JPS5973519A - スワインソニンの製造法およびそれを含む免疫調整剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はスワインソニンの製造法およびスワインソニ
ンまたは医薬として許容されるその塩を含有する免疫調
整剤に関するものである。

スワインソニンは豆科植物から単離され、ａ−マンノシ
ダーゼ阻害活性を有していることが知られている（例え
ば、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリ
ー第３２巻、第２２５７〜２２６４頁、１９７９年参照
）が、この発明者等にメタリジウム属に属する菌がスワ
インソニン全生産すること全所たに見出した。そしてさ
らにスワインソニンが免疫調整作用含有するという新知
見を得、鋭意研究の結果、この発明全完成した。

スワインソニンの製造 スワインソニンはメタリジウム属に属するスワインソニ
ン生産菌を培地に培養することによシ行われる。

メタリジウム属に属するスワインソニン生産菌株は、以
下に示す希釈平板法を用いて単離される。

乾燥重量で約１ｇ当量の土壌全、滅菌試験管に加え、滅
菌水によシ容積を５肩ｌとした。次いでこの混合物全試
験管振とう器（大洋化学工業社製自動ミキサーＳ−５Ｎ
）によシ１０秒間混合し、１０分間放置した。試験管内
容物０．５ｇ／’に滅菌水４．５ｔｔｔｅに注ぎ、１７
５０倍希釈液とした。この操作全次の試験管で繰返して
１１５　Ｄ　０倍希釈液を得、その０．０５ｇ／にべ）
　ＩＪ皿中の野菜スープ−麦芽エキＭ６ＳＯ４・７Ｈ２
０１１％ＫＨ２ＰＯ４１！　、クロラムフエ臣コニル０
．０１ｆＪローズ　ベンガル０．０１’、寒天２０ｆ、
ジャーバー野菜ヌープ；明治屋食品工業社製６５屑ｔ、
水道水９’３５Ｍｔ　；　Ｉ）Ｈ５，５）上に塗布した
。

平板を２５°Ｃで１０日間インキュベー１−シ、次いで
生育コロニーケ切取！ｌ）、　ｙｐ、ｓ３Ｑ大（酵母エ
キス４１１’、可溶性でん粉１５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ
、Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｉ（２００，５ｆ、寒天２５ｇ、
水道水１０００ｙ／）斜面に移し、２５℃で１４日間培
養した。

単離したコロニー中にメタリジウム属に１萬する菌株會
見出すことができた。

−３６００と番号會付す）が、上記単回ト法によって土
壌試料から新たに単離された。こｎらは下記の鰍生物学
的性質ケ有する。

（１）菌株Ｆ−３６２２： 菌株Ｆ−３６２２は、大阪府和泉市で採集された」二環
試料から初めて単離された。その形態学的特徴に基づい
て、この菌株に不完全糸状菌メタリジウム・ソロキン（
Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　５ｏｒｏｋｉｎ）属に属する
と見らｎる。この菌株の形態学的、培養学的、生理学的
特徴は下記のとおりである。

種々の培地で完全世代は発達しないが、分生子座の分生
子柄および分生子の背の高い緑色円柱からなる分生子構
造が豊富に生成する。

菌株［３６２２の無色、滑面の分生子柄は長さ２０〜４
５μ、幅２〜５μであシ、隔壁を有し、直線状である。

こｎらは通常、かなシ密に織り混った菌糸の集合体」二
に、緊密に充填された塊として生ずる。

菌糸に輪生、豊富かつ密なほうき状分校よシなる。各分
校の先端に１ないし５個のフィアライドが形成されてい
る。このフィアライドは無色、滑面の円筒状ないしくσ
長だ円形またばとつくυ状全呈しておシ、長さ６〜１６
μ、幅１．５〜４μである。これらは子鹿上に分生子形
成層？形成してい無色１ｆｃは淡色、滑面の分生子に、
円柱状の塊として集合した長い求基性の鎖に形成ぢれる
。分生子柱は直径５０〜５　Ｄ　Ｏｔｔ、高さ２．［、
ｌＯ〜８００μであり、暗いオリーブ緑色ないしに灰緑
色を呈する。分生子に単細胞で付属器官はなく、円筒状
ないし長だ円形で、しばしば中央部が若干狭くなってお
り、通常両端が截形ケなし、大きざに、４．５〜８（〜
１０．５．　）　Ｘ　１．５〜６μである。

栄養菌糸（徒隔壁を有し、無色、滑面であシかつ分枝し
ている。菌糸細胞は円筒状または樽型であり、長さ１６
〜９０μ、輻１．５〜７μである。厚膜胞子は無い。

麦芽エキス寒天上のコロニーｆ１．　ソ３ｆｆＬ２５°
Ｃで２週間後に直径３．Ｑ　ａｒｔに達するように生育
する。コロニーの表面は隆起しており、柔毛の生えた白
色および暗オリーブ緑色ないし灰緑色である。

胞子柱を有する分生子座は緑色の斑点として白色気菌糸
の中ｌｆｃは上に形成される。裏面は同色である。馬鈴
薯デキストローヌ寒天上のコロニーに、生育速度の点で
は麦芽エキス寒天」二のコロニーと同様である。表面は
平らで、粉末状ないしフェルト状であり、多くの灰色が
かったオリーブ緑色の斑点のある黄白色である。裏面は
淡黄色ないし黄褐色である。黄色の可溶性色素が寒天培
地中に拡散する。

