RU2323966C2 - Штамм гриба trametes pubescens c-23 - продуцент эргостерина и препарат, положительно влияющий на тканевый обмен, стимулирующий иммуногенез и способствующий восстановлению нарушенной оксидаз-смешанной функции печени - Google Patents

Abstract

Штамм гриба Trametes pubescens ВКПМ F-839 характеризуется повышенным синтезом эргостерина. Содержание эргостерина в биомассе составляет 0.28 г/100 г. Препарат представляет собой высушенную и отделенную от посторонних примесей биомассу штамма гриба Trametes pubescens ВКПМ F-839, содержащую, мас.%: общий белок 45, углеводы 27, липиды 4,5, нуклеиновые кислоты 4, минеральные вещества 7, витамины 0,4. Препарат положительно влияет на тканевый обмен, стимулирует иммуногенез и способствует восстановлению нарушенной оксидаз-смешанной функции печени. 2 н.п. ф-лы, 12 табл.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым штаммам микроорганизмов и лекарственным препаратам, производимым на основе этих штаммов.

Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано при онкологических заболеваниях и болезнях печени.

Предшествующий уровень техники

Известно, что плодовые тела грибов рода Trametes (современный синоним ранее применяемого наименования рода Coriolus), в частности, C.versicolor используют в народной медицине Японии как лекарственные растения (Cochran K.W. The biololigy and cultivation of edible mushroom. - New-York: Acad. Press., 1978, p.168-197; Ikekawa et al., 1968). Гиполипидемическая активность этих грибов подтверждается и в опытах на животных (Cohran, 1978; Ginter, Bobek, 1988).

С гиполипидемической и гипохолестеринемической активностью тесно связано их антисклеротическое и антиатерогенное действие. По данным Института питания РАМН спиртовый экстракт плодовых тел Trametes pubescens обладает in vitro антисклеротической активностью, что проявляется в снижении внутриклеточного общего холестерина и подавлении клеточной пролиферации (Ли Хва Рен и др., 1989; Ryong et al., 1989).

Известно также средство для лечения и профилактики гиперлипидемии (Jp В Заявка №3-61651, А61К 35/84, опубл. 91.09.20 №3-1542), содержащее гликопротеин, получаемый экстракцией плодовых тел или культивированного мицелия Trametes.

Уже давно полисахариды из грибов Trametes используются в качестве терапевтических средств при пневмонии, бронхите и некоторых других заболеваниях (патент США №4289688, 1979, приоритет Японии №40105, 1979). Есть сведения, что азотсодержащие полисахариды (гликопротеины) из T.versicolor увеличивают чувствительность бактерий к антибиотикам (заявка Франции №2387038, 1978). В частности, запатентован препарат, получаемый экстракцией мицелия гриба Trametes, который обладает антиревматическим, гемостатическим, анальгезирующим, гиполипидемическим и противовоспалительным действием. Препарат снижает содержание сахара в крови, повышает приток крови в коронарные сосуды, снижает артериальное давление, оптимизирует содержание белка в крови, улучшает протеинэмию, регулирует образование или обмен простагландинов (патент ФРГ №3429551, 1985).

Полисахариды, экстрагированные из T.versicolor, обладают антивирусной и иммуностимулирующей активностью (Chen et al., 1986). В частности, из мицелия и плодовых тел Trametes путем их экстрагирования предложено получать препарат для лечения ретровирусных инфекций, например, СПИДа (заявка ЕПВ №0295962, 1989), а азотсодержащий полисахарид из Trametes восстанавливал уровень иммунного ответа в организме в случае его снижения (патент США №469978, 1987).

Белково-полисахаридные комплексы, обладающие противоопухолевой активностью, экстрагируют из мицелия и плодовых тел таких видов рода Trametes, как T.versicolor, T.conchifer (Schw.) Pat., T.pargamenus (fr.) Pat., T.hirsutus (Fr.) Quel, T.mioformis (Klotz.) Pat., T.consors (Berk.) Jmaz., T.pubescens (Fr.) Quel. (патент США №4209688, 1988; патент Великобритании №1 521168, 1978; заявка Франции №2335235, 1977; патент Японии №150114, 1975; патент Великобритании №1538399, 1979).

