細胞障害性の評価 Michael C. Alleyらの方法（Cancer Research 48, 589-
601, Feb. 1, 1988 ）に従って、ヒト正常細胞（ヒト正
常繊維芽細胞：IMR-90）及びヒト腫瘍細胞｛ヒト膵臓癌
細胞（MIA-PaCa2 ）及びヒト骨肉腫細胞（Hos ）｝に対
する式（２）のスピロ誘導体の細胞障害性を評価した。

【００４４】即ち、上記各培養細胞を１０％牛胎児血清
を含むダルペッコ改変イーグル培地を、培地１ｍＬ当た
りの細胞数が５×１０³ 〜１×１０⁵ 個になる様に調製
した。９６ウェルのマイクロプレ−トに、１ウェル当た
り各調製液を１００μＬ注入した。このプレートを、５
％ＣＯ₂ −９５％空気中、３７℃で２４時間培養後、被
験物質として、種々の濃度の、式（２）のスピロ誘導体
｛上記各注入量と等量の培地（ＤＭＳＯを０．１％以下
含有）に溶解もしくは懸濁させる｝を添加した後、更に
同一条件下で７２時間培養した。この培養物に、１ｍｇ
のＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide ）／ｍＬ・ＰＢＳを、最終濃度が
２００μｇ／ｍＬになる様に添加し、同一条件下で更に
４時間静置した。

【００４５】生細胞が存在する場合には、この間にＭＴ
Ｔが取り込まれ、該生細胞内で還元されて青色のホルマ
ザンを形成する。本実施例における被験物質の細胞障害
能は、この様な生細胞のＭＴＴの取り込みを測定して、
コントロール群（被験物質を添加しない群）と比較する
ことにより評価した。即ち、上記工程終了後、ウェル中
の培地を取り除いた状態で各細胞内に取り込まれたＭＴ
Ｔを、１００％ＤＭＳＯ（１５０μＬ／ウェル）で細胞
外に抽出し、分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける吸
光度（Ａ₅₄₀ ）を測定した。

【００４６】被験物質の細胞障害作用は、正常細胞の場
合は、コントロールとして被験物質無添加の正常細胞の
ＭＴＴの取り込み量を１００としたときの、被験物質を
用いた場合の正常細胞のＭＴＴの取り込み量の割合（生
存率％）で表し、一方、腫瘍細胞の場合は、コントロー
ルとして被験物質無添加の腫瘍細胞のＭＴＴの取り込み
量を１００としたときの、被験物質を用いた場合の腫瘍
細胞のＭＴＴの取り込み量の割合（生存率％）で表し
た。縦軸に得られた生存率を、横軸に被験物質の最終濃
度の対数をとってプロットし、５０％の生存率を与える
濃度：ＩＣ₅₀（Inhibited Concentration of 50%, μｇ
／ｍＬ）を求めた。その結果を図６に示す。

【００４７】式（２）のスピロ誘導体を用いた場合のヒ
ト正常繊維芽細胞（IMR-90）、ヒト膵臓癌細胞（MIA-Pa
Ca2 ）及びヒト骨肉腫細胞（Hos ）のＩＣ₅₀はそれぞ
れ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ及び０．
０２５μｇ／ｍＬであった。このことから、式（２）の
スピロ誘導体は、MIA-PaCa及びHos に対して高い選択的
細胞障害作用を発揮し、且つその程度も非常に高いこと
が分かった。すなわち、MIA-PaCaは、IMR-90に比べて約
６倍、Hos は、IMR-90に比べて約１０倍もの高い選択的
細胞障害作用を有することが分かった。

【００４８】製剤例１：錠剤式（２）のスピロ誘導体５０ｇラクトース９０ｇコーンスターチ２９ｇステアリン酸マグネシウム１ｇ及びの全量との１７ｇを混合し、別途７ｇのか
ら調製したペーストと共に顆粒化させた。得られた顆粒
に、の５ｇとの全量を加えて十分混合し、この混合
物を圧縮錠剤機で圧縮し、１錠当たりを５０ｍｇ含有
する錠剤１０００個を製造した。

【００４９】製剤例２：注射剤式（２）のスピロ誘導体５．０ｇ塩化ナトリウム８．５ｇクロロブタノール５．０ｇ炭酸水素ナトリウム５０．０ｇ〜の全量を蒸留水１０００ｍＬに溶解した後、アン
プルに１ｍＬずつ分注して注射剤１０００本を製造し
た。

【００５０】なお、上記実施例及び製剤例は、いずれも
式（２）のスピロ誘導体を用いたものであるが、本発明
の範囲内の他のスピロ誘導体を用いた場合においても同
様の結果が得られる。

【００５１】

【発明の効果】本発明の薬剤は以上の様に構成されてい
るので、従来の化学療法剤に比べて低い濃度でも、ヒト
腫瘍細胞に対して高い選択的細胞障害作用を発揮するこ
とができる。また、本発明の微生物は、上記薬剤の有効
成分である上式（１）で示される６−オキサビシクロ
［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体を生産する能力
を有するものである。更に、本発明の製造方法は以上の
様に構成されているので、上記有効成分を高収率で製造
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の高速原子衝撃質量ス
ペクトルを示す。

【図２】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の紫外線吸収スペクト
ルを示す。

【図３】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体のプロトン核磁気共鳴
スペクトルを示す。

【図４】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体のカーボン核磁気共鳴
スペクトルを示す。

【図５】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の精製工程の一例を示
す工程図である。

【図６】式（２）で示される６−オキサビシクロ［３．
２．０］ヘプタンのスピロ誘導体の細胞障害作用を示す
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（１）【化１】［式中、Ｒ¹ 、Ｒ² およびＹは、それぞれ同一または異
なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒドロキ
シ（低級）アルキル基または保護されたヒドロキシ（低
級）アルキル基であり、Ｘはヒドロキシ基、保護されたヒドロキシ基、低級アル
キル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基または保護され
たヒドロキシ（低級）アルキル基を意味する］で示され
る６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ
誘導体。
【請求項２】Ｒ¹ 、Ｒ² 及びＹがメチル基であり、Ｘ
がヒドロキシ基である請求項１に記載の６−オキサビシ
クロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体。
【請求項３】請求項１または２に記載の６−オキサビ
シクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体、及び医
薬として許容される担体を含有することを特徴とする抗
腫瘍剤。
【請求項４】請求項１または２に記載の６−オキサビ
シクロ［３．２．０］ヘプタンのスピロ誘導体、及び医
薬として許容される担体を含有することを特徴とするヒ
ト腫瘍細胞に対する選択的細胞障害剤。
【請求項５】クリソスポリウム属に属し、請求項１ま
たは２に記載の６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプ
タンのスピロ誘導体を生産する能力を有する微生物クリ
ソスポリウムｓｐ．Ｎｏ．６３２−３−Ｗ。
【請求項６】クリソスポリウム属に属し、請求項１ま
たは２に記載の６−オキサビシクロ［３．２．０］ヘプ
タンのスピロ誘導体を生産する能力を有する微生物を培
地に培養して培養物中に６−オキサビシクロ［３．２．
０］ヘプタンのスピロ誘導体を生産蓄積させ、これを採
取することを特徴とする６−オキサビシクロ［３．２．
０］ヘプタンのスピロ誘導体の製造方法。