菌株Ｆ−３６２２は８〜６１°Ｃの温度範囲で生育する
ことができるが、最適生育温度は２６〜２５℃である。

これらの温度データは温度勾配インキュベーター（東洋
化学産業社製）を用いて、馬鈴薯デキストロース寒天上
で測定した。この菌株に麦芽・イースト液状培地中ｐＦ
（３〜１０の範囲で生育することができ、最適生育ｐＨ
範囲は６〜７である。

メタリジウム属の分類学上の基準によれば（ベンチ１９
３０年、ラッチ１９６４年、ガムス＆ロッジパル１９７
３年、テユーロッホ１９７４年）、菌株Ｆ−３６２２Ｕ
、コロニー色および温度データの点を除いて、メタリジ
ウム・アニソプリエＭｅｔａｒｈｉ、ｚｉ、ｕ、ｍ　ａ
ｎｉ−ｓｏ　ｌｉａｅ）（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｆｆ（
メチニコフ）〕ソロキン（Ｓｏｒｏｋｉｎ）と酷似して
いる。こｎらの差異はメタリジウム・アニソプリエの租
１の許賽限界内に入ると見られたので、菌株Ｆ−３６２
１メタリジウム・アニソプリエの一つの菌株と同定し、
メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ
　ａｎ’ｃｓｏｐ１．ａｅ）Ｆ−３６２２と命名した。

（２）菌株Ｆ−３６００： 菌株１−３６００に、兵庫県神戸市で採取した土壌試料
から単離された。菌株Ｆ−３６２２と同様に、この菌株
もその形態学的特徴上メタリジウム属に属するが、公知
の２種とに異なる。菌株の特徴は下記のとおりである。

生子柄よりなる分生子形成器官、および緑色の胞子集合
体が形成されている。

無色、滑面分生子柄が子鹿上または栄養菌糸から形成さ
れている。子鹿にかなり密に織り混った菌糸よりなるが
、菌株Ｆ−３６２２のものより明瞭でない。分生子柄は
長さ２０〜５０μ、幅２〜５μであシ、隔壁ケ有し、直
線状である。これらは簡単に分枝しているか、はソ直角
ないしは鋭角に、二叉に分岐したほうき状に整しく分校
している。１ないし４個のフィアライドが枝の頂点に輪
生して形成されている。これらは無色、滑面でこん棒状
ないし長だ円形’ＥＣＵＥＣ状で、頂点が若干膨張して
おり、長さ７〜１４μ、より広い部分の太さ３〜５μ、
基部の太さ１．５〜３μである。

フィアライドの中には長さ１〜２μ、太さ１μの先細に
なった短い頚部を有するものもある。これらは子鹿上に
分生子形成層を形成している。

無色または淡色、滑面の分生子は単細胞で、付属器は無
く、だ円形または卵形であって、希に円筒状ないし畏だ
円形であシ、通常に両末端が丸くなっているか、一方の
末端が僅かに截形となっており、３〜５．５（〜６．５
）Ｘ２．５〜４μの大きさである。これらは集合して円
柱状となっている長い水幕性の鎖の形状に形成されてい
る。胞子柱は粗または密で、直径５０〜５００μ、高さ
２００〜６００μで、鈍い黄緑色ないしオリーブ緑色で
ある。より古くなった培養物では、胞子鎖によシ孤立し
ており、二叉に分れている。

栄養菌糸は無色、滑面であり１分枝して隔膜を有する。

菌子細胞は円筒状であシ、長さ１６〜６０（〜８０）μ
、幅２．５〜４μである。厚膜胞子に無い。

麦芽エキヌ寒天上のコロニーに、２５℃、２週間後に直
径３．０菌に達するようにそれぞれ生育する。これらは
白色の気菌糸体で表面を覆われており、羊毛状、暗オリ
ーブ緑色ないし灰緑色および白色である。コロニーの裏
面は暗黄橙色ないし暗黄色である。黄色の可溶性色素が
培地中に拡散している。馬鈴薯デキヌトロース寒天培養
物は同条件で直径３．５ｃｍＫ達し、坦で粉状ないしフ
エｌレト状であり、暗オリーブ緑色ないし緑白色および
白色である。分生子および分生子鹿が豊富に形成されて
いる。裏面に黄褐色ないし鈍い黄色であり、黄色色素は
培地に可溶性である。

菌株Ｆ−３６００に１０〜３２℃の温度範囲で生育可能
であｐ、最適温度範囲は２４〜２５°Ｃである。この菌
株は生育最適ｐＨ範囲６〜７であシ、生育可能なｐＨ範
囲に３〜１０である。　　　′メタリジウム属の分類学
上の基準によれば（ベンチ１９３０年、ラッチ１９６４
年、ガムス＆ロッジパル１９７６年、テユーロッホ１９
７４年）、この菌株Ｆ＝３６００ｉ、だ円形分生子、こ
ん棒状分生子柄および灰緑色コロニーであるという形ａ
学的特性の点において、Ｗガムヌ＆ロッジパルのメタリ
ジウム・フラボビライド（ＭｅｔａｒＭｚｉｕｍｆｌａ
ｖｏｖｉｒｉｄｅ’）に酷似している。しかしながら、
この菌株はメタリジウム・フラボビライドとは分生子の
大きさの点で異なる。菌株Ｆ−３６００の分生子の大き
さは、３〜５．５（〜６．５）Ｘ２．５〜４μであり、
メタリジウム・フラボビライドの大きさ、７〜９（〜１
１）Ｘ４．５〜５．５μより小さい。これらの結果から
、菌株Ｆ−３６００はメタリジウム属の従来未記載の種
であると結論され一メタリジウム・エスピー（Ｍｅｔａ
ｒｈｉｚｉｕｍ　ｓｐ、”）Ｆ−３６００と命名した。