Наиболее известным препаратом, получаемым на основе гриба Trametes versicolor, является крестин (PSK). В Японии крестин выпускается с 1977 года фирмой «Sankyo» (Химико-фармацевтические производство за рубежом. Экспресс-информация. ВНИИСЭНТИ, 1988, вып.1, с.7-12). Известно, что крестин оказывает влияние на Т-клеточный иммунитет (Ва, Denian et al, 1981). Установлено, что он усиливает резистентность организма к некоторым инфекционным заболеваниям, вероятно, за счет активации макроофагов (Denin et al 1981.) В клинической практике иммунологические свойства крестина используются при лечении рака (Akiyoshi, Tsuyoshi et al., 1981).

Известны препараты, содержащие связанные с белками полисахариды, экстрагируемые из плодовых тел Trametes pubescens, обладающие противоопухолевой активностью (патент США №4289688, 1981; патент Японии №704431, 1979), а также азотсодержащие полисахариды (патент Великобритании №1521168, 1978; заявка Франции №2335235, 1977, приоритет Японии №150114, 1975; заявка Японии (В) №63-28413, 1988). Однако лечебная эффективность этих препаратов невысока. Синтеза эргостерина известными штаммами гриба и наличия его в препаратах, производимых на основе биомасс или плодовых тел Trametes pubescens, не обнаружено.

Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемому объекту является способ получения полисахарида с повышенным противоопухолевым и иммуностимулирующим эффектом путем экстрагирования Trametes pubescens водным растворителем с рН 4-10 при температуре 3-27°С, отделением вещества с молекулярной массой не менее 8000 и обработкой экстракта методом гельфильтрации при 3-27°С (Япония В, заявка №63-28418, заявлена 57-57-122016 82 07 15, опубл. 88.06.08 №3-711, заявитель Фудзивара Муцидзи и др., А-61К 35/84, С08В 37/00).

Однако средство, получаемое по указанному способу, также недостаточно эффективно, а все попытки его улучшения оказались безрезультатными.

По-видимому, достичь требуемой эффективности с помощью описанных выше средств даже путем их усовершенствования невозможно, поэтому задачей настоящего изобретения является нахождение наиболее перспективного штамма гриба Trametes pubescens, и создание на его основе более эффективного препарата, обладающего гепатопротекторными, онкостатическими и иммуномодулирующими свойствами, удовлетворяющими современную медицину.

Раскрытие изобретения

Поставленная задача решается тем, что найден новый штамм, зарегистрированный как штамм С-23 (ВКПМ F-839) гриба Trametes pubescens, обладающий более эффективными, чем известные штаммы, гепатопротекторными, онкостатическими и иммуномодулирующими свойствами, разработан способ глубинного выращивания биомассы этого штамма, дающий возможность получения ее в промышленном масштабе, и на основе этого штамма создан абсолютно безопасный для человека и животных препарат, существенно стимулирующий иммуногенез организма и способствующий восстановлению нарушенной оксидаз-смешанной функции печени. Препарат легко производится и хранится, поскольку состоит лишь из высушенной и отделенной от посторонних примесей биомассы природного штамма С-23 ВКПМ F-839 гриба Trametes pubescens. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов «ГНИИгенетика» под регистрационным номером ВКПМ F-839.

Биомассу нового штамма С-23 (ВКПМ F-839) гриба Trametes pubescens получают биотехнологическим способом путем глубинного культивирования в жидкой стерильной питательной среде, включающей углеводы, минеральные азот- и фосфорсодержащие соли и мочевину.

Культуру выращивают в ферментационном аппарате при аэрации от 0,1 до 2,0 об/об.мин с перемешиванием 50-300 об/мин или без него, при температуре 20-40°С, в диапазоне рН 3,0-7,5 на среде, содержащей мелассу, аммонийные соединения, фосфаты и мочевину. Процесс культивирования может составлять 24-72 часа.

Посевной материал вносят в широких пределах - от 2% до 50% от объема среды. Он готовится следующим образом. Культуру, выращенную на агаризованном пивном сусле в пробирках, колбах или биологических матрацах, переносят в колбы с жидкой питательной средой (например, пивным суслом, средой с мелассой). Инокулирование может проводиться агаровыми блоками, измельченными кусочками среды с мицелием, гомогенизированным мицелием, выращенным поверхностно на жидкой среде, или крупными частями колоний без их измельчения. Инокулированные колбы помещают на качалку. Процесс культивирования составляет 150-220 часов. Полученную таким образом глубинную культуру используют в качестве посевной (с гомогенизированием или без него) при дальнейших пересевах в процессе лабораторной подготовки посевного материала для производства. В технологической схеме допустимо последовательное выращивание нескольких генераций культуры в жидкой питательной среде в колбах и аппаратах-инокуляторах перед переносом в ферментационный аппарат.

В процессе выращивания продуцента на всех стадиях применяют микроскопический и микробиологический контроль чистоты и морфолого-физиологического состояния культуры. Процесс выращивания монокультуры продуцента осуществляют в строго стерильных условиях. Используемую для приготовления среды мелассу заранее проверяют на биологическую доброкачественность.

Культивирование продуцента может осуществляться в периодическом или приточно-отъемном режиме.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют фильтрованием, промывают холодной водой, прессуют и высушивают горячим воздухом при температуре не менее 70°С, после чего подвергают измельчению и стандартизации. Готовый препарат маркируют, паспортизируют и герметически упаковывают.

Характеристика культуры

Культурально-морфологическая характеристика.

На агаризованном сусле культура гриба образует колонии сначала белые пушистые, хлопковато-шерстистые, затем войлочные, со временем образующие кожистую пленку. Периферическая часть колонии менее плотная. Край колонии гладкий, прижатый, реверзум не измененный, затем побелевший. При старении колонии приобретают желтоватый или кремоватый оттенок, образуют зачатки плодовых тел кремового цвета в виде бугорков 3-10 мм в диаметре, часто сливающихся, или плодовые тела в виде сидячих шляпок-дисков с приподнятыми краями, часто сливающимися, с неясной зональностью, белых, со временем желтеющих до изабеллового цвета. Иногда образуются плодовые тела (всегда однослойные) с хорошо развитым гименофором и базидиоспорами (светло-желтыми в порошке). Запах приятный, грибной. Чашка Петри диаметром 90 мм при температуре 26°С зарастает культурой гриба за 6 суток.

Гифы септированные, септы долипоровые. Гифы трех типов (тримитический тип мицелия) разветвленные, ветвление под прямым углом, диаметр гиф 0,8-1,6 мкм; 2,0-3,0 мкм и 2,0-4,0 мкм. Образует в культуре пряжки одиночные, большие, крутоизогнутые, чаще без просвета. Нерегулярно образует хламидоспоры, артроспоры и оидии. Образует кристаллы призматической, кубической и игольчатой формы.

Дает положительную реакцию на наличие экстрацеллюлярных оксидаз по Бавендамму. На агаризованном сусле с галловой кислотой образует темный пигмент, при этом диаметр пигментированной зоны больше, чем диаметр колонии (колонии с темно-коричневым ореолом).

На поверхности жидкого пивного сусла (4° по Баллингу) образует пушистую войлочную пленку, со временем уплотняющуюся до кожистой, на поверхности которой закладываются зачатки плодовых тел.

В глубинной культуре - мицелиальные агломераты сферической или неправильной формы. В центральной части глобул гифы утолщены, искривлены, в крупных глобулах на срезе наблюдается зональность, полости. В зависимости от условий культивирования глобулы гладкие или опушенные, диаметром от 1 до 8 мм (чаще 2-5 мм). На средах с мелассой и этанолом легко переходят к дисперсной форме роста.