メタリジウム・アニソプリエ！−３６２２およびメタリ
ジウム・エヌピーＦ−３６００Ｕ、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションにそれぞｎ／ＩＧ、　Ａ　
Ｔ　ＣＣ２０６５３および、／％、　Ａ　Ｔ　Ｃ０２０
６５２として寄託さ扛ている。また、これらメタリジウ
ム・アニソプリエＦ−３６２２およびメタリジウム・エ
ヌビー１−３６［］ＯＵ、工業技肩 術院微生物工業技術研究所にそれぞれ徽］Ｉ寄第７１９
６号および７１９２号として寄託されている。

スワインソニン生産菌については、土壌分離株のほか自
然の突然変異によって得られる突然変異体ならびに上記
記載の微生物から、Ｘ線照射、紫外線照射、ナイトロン
エン５マスタード油等のような慣用の手段によって得ら
れる人工突然変異体を得ることによって、スワインソニ
ンの生産能を高めることができる。

この発明のスワインソニンの生産は、例えば、メタリジ
ウム・アニソプリエＦ−３６２２およびメタリジウム・
エスピーＦ−３６００等のメタリジウム属に属するスワ
インソニン生産菌株を、炭素源および窒素源を含有する
栄養培地中、例え体 ば振とう培養、液ｌ培養等の好気性培養条件下に培養す
ることにより行われる。

栄養培地中の好ましい炭素源としては、例えばぶどう糖
、果糖、グリセリン、でん粉等のような炭水化物等が挙
げられ、その他、乳糖、アラビノース、キシロース、デ
キヌトリン、糖蜜等が挙ケラれる。

好ましい窒素源としては酵母エキス、ペプトン、グルテ
ン粉、綿実粉、大豆粉、とうもろこし浸漬液、乾燥酵母
、小麦胚芽等ならびに、例えば硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
尿素、アミノ酸等のような無機および有機窒素化合物等
が挙げられる。

炭素源および窒素源は組合わせて使用すると有利である
が、生育因子の痕跡およびミネラル栄養素をかなシの量
含有する純度の低い物質も使用に適しているので、必ず
しも純粋な形で使用する必要はない。所望の場合には、
培地に、伏酸カルシゥふ、燐酸ナトリウムｌたは燐酸カ
リウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マグネシ
ウム塩類、銅塩類等のようなミネラル塩類全添加しても
よい。必要に応じて、培地が著しく発泡する場合には、
液状パラフィン、脂肪油、植物油、鉱物油またはシリコ
ンのような消泡剤ケ加えてもよい。

醗酵生産物の大量生産によく行なわｎる好ましい方法の
場合のように、スワインソニンの生産には好気的液体培
養が好ましい。小量生産の場合にはフラスコ等によシ振
とう培養または表面培養が行なわれる。ζらに１だ、大
型タンク中で培養する場合には、スワインソニンの生産
工程での生育遅延會避けるために、生産タンクに饋生物
ケ成長能力のある形で接種することが好ましい。すなわ
ち、望”！Ｌ、＜ｌｄ’！ず、最初に成長力のある敞生
物會、比較的少量の培地に該微生物の胞子′！！：たは
菌糸体全接種することにより生成させ、これらを培養し
、次いで培養した成長力のある微生物を大型タンクに無
菌接種する。

培養物の攪拌および通気は種々の方法で行なうことがで
きる。攪拌はプロペラまたは類似の機械的攪拌装置によ
るか、醗酵器の回転″ｆ、たは振とうによるか、種々の
ポンプ装置によるかまたは培地中を滅菌空気全通過させ
ることによ９行なうことができる。通気は滅菌空気を、
醗酵混合物中全通過させることにより行なうことができ
る。

醗酵に通常、約２０〜４０°Ｃの温度範囲、好ましくは
２５°Ｃで、約５０〜１００時間行なわれる。

スワインソニｙｉＪ、培地から、従来公知の他の醗酵生
産物の回収に通常便用される慣用の手段によって回収す
ることができる。

このようにして生産されたスワインソニンの大部分は通
常、培養液中に見出されるので培養液の濾過またに遠心
分離で得られたろ液から、減圧濃縮、凍結乾燥、ｐＨ調
整、例えば陰イオン−！たけ陽イオン交換樹脂、非イオ
ン吸着樹脂等の樹脂処理、例えば活性広、ケイ酸、シリ
カゲル、セルロース、アルミナ等の吸着剤処理、結晶化
、再結晶等の常法によって分離、精製される。

このようにして得られるスワインソニンは下記の物理化
学的性′＃會有する。

（１）分子量 質量分析（フィールド・デソープショ７法）Ｍ＝１７３ （２）元素分柘θ Ｃ：５４．７２．Ｈ：８．４５．Ｎニア、９４（３）　
　分子式 ％式％ （） ） ） （６）紫外部吸収ヌベクトル 端吸収 （７）　　赤外吸収スペクトル ＮｕｊＯｌ（ｇ　’Ｃ３４３０，３３５０，２９２０，
２８５０゜１３４５．１３′５０．１３２２．１５１８
．１２Ｂ１．１２６０　。

１２２０．１１８２，１１６０，１１５２．１１２５．
１１０８゜１０７３　、１０２２　、１００８　、９４
０．９２８．９００　、８３９　。

８２１．８００，７２０ （８）核磁気共鳴吸収スベク）／し ＣＤ３０Ｄ（δ）：４．０３−４．３７（２Ｈ，ｍ）、
３．５７−４．０３（ＩＨ，ｍ）、２．７７−３．１０
（２Ｈ，ｍ）。

２．２３−２．６３（ＩＨ，ｍ）、１．００−２．２３
（６Ｈ，ｍ） （９）溶解度 水、メタノール、エタノールに可溶。

酢酸エチル、アセトン、クロロホルムに難溶。

ベンゼン、エーテル、ヘキサンに不溶。

００　　呈色反応 過マンガン酸カリウム、ニンヒドリン、硫酸セリウム、
リンモリブデン酸、ヨウ素に対して陽性。

ドラーゲンドルフ試薬、エールリッヒ試薬、トリッシュ
試薬に陰性。

０υ　物質の性質 塩基性 上記物理化学的性質および別途研究の結果から該発酵生
産物に前記オーヌトラリアン・ジャーナル・オプ・ケミ
ヌトリー、１９７９年、第３２巻、２２５７〜２２６４
頁に記載され、下記化学構造式を仔するスワインソニン
と一致する。

（Ｉ　Ｓ　、　２Ｒ，８Ｒ，８ａＲ）　−１，２，８−
）リヒドロキシオクタヒドロインドリジンヌワインソニ
ンの医薬として許容される塩の好ましい例とじてにメタ
ンスルホン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝＃塩、リン酸塩等
のような有機酸もしくは無機酸との酸付加塩が挙げられ
る。

医薬組成物 スワインソニンおよび医薬として許容されるその塩は、
低下した免疫の回復のような免疫調整活性を有すること
が判明し、従ってスワインソニンおよび医薬として許容
されるその塩は、人間およ原因による免疫不全症の治療
のための免疫調整剤として有用である。

そのような疾患の例として、腫瘍、感染症−アレルギー
性疾患、自己免疫疾患、ヌテロイド依存性疾患等が挙げ
られる。

スワインソニンおよび医薬として許容されるその塩はま
た抗腫瘍剤、抗菌剤、ステロイドホルモンのような抗炎
症剤等のような薬剤投与に起因する副作用効果の予防に
も有用である。すなわち、これらの薬剤中には１時とし
てはその投与により副作用として免疫活性低下を起すこ
とがあるが、治療効果を促進する。

そのような薬剤の例としては、サイクロホスファミド、
コーチシン酢酸塩、ビンブラスチン、ビンブラスチン、
アドリアマイシン、６−メルカプトプリン、５−フルオ
ロウラシル、マイトマイシンＣ、クロラムフェニコール
等がＩＪ示される。

従って、スワインソニンおよび医薬として許容されるそ
の塩は、免疫活性低下に起因する（または、そ−Ａを伴
なう）疾患の治療に単独で、また抗腫瘍剤、抗菌剤、抗
炎症剤等と併用して、免疫調整剤として使用することが
できる。

免疫調整剤としてのスワインソニンの有用性に示Ｔため
に、スワインソニンの薬理学的試験データを以下に説明
する。

試験法 １）担癌マウスの血清からの、免疫抑制因子の調製 マウス＝８週齢の工ＣＲ／Ｊ　ＣＬ系雌マウヌを静岡実
験動物協同組合から入手した。

腫瘍：ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持されたザルコー
マ１８０（Ｓ−１８０）を実験に使用した。

免疫抑制因子の調製： ＮＣＲマウスに５−１８０懸濁液（細胞数５×１０６個
／＋＋／）、０．２πけ腹腔内に移植した。Ｓ−１８０
を有するマウスの心臓から、移植後７〜９日の間に軽度
の麻酔下に滅菌シリンジで採血し、血清全調整した。

免疫抑制因子ｋｓ−１８０担癌マウヌの血清かう、セー
キユング・ＯＨおよびＦ、Ｔ、、モドゥルトウン（ジャ
ーナル・イムノロジ−１２７巻、２３００〜２３０７頁
、１９８１年）Ｋよシ記載−ａｎだ方法に従って部分精
製した。血清（５０ｍ？）に４％燐タングヌテン酸１／
１０容および２Ｍ塩化マグネシウム１／４０容を加え、
脂質を除いて６０００×Ｇで１０分間遠心分離した。過
剰の燐タングステン酸およびマグネシウムイオンを、燐
酸塩緩衝食塩水ＣＰＢＳ：　０．１５　Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．０１Ｍ燐酸緩衝液、１＞Ｈ７，４）ＶＣ対
して透析して除去した。

次いで、部分脱脂質血清′に硫酸アンモニウム５０％飽
和により沈殿させた。上清液に２００００×Ｇで６０分
間遠心分離して除去した。沈殿を少量の水に再溶解し、
ＰＢＳに対し４°Ｃで一夜透析した。透析溶液’１ＰＢ
ｓ中でセファデックヌａ　−２００によるカラムクロマ
トグラフィーに付した。