В глубинной культуре гифы активно ветвящиеся, длинные, цитоплазма имеет гомогенную структуру, липидных включений и вакуолей мало, концы гиф закруглены. При неблагоприятных условиях в культуре появляются вздутые широкие клетки неправильной формы. Концы гиф приобретают вздутую или пикообразную форму. Преобладают поздние возрастные фазы, характеризующиеся большим количеством липидных включений и вакуолей, иногда инкрустацией кристаллами и каплями масла. Кристаллы кубической, призматической или игольчатой формы. В дисперсной культуре не наблюдается образования кубических кристаллов, обильно присутствующих на поверхности глобул в старой культуре. Образует хламидоспоры, артроспоры и оидии. Гифы разветвляются под прямым углом, преимущественно двух типов: тонкие (0,8-1,6 мкм) и толстые (2,0-4,0 мкм). Пряжки одиночные большие крутоизогнутые, чаще без просвета.

Физиолого-биохимическая характеристика

Культура утилизирует глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, крахмал, раффинозу, глицерин, галактозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, этанол.

В качестве источника азота использует органические формы азота (пептон, мочевину, аспарагин) и аммонийные соли.

Разжижает желатин. Молоко свертывает и пептонизирует.

Растет в диапазоне температур от +24°С до +34°С, выдерживает температуру от +2°С до +40°С, оптимальная температура радиального роста +30°С.

Растет в интервале рН 3,0-7,5 при оптимуме 4,0-6,0.

Для роста требует кислород воздуха.

Патогенность

Штамм абсолютно не патогенен и безвреден для человека и животных. Относится к экологической группе дереворазрушающих сапротрофов.

Антагонистические свойства

Антибиотиков не образует. Устойчив к стрептомицину и пенициллину, подавляется нистатином.

Биотехнологическая характеристика.

При стерильном выращивании в условиях периодического глубинного культивирования на среде следующего состава (%): меласса свеклосахарная - 1,5 по редуцирующим веществам; аммоний азотнокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; мочевина - 0,07; с дозой засева 10,0 об.%, в условиях непрерывного мягкого перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,5 ммоль кислорода/л.мин, накопление биомассы происходит через 24-48 часов культивирования и составляет 7-8 г/л среды по абсолютно сухому веществу.

Хранение штамма

Штамм хорошо сохраняется на агаризованном пивном сусле при температуре +4°С-+6°С с периодическими пересевами через полгода.

Препарат на основе нового штамма С-23 (ВКПМ F-839) гриба Trametes pubescens.

Для лучшего понимания изобретения большинство параметров заявляемого препарата представлены в табличной форме.

Список таблиц.

Таблица 1. Аминокислотный состав препарата.

Таблица 2. Жирнокислотный состав препарата (% от суммы).

Таблица 3. Содержание биологически активных фосфолипидов.

Таблица 4. Содержание витаминов группы В.

Таблица 5. Содержание макро- и микроэлементов.

Таблица 6. Изменение уровня опухолевых маркеров после приема нового предложенного препарата.

Таблица 7. Аминокислотный состав препарата в примере 1.

Таблица 8. Аминокислотный состав препарата в примере 3.

Таблица 9. Аминокислотный состав препарата в примере 4.

Таблица 10. Содержание макро- и микроэлементов в препарате в примере 4.

Таблица 11. Изменение показателей, отражающих состояние клеточного иммунитета при приеме препарата.

Таблица 12. Изменение оксидаз-смешанной функции печени человека под действием препарата.

На основе культуры Trametes pubescens штамм С-23 создан препарат, обладающий гепатопротекторными, онкостатическими, иммуномодулирующими свойствами, состоящий из высушенной и отделенной от посторонних примесей биомассы природного штамма, влияющий на тканевый обмен, стимулирующий иммуногенез и способствующий восстановлению нарушенной оксидаз-смешанной функции печени. Химический состав препарата, мас.%:

Общий белок - 40-50;

Углеводы - 25-30, в том числе полисахариды (бета-гликаны) - 1-4;

Липиды - 3,5-5,0, в том числе ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, эргостерин.