各溶出液（１５＋＋＋／）の免疫抑制活性全検定した。

（２）免疫抑制活性検定法 免疫抑制活性をマイトジェン誘発マウス牌臓和１胞増殖
阻止検定により所定した。

（３）試験管内における免疫抑制因子によるマイトジェ
ン誘発マウヌ牌緘細胞増殖抑制および、スワインソニン
によるその回復 試験管内におけるマウヌ牌臓細胞に対するマイトジェン
活性； ａ）マウヌ：８週齢のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ系雌マウヌ全
使用した。

ｂ）組織培養培地：使用した組織培養培地としては、ロ
ズウエル・パーク・メモリアル・インヌティテユー）（
ＲＰＭ工）−１６４０で考案された完全培地を使用した
。使用した培地はすべて、ペニシリンＧ１００単位／ｍ
ｌおよびストレプトマイシン硫酸塩１００μｇＡｌなら
びにウシ胎児血清５形？含有するものであった。

Ｃ）牌城細胞の調製：牌臓會無菌条件下に切除し、ハン
クヌ溶液で洗浄し、次いで組織培養培地に入れた。細胞
は組織培養培地に細胞数５×１０５個／ｙｎｌ含有する
ように懸濁した。

ｄ）培養条件：組織培養用マルチディツシュ（ファルコ
ンＡ３０４０）の各穴に上記マウヌ牌臓細胞懸濁液０．
１　ｍｌおよび、所定濃度の化合物溶液０．１πｌおよ
び／または所定濃度の前記免疫抑制因子溶Ｗ０．１ｍｌ
’ｅ分注した。さらにコンカナバリンＡｉ細胞刺戟のた
めに、最終濃度で１μＩ／ｍｌ添加した。

培養物を炭酸ガス細胞培養恒温器中（空気９５％、ＣＯ
３５％）６７°Ｃで４８時間培養した。

ｅ）マイトジェン誘発マウス牌臓細胞増殖の検定：マイ
トジェン誘発マウヌ牌臓軸胞増殖を、トリチウム標識チ
ミジン（３Ｈ−チミジン）の取込みによシ検定した。試
験ではすべて、１０マイクロキユーリー（μＣ１）／π
ｌの３Ｈ−チミジン２’０ｔｔｔ！を前述したマウヌ牌
臓細胞の４８時間培養液を含む各穴に加えた。そしてさ
らに２４時間培養した後、細胞ＦＦ紙、ワットマンＧＦ
８３に用いて濾過し、食塩水および５％トリクロロ酢酸
で順次洗浄した。

Ｐ紙全乾燥し、シンチレータ−〔ｐ−ビス−（５−フェ
ニルオキサゾール）ベンゼン０．１Ｆおヨヒ２．５−ジ
フェニルオキサゾール４　ｆ　’ｌｒ含ｔｒ　）　ルー
ｒ−ン１１中に入ｆｉ、ＤＮＡ中に組込！ｆ’Ｌ７’ｃ
Ｈ−チミジン全測定した。

牌臓帷胞のマイトジェン反応に対する免疫抑制因子の抑
制作用およびスワインソニンによるその回復金策１表に
示す。

担癌マウス血清から調製した免疫抑制因子は、マウス牌
臓細胞によるマイトジェン誘発３Ｂ−チミジン取込み促
進を著しく抑制した（第１表）。

この抑制効果に加える抑制因子の量に依存した。

スワインソニンを免疫抑制因子含有培養物に加えると、
免疫抑制が阻止さ扛た。この結果は、スワインソニンが
免疫抑制因子によるマウヌ牌１覧軸胞のマイトジェン反
応の低下ケ阻止する能カケ有すること？示している（表
１）。

さら１（また、スワインソニンをマウス牌臓細胞培養物
に加えても、マイ）Ｍエン活性會示さず、また牌臓細胞
の生育にも影響ケ与えなかった。

コンカナバリンＡおよびスワインソニンを培養物に同時
に加えた場合、マウヌ牌臓細胞のコンカナバリンＡ刺戟
による　Ｈ−チミジンの取込み促進はコンカナバリンＡ
を単独で使用した場合よシも約１０倍増加した。

スワインソニンによるコンカナバリンＡのマウス牌臓細
胞に対するマイトジェン活性の促進は、この物質がサプ
レッサーＴｉ胞の幼若化増強作用を有すること、および
この物質がアレルギー性疾患、自己免疫疾患等に罹患し
た人における免疫抑制薬として使用されうろことを示し
ている。

第１表 ２３− ＝２４− 米註、ｃｐｍ　は６組の培養物の平均値によるその回復 ８週齢のＣ５７ハＬ　系雌マウヌ、ならびに８週齢のＢ
ＡＬＢ／Ｃ系雌マウヌを層殺し、牌臓を無菌条件下に切
除して、それぞれの単細胞懸濁液をヌチムレーターおよ
びエフェクターとした。培養に先立って刺戟細胞をマイ
トマイシンＣ２００μｆΔａで３７°Ｃ１４５分間処理
し、次いでＰＥｌ５によシロ回洗浄した。

これら全反応混合物の最終濃度で稠胞数０．２×１０６
個１０．’２ｔｌとし、組織培養用マルチディツ２６一 シュ（ファルコンＡ、３０４０）中、１０％のウシ胎児
血清および５×１０−５Ｍの２−メルカプ１−エタノー
ルを添加したＲＰＭＩ培地ケ用いて培養した。