Нуклеиновые кислоты 3,0-4,5.

Минеральные вещества - 6,5-8,5, в том числе кальций, калий, фосфор, магний, железо, медь, цинк, хром, кобальт, марганец, молибден.

Витамины: 0,35-0,45, в том числе B₁ (тиамин), B₂ (рибофлавин), В₃ (пантотеновая кислота), В₆ (пиридоксин), фолиевая кислота, РР (никотиновая кислота), биотин, холин. Вода - остальное.

Таблица 1 Аминокислотный состав препарата
Аминокислота	Содержание, % асв
Изолейцин	2,7-3,2
Лейцин	2,6-3,4
Лизин	2,7-3,9
Метионин+цистин	(0,3-0,5)+(0,9-1,2)
Фенилаланин+тирозин	(1,1-1,6)+(1,2-1,6)
Триптофан	0,80-0,91
Треонин	2,0-2,3
Валин	1,8-2,1
Гистидин	1,6-1,8
Аргинин	2,0-2,2
Аспарагиновая кислота	3,7-4,2
Серии	2,2-2,8
Глутаминовая кислота	6,0-7,2
Пролин	1,0-1,4
Глицин	2,0-2,7
Аланин	2,2-2,9

Общий состав углеводов типичен для базидиальных грибов. Биологически активная фракция водорастворимых полисахаридов бета-гликанов в готовом препарате составляет от 1,0 до 4,0%.

В липидной фракции содержание жирных кислот составляет 74,6% от количества неполярных липидов. В таблице 2 жирные кислоты представлены только соединениями с четным числом атомов углерода, соотношение их во фракции близко к лучшим растительным маслам.

Таблица 2 Жирнокислотный состав препарата, % от суммы
Жирная кислота	Содержание, мас. % от суммы
Пальмитиновая C16:0	34,5	Всего насыщенных кислот - 38,6
Стеариновая С18:0	4,1
Пальмитолеиновая C16:1	1,3	Всего эссенциальных ненасыщенных кислот- 61,4
Олеиновая С18:1	33,4
Линолевая C18:2	25,7
Линоленовая С18:3	Около 1,0

Таблица 3 Содержание биологически активных фосфолипидов
Фосфолипид	Содержание, мас.% от суммы
Фосфотидилэтаноламин	44
Фосфотидилхолин	49
Фосфотидилсерин	7

В составе липидной фракции содержится значительное количество эргостерина (вещества с D-витаминной активностью) - 0,20-0,28 г/100 г продукта, а также 22-дигидростерин и 5-дигидростерин.

Таблица 4 Содержание витаминов группы В
Витамин	Содержание, мг/кг асв
B1 (тиамин)	3,6
В2 (рибофлавин)	35,8
В3 (пантотеновая кислота)	14,5
В6 (пиридоксин)	4,2
В12 (кобаламины)	Следы
Фолиевая кислота	8,0
РР (никотиновая кислота)	230
Биотин	1-2
Холин	3100-4200

Препарат богат кальцием, калием, фосфором, магнием, железом и другими физиологически активными макро- и микроэлементами в органически связанной форме.

Таблица 5 Содержание макро- и микроэлементов
Элемент	Содержание, мг/кг	Элемент		Содержание, мг/кг
Кальций	67000-74000	Марганец		15-19
Фосфор	6800-8000	Молибден		15-20
Калий	4000-4500	Никель		3,7-7,9
Магний	700-800	Хром		5,0-10,5
Железо	300-400	Кобальт	0,1-1,6
Медь	31-44	Фтор	2,9
Цинк	90-200

Безвредность препарата подтверждена результатами его медико-биологической проверки, выполненной Институтом питания РАМН. Показано, что препарат не вызывает аллергических реакций и не имеет противопоказаний к применению. По заключению этого института препарат получил одобрение Минздрава и Госкомсанэпиднадзора.