１２０時間培養し、培養終了前に２４時間３Ｈ−チミジ
ンによシパルヌー標識した。細胞を集めて放射能ケ計数
した。

担癌マウス血清の免疫抑制因子は、混合リンパ球反応で
刺戟てれたマウヌ牌臓細胞Ｈ−チミジンの取込みを抑制
した。

免疫抑制因子をスワインソニンと共に培養した場合、抑
制作用に解除された。

スワインソニンケ混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）に加え
た場合、混合リンパ球反応で刺戟てれた牌臓細胞の　Ｈ
−チミジン取込み量が顕著に増加した。

この結果は、スワインソニンがギラーＴ−細胞の発生全
誘発しうろこと全示している（表２）。

第２表 ２７− 注）米ｃｐｍ　は５組の培養物の平均値るその回復 ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する牌リンパ球生成抗体
會、ヤーン　プラーク検定法のカンニンガム修正沃（ｐ
、　、　：ｒ　、カンニンガム、ネーチャー誌、第２０
７巻、１１０６〜１１０７頁、１９６５年）＝２８− ケルいて定量した。

８週齢のＢＤＦ工糸雌マウヌに、免疫抑制因子０．２ｍ
権、５ＲＢＣ５Ｘ、１０８個による免疫処置４日前から
４日間毎日静脈内注射した。試料全マウスに免疫処置前
に４回腹腔内投与した。マウスを５ＲＢＣ注射４日後に
層殺し、牌臓当シのプシクＩｆ形成細胞（ＰＦＣ）数を
測定した。

第６表に生体内における抗体産生能力に対する免疫抑制
因子の抑制活性およびスワインソニンによるその回復を
示す。

担癌マウス血清からの免疫抑制因子にマウス中の５ＲＢ
Ｃに対する抗体産生能力全抑制した。

ヌワインソニン全腹腔内投与した場合、免疫抑制因子注
射マウスの抗体産生能力は回復して、ＢＲＢＣに対する
抗体を産生じた。スワインソニンに正常マウスの、５Ｒ
ＢＣに対する抗体産生能力全増大させなかった。

第６表 免疫抑制因子（静脈内投与） ＰＦＣ測定 スワインソニン（腹腔内注射） よびスワインソニンによるその回復 ８　週１１ｔ６ノＩ　ｃ　Ｒ糸雌マウスに、ザルコーマ
１８０懸濁液（細胞数５×１０６個／簿ｌ）０．２肩ｌ
を腹腔内接種した。５ＲＢＣ５Ｘ１０　　個によシ免疫
処置する６日前丁で、試料？５日日間毎マウヌに腹腔内
投与した。

免疫処置５日後に、牌臓当シのブラシか形成細胞数を測
定した。

第４表に担癌マウスにおける免疫抑制状態およびスワイ
ンソニンによるその免疫反応回復を示す。

スワインソニン投与により、担癌マウスの５ＲＢＣに対
する抗体産生能力が回復した。

スケジュール よるその回復 ８週齢のＢＤＦ、系雌マウヌに、５ＲＢＣ５Ｘ１０８個
による免疫処置４日前から、６日間毎日マイトマイシン
Ｃ（ＭＭＣ）（１〜Ａ’り’ｘ腹腔内注射した。

試料も免疫処置４日前から、マウスに５日間毎日腹腔内
投与した。

９日日にマウスを屠殺して牌に当シのプラーク形成細胞
数音カンニンガム修正沃によシ測定した。

第５表に生体内におけるマイトマイシンＣの免疫抑制活
性およびスワインソニンによるその回復を示す。スワイ
ンソニンを投与した場合、マイトマイシンＣを注射した
マウスの、５ＲＢＣに対する抗体産生能力が回復した。

第５表 スケジュール ＭＭＣｉ■／ｋｆｌ／１日（腹腔内投与）　ＩＬ （腹腔内投与） ミドの免疫抑制作用およびヌワインソニ８週齢のＢＤＦ
ｌ糸雌マウヌに、５ＲＢＣ５Ｘ１Ｑ８個による免疫処置
４日前に、ザイクロホスフ７ミ　　□ド（ＣＹ）　（２
２，５ダ／ｋＬ！　）を腹腔内注射した。試料全マウス
に免疫処置４日前から５ＥＩｌｌ：ｌ毎日ｎｌ腔内投与
した。

５ＲＢＣに対するマウス牌職当り抗体産生数を前記カン
ニンガム修正法を用いて定量した。

第６表に生体内におけるサイクロホスファミドの免疫抑
制作用およびスワインソニンによるその回復を示す。ス
ワインソニンの投与により、サイクロホスファミドを注
射したマウスの、５ＲＢＣＫ対する抗体産生能力が回復
した。

スケジュール スワインソニン（ＪＩ艮腔内） 第６表 ５週齢のｄｄＹ系雄マウ７全使用した。試料を実験開始
０日目から２日目すで、１日当９２回皮下投与した。実
験開始日の第１回目の投与から５時間後に、マウスにデ
キサメサゾン１μｆｌｌｔｎｌ　全含有する飲料水を与
えた。

２日目に処理マウスの胸腺重量を無処理コントロールの
重量と比較した。結果を第７表に示す。

スワインソニンはマウスのデキサメサゾン誘発胸腺萎縮
を予防する。この事実に、デキサメサゾンによって誘発
烙扛た免役抑制會、この化合物が回復しうろことを示し
ている。

第７表 １）胸腺重量〃僚／マウヌ（ｎ＝５） ザルコーマ１８０（Ｓ−１８０）細胞（泊■胞数１×１
０　個）を、８週齢のＩＣＲ系雌マウスに腹腔内接種し
、次いでその後スワインソニン全５日間毎日腹腔内投与
した。腫瘍細胞接種１５日後に、腹水中の１ｌｔＩ！瘍
細胞容量を遠心分離によって沈降する細胞の総容量で測
定した。第８表に示すようにスワインソニンはマウスの
移植可能な肺癌の生Ｗを阻止する。

１）毎分１０００回転、１０分間遠心分離ヌワインソニ
ンのＣ１ｄＹ系マウスにおける急性毒性は、静脈注射の
場合１ｇ／ｋｇ以上である。

この発明の免疫調整剤は、例えば、この発明の有効物質
を外用、経口または非経口投与に適した有機もしくは無
機担体もしくは賦形剤と混合して含有する固体状、半固
体状または液体状の製剤の形で使用することができる。

有効成分は、例えば、錠剤、ベレット、カプセル、坐剤
、溶液、エマルジョン、懸濁液および通常熊野で医薬と
して許容される担体と混合して適当な列形にして使用さ
れる。ここで担体としては水、ぶどう糖、乳糖、アラビ
アゴム、ゼラチン、マンニトール、でン粉ベースト、マ
グネシウムトリシリケート、タルク、とうもろこしでん
粉、ケラチン、コロイドシリカ。

馬鈴薯でん粉、尿素および固体状、半固体状、または液
体状の製剤を製造する際使用に通した他の担体であり、
さらにまた補助剤、安定化剤、濃稠化剤および着色剤な
らびに香料を使用してもよい。

この免疫調整剤に捷だ、所望の製剤中の有効成分の活性
全安定に維持するために保存剤または静菌剤を含んでい
ることもできる。この免疫調整剤中に含有される有効な
目的化合物の量は、疾患の過程と状態に対して所望の治
療効果を発揮するのに充分な量である。

この免疫調整剤を人に適用する場合、静脈内、筋肉内ま
たは経口投与によシ適用することが好丑しい。この発明
の目的化合物の投与量またに治療有効量に、処置すべき
個々の患者そ扛ぞｎの年齢および条件によって変化する
が、人ぼたは動物に対して一般的には有効成分１日投与
量約０．１〜１００１Ｎｆ／／ｋ（ｊが治療のために投
与され、通常１回約５０９．１００ｑ、２５０〜．５０
０ｑが投与される。

また、スワインソニンまたは医薬として許容される塩と
抗癌剤、抗菌剤、抗炎油剤等と併用する場合の併用割合
に、病気の種類、薬剤の種類等によって異なるが、一般
的にはヌワインソニントに対し併用する薬剤０．００１
〜１０程度が適当であ実施例１ 第１表に示す種培地を１０個の５００ａｖ／エルレンマ
イヤーフラスコにそれぞれ分注し、１２０°Ｃで６０分
間滅菌する。メクリジウム・アニソプリ工Ｆ−３’６２
２斜面培養物の１白金耳全各培地に接種し、２００　ｒ
ｐｍ″′ｒ：３インチ幅の回転大振とり培養機で２５°
Ｃ１９６時間培養する。培養物を予じめ１２０°Ｃで３
０分間滅菌しておいた２００１の醗酵槽中の同じ種培地
（８０７？）に接種し、毎分８０１の通気下、２６５　
ｒｐｍ　の攪拌下に、２５°Ｃで４８時間培養する。種
培養物６５βを、予じめ１２０°Ｃで３０分間滅菌して
おいた２００’Ｃ１ｇのステンレヌスチール製醗酵糟中
の第２表に示す生産培地ｔ１７６０ｇ）に接種し、１７
６０ｇ／分の通気下、１８０ｒｐｍ　　Ｉ７）攪拌下に
２５°Ｃで７２時間培養する。

第１表　種培地の組成 第２表　生産培地の組成 このようにして得ら扛る培養ブロス全、珪藻土ｔ５ｍ）
を用いて沖過する。得られる炉液（１６００１）全６Ｎ
水酸化ナトリウムによシｐＨ７，０に調整し、活性炭カ
ラム＜３５０１？通過させる。

活性度カラムを水洗（６００１Ｌ、５０％アセトン水（
７’　ＯＯ＃　）で浴出する。有効画分を容量４２ｇ１
で減圧濃縮し、メタノール８０　Ｉ！に７Ｊ１１．する
。生成する沈殿を枦取し、ろ液を容量３０１１で減圧濃
縮して６Ｎ水酸化す）　ＩＪウムで中和する。

中和した溶液全０ＭセファデックスＣ−２５（Ｈ＋型＋
　１０＃）のカラムに付す。０Ｍセファデックスのカラ
ムを脱イオン水（２０Ａ’）で洗浄し、次いで０．１Ｍ
塩化ナトリウム溶液（４０１で溶出する。有効画分を合
わせて２８％アンモニア水で１１）Ｔ１０に調整し、活
性炭カラム（４ｇ）を通過させる。活性炭カラム全水洗
（８１Ｌ、１０％アセトン水（’１０＃）で溶出する。