Лечебно-профилактические свойства предложенного препарата изучались путем определения количества онкомаркеров, присутствующих в крови онкологических больных до начала и по окончании курса приема заявляемого препарата. При этом оценивалось содержание в крови следующих онкомаркеров: раково-эмбрионального антигена (РЭА), ферритина, карбогидратного антигена (СА-125) и муциноподобного антигена (МЦА).

Определение уровней онкомаркеров в сыворотке крови проводилось радиоиммунологическим и иммуноферментным методами. Для исследования использовали тест-системы зарубежных и отечественных фирм. Радиометрия сыворотки крови проводилась гамма счетчиком 1175 фирмы «Серл». Полученные данные обработаны статистически по методу Манцевичуте-Эрингене Е.Н.

Анализы, проведенные по окончании курса приема нового предложенного препарата, показали достоверное снижение уровней всех определяемых опухолево-ассоциативных антигенов (таблица 6).

Таблица 6 Изменение уровня онкомаркеров в сыворотке крови после курса приема нового предложенного препарата
	Основная	Контрольная	Здоровые
Показатели	группа больных	группа больных	лица
	х)	хх)
Число
обследованных, чел.	41	38	10
Ферритин, мкг/л:
до лечения	152,6±19,0	142,4±11,9	61,4±5,6
после лечения	91,7±22,6	126,1±8,6
РЭА, мкг/л:
до лечения	14,1±2,4	11,8±2,4	4,1±0,3
после лечения	7,6±1,2	9,4±2,1
Са-125, ед/л:
до лечения	11,4±2,3	12,1±2,6	5,9±0,1
после лечения	5,2±0,4	11,3±2,1
МЦА, ед/л:
до лечения	9,3±1,6	9,1±1,8	6,8±0,8
после лечения	6,1±1,9	8,4±1,6
х) больные, проходившие курс лечения с применением нового препарата
хх) больные, проходившие курс лечения традиционными методами.

Возможность получения препарата указанного ранее состава промышленным способом и возможность использования для его получения культуры гриба Trametes pubescens штамм С-23 (ВКПМ F-839) в качестве продуцента иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культуру штамма хранили в пробирках на скошенном агаризованном пивном сусле при температуре +(4-6)°С.

Засев жидкой питательной среды первоначально проводили путем переноса в нее культуры вместе с кусочком агаризованной среды (первый пассаж), а затем с жидкой среды переносили на жидкую из расчета 10-20 об.% посевного материала (второй, третий и последующие пассажи).

Выращивание посевного материала проводили в термостатированной комнате при температуре 28°С и частоте вращения качалки 180 об/мин на среде следующего состава, мас.%: меласса свекловичная - 3,0; аммоний азотнокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; мочевина - 0,07; пеногаситель пропинол - 0,05; вода водопроводная - остальное; рН 5,5. Питательную среду стерилизовали при температуре 138°С, время выдержки - 5 мин.

Длительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 144 час, второй пассаж - 96 час, третий и последующие - 48 час.

Глубинную культуру использовали для засева инокулятора емкостью 250 л со 150 л стерильной питательной среды вышеуказанного состава. Количество вносимого посевного материала составляло 5 л. Культивирование проводили в течение 48 часов при температуре 28°С с механическим перемешиванием интенсивностью 180 об/мин и аэрацией 150 л/мин.

Выросший посевной материал передавали для засева основного производственного ферментера емкостью 10 м³ с 7 м³ стерильной питательной среды. Процесс выращивания культуры в ферментере осуществляли при 28°С без механического перемешивания при аэрации 7 м³/мин в течение 40 часов. По окончании ферментации культуральную жидкость подавали на фильтр-пресс для отделения биомассы, промывки ее водой и тщательной продувки сжатым воздухом до получения плотных пластов биомассы. Биомассу подвергали сушке в сушилке кипящего слоя при температуре 70°С. Полученную сухую биомассу измельчали и стандартизовали. Количество полученного готового продукта - 49 кг.