有効画分を容量２Ｊｌ’Ｆで減圧濃縮し、６Ｎ塩酸でｐ
’ａ　３．［ｌに調整した後、活性炭カラム（１ｇ）に
付す。

次いで有効成分金水４ｇで溶出する。有効画分を合わせ
て２８％アンモニア水でｐＨｉ　ｏに調整し、活性炭カ
ラム（４００ｍｌ）’Ｔｈ通過させる。活性炭カラム會
水洗（８００ｍｌ）Ｌ、１０％アセトン水（１ｇ）で溶
出する。有効画分全減圧下に濃縮乾固（８，１ｇ）する
。この粗試料を水２０ｙｓｌに溶解してシリカゲルを使
用するカラム（６００πｌ）クロマトグラフィーにイ」
シ、ｎ−ブタノール：エタノール：クロロホルム＝２８
％アンモニア水（４：４：４：１）の混液で展開する。

溶出した有効画分ケ合わせて減圧下に濃縮乾固する。こ
の粗試料全７．に２００肩ｔに溶解し、活性炭カラム（
５０ｙｎｌ）を通過させる。水洗後、カラム全１０％ア
セトン（２００ｍ／）で溶出する。有効画分全減圧下に
濃縮乾固して、スワインソニン（，１，６ｆ！　）　ｋ
遊ＩＩｌ′塩基として得る。スワインソニンの無色の結
晶はエタノールから得られる（針状結晶、９００Ｗ＆）
。

実施例２ 下記成分の培地（ｐＨ６）（８０ゴ）を２０個の２５０
ｍ／フラスコに入れ、１２０°Ｃで６０分間滅菌する。

可溶性でん粉　　　　　　　　　　　　　１％とうもろ
こしでん粉　　　　　　　　　　１％ぶどう糖　　　　
　　　　　　　　　　　１％コーンスチープリ力−　　
　　　　　　０．５％乾燥酵母　　　　　　　　　　　
　　　０．５％綿実粉　　　　　　　　　　　　　　０
．５％ｃａｃｏ３０．２％ メタリジウム・エスピーＦ−３６００の斜面培養物の１
白金耳を各培地に接種し、回転式振とう培養機で４日間
培養する。

一方別に、下記成分よりなる培１ａ（ｐＨ６）（１６０
ｆｆ　）ｋ２００ｆｆの醗酵槽に入れ、１２０°Ｃで３
０分間滅菌した後、上記培養物全容をこれに接種し、次
いで２５°Ｃで４日間培養する。

可溶性でん粉　　　　　　　　　　　　　４％ぶどう糖
　　　　　　　　　　　　　　　１％落花生粉　　　　
　　　　　　　　　　　６％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，
０５％ Ｃ０ＣＥ２・６Ｈ２０、０，０００４％ｃａｃｏ３０．
２％ アデカノール　　　　　　　　　　００２５％このよう
にして得られる培養ブロス全珪藻±（４ｋｑ）を用いて
濾過する。ろ液（１５０１全６Ｎ水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７に調整し、マクロポーラヌ非イオン吸着樹脂、ＨＰ
−２０（商標、４３− 三菱化成社製）（５０１０力ラムケ通過きせる。

カラム全１０％メタノール１００１でン容出する。溶出
液を容積１０Ｅ１で減圧濃縮し、濃縮液をＣＭセファデ
ックスＣ−２５（Ｈ」−型）（２ｆｆ）充填カラムを通
過させる。次いで０．１Ｍ塩化ナトリウム（５ｅ）で浴
出し、溶出液全２８％アンモニア水でｐａｌｏに調整す
る。この溶液をＨＰ−２０充填力ラムケ通過させる。カ
ラム全１０％メタノール（４Ｅ）で溶出し、溶出液を減
圧濃縮する。濃１ａ液をシリカゲル全使用するカラム（
２００πｌ）クロマトグラフィーに付し、ｎ−ブクノー
ル：エタノール：クロロホルム：２８％アンモニア水（
４：４：４：１）の混液で展開する。有効画分？合わせ
て減圧濃縮し、濃縮液全クロロホルムに加熱下に溶解す
る。溶液ケ沖過し、炉液全室温で放置する。このように
して得られる結晶？集め、乾燥して、スワインソニン（
１５０■）全無色の針状結晶として得る。

実施例５ スワインソニン（２５０屑Ｖ）ｋ滅菌蒸留水（２４４− ゴ）に浴解し、１Ｎ塩酸でｐＨ７，０〜７．２に調整す
る。この溶液をバイアルびん中に移し、凍結乾燥する。

バイアルびん全使用する場合には、注射用滅菌蒸留水全
バイアルびんに加え、次いで水溶液全注射により投与す
る。

実施例４ スワインソニン　　　　　　　　　　２５０〜１００メ
ツシユ乳糖　　　　　　　　　５０■でん粉　　　　　
　　　　　　　　　　５０■ヌテアリン酸マグネシウム
　　　　　　　６ｑ上記成分全混合した後、硬質ゼラチ
ンカプセル中に慣用の方法によって挿入する。

実施例５ 錠剤用の好適な処方は、下記混合物よりなるものである
。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）メタリジウム属に属するスワインソニン生産菌を
   培地に培養し、得られる培養物からスワインソニンを分
   離、採取すること全特徴とするスワインソニンの製造法
   。
2. （２）スワインソニンまたは医薬として許容されるその
   塩會含有すること全特徴とする免疫調整剤。