Полученный препарат имел следующий состав, мас. %: общий белок - 49,4, нуклеиновые кислоты - 4,5, липиды - 5,0, минеральные вещества - 6,5, в т.ч., мг/кг: цинк - 197,9; марганец - 15,5; медь - 42,4; кобальт - 0,55. Содержание бета-гликанов в препарате 1,55%. Содержание эргостерина - 0,20 г/100 г препарата. Аминокислотный состав препарата приведен в таблице 7.

Таблица 7 Аминокислотный состав препарата в примере 1
Аминокислота	Содержание, % асв
Изолейцин	2,9
Лейцин	2,8
Лизин	3,2
Метионин+цистин	0,5+0,9
Фенилаланин+тирозин	1,6+1,2
Триптофан	0,84
Треонин	2,3
Валин	2,1
Гистидин	1,7
Аргинин	2,2
Аспарагиновая кислота	3,9
Серии	2,6
Глутаминовая кислота	6,6
Пролин	1,3
Глицин	2,2
Аланин	2,8

После анализа качества препарат подвергали фасовке и упаковке.

Пример 2

Выращивание посевного материала в колбах и посевных аппаратах осуществляли аналогично изложенному в примере 1.

Выросший посевной материал передавали для засева основного производственного ферментера емкостью 10 м³ с 7м³ стерильной питательной среды следующего состава, мас.%: меласса свекловичная - 4,0; аммоний азотнокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0.12; мочевина - 0,07; вода водопроводная - остальное. Процесс ферментации осуществляли при 28°С без механического перемешивания при аэрации 7 м³/мин в течение 48 час. Стерильную мелассу подавали в аппарат дробно путем подпиток.

Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляли аналогично изложенному в примере 1. Количество полученного готового продукта - 91 кг.

Содержание общего белка в полученном продукте составляет 50%, липидов 3,5%, нуклеиновых кислот - 4,5%, углеводов 30%, в т.ч. бета-гликанов - 2,6%. Содержание эргостерина - 0,25 мг/100 г препарата.

Пример 3

Выращивание посевного материала в колбах и посевных аппаратах осуществляли аналогично изложенному в примере 1.

Выросший посевной материал передавали для засева основного производственного ферментера емкостью 10 м³ с 7 м³ стерильной питательной среды. Процесс ферментации осуществляли при 28°С с перемешиванием при аэрации 7 м³/мин в течение 40 час. Затем 6,3 м³ культуральной жидкости передавали на фильтрацию и доливали в аппарат такой же объем свежей стерильной питательной среды. Процесс ферментации продолжали в вышеуказанном режиме в течение 20 часов. По окончании второго и последующих циклов ферментации культуральную жидкость обрабатывали так же, как указано в примере 1. Количество полученного готового продукта - 44 кг в первом цикле и по 50 кг во втором и последующих циклах.

Полученный продукт имеет следующий состав, мас.%: общий белок - 45,0; нуклеиновые кислоты - 3,5; липиды - 3,8; бета-гликаны - 4,0; минеральные вещества - 8,0, в том числе, мг/кг: цинк - 200,0; марганец - 16,4; медь - 40,3; кобальт - 0,62. Аминокислотный состав продукта приведен в таблице 8.

Таблица 8 Аминокислотный состав препарата в примере 3
Аминокислота	Содержание, % асв
Изолейцин	2,9
Лейцин	2,9
Лизин	2,9
Метионин+цистин	0,3+0,9
Фенилаланин+тирозин	1,3+1,4
Триптофан	0,84
Треонин	2,2
Валин	1,9
Гистидин	1,8
Аргинин	2,1
Аспарагиновая кислота	3,8
Серии	2,4
Глутаминовая кислота	6,5
Пролин	1,3
Глицин	2,2
Аланин	2,4

Пример 4

Выращивание посевного материала в колбах и посевных аппаратах осуществляли аналогично изложенному в примере 1.

Выросший посевной материал передавали для засева основного производственного ферментера емкостью 10 м³ с 7 м³ стерильной питательной среды следующего состава, мас. %: сахар-сырец - 2,0 (по редуцирующим веществам); аммоний азотнокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; мочевина - 0,07; кукурузный экстракт сгущенный - 0,5; вода водопроводная - остальное. Процесс ферментации осуществляли при 28°С без механического перемешивания, при аэрации 7 м³/мин в течение 48 часов.

Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляли аналогично изложенному в примере 1. Количество полученного готового продукта - 62 кг.

Полученный продукт имеет следующий состав, мас. %: общий белок - 40,0; нуклеиновые кислоты - 3,0; углеводы - 25, в т.ч. бета-гликаны - 1,0%; липиды - 4,4; минеральные вещества - 8,5. Содержание эргостерина - 0,28 мг/100 г препарата.

Аминокислотный и минеральный состав препарата приведены в таблицах 9 и 10.

Таблица 9 Аминокислотный состав препарата в примере 4
Аминокислота	Содержание, % асв
Изолейцин	2,9
Лейцин	2,7
Лизин	3,9
Метионин+цистин	0,3+1,2
Фенилаланин+тирозин	1,3+1,4
Триптофан	0,9
Треонин	2,3
Валин	2,0
Гистидин	1,8
Аргинин	2,2
Аспарагиновая кислота	4,2
Серии	2,6
Глутаминовая кислота	7,2
Пролин	1,3
Глицин	2,5
Аланин	2,9

Таблица 10 Содержание макро- и микроэлементов в препарате по примеру 4
Элемент	Содержание, мг/кг	Элемент	Содержание, мг/кг
Кальций	70500	Марганец	18
Фосфор	8000	Молибден	20
Калий	4500	Никель	7,9
Магний	750	Хром	10,0
Железо	360	Кобальт	1,42
Медь	42	Фтор	2,9
Цинк	105

Преимущество заявляемого препарата перед препаратом-прототипом, а именно его более широкая биологическая активность и безвредность, приводится в разделе «Промышленная полезность».

Промышленная полезность

Как уже указывалось, одной из главных особенностей препарата является его положительное влияние на иммунитет.

В свете современных представлений иммунологическая реактивность рассматривается как универсальная защитная реакция, служащая показателем общей сопротивляемости и резистентности организма.

Иммунологический гомеостаз осуществляется морфофункциональным субстратом, которым являются лимфоциты: тимусзависимые (Т-лимфоциты), тимуснезависимые (В-лимфоциты) и макрофаги (А-клетки). Т-система иммунитета реализует иммунный ответ клеточного типа, В-система реализует гуморальный ответ, при этом Т-система контролирует работу В-системы.

Снижение защитной активности организма способствует возникновению различных заболеваний, в том числе и инфекционных, а гипернарушения иммунитета обусловлены сенсибилизацией организма, ведущей к развитию аллергических и аутоиммунных заболеваний. В связи с этим актуально изыскание продуктов и препаратов из растительного сырья, обладающих иммуномодулирующими свойствами.

Из литературных источников и по результатам собственных исследований известно, что полисахариды грибного происхождения обладают стимулирующим действием на иммуногенез. Препараты, изготовленные на основе полисахаридов базидиальных грибов, за рубежом широко используются для иммунотерапии иммунодепрессивных состояний, а также для профилактики иммунодефицитов.

Изучение влияния препарата на клеточный иммунитет проведено на 32 пациентах в возрасте 38-55 лет, проживающих в зоне повышенного радиационного контроля в Киевской области. У всех пациентов при первоначальном обследовании наблюдалось снижение абсолютного числа лимфоцитов. Контрольные данные получены по результатам обследования 10 практически здоровых лиц такого же возраста.

Все обследованные больные получали ежедневно в течение 30 дней по 2 г заявляемого препарата. Результаты изменения показателей клеточного иммунитета у наблюдавшихся пациентов приведены в таблице 11.

Таблица 11 Изменение показателей, отражающих состояние клеточного иммунитета при приеме препарата
Показатели	Больные до лечения	Больные после лечения	Здоровые лица
Эозинофилы:
%	2,6±0,8	1,9±0,5	1,5±0,2
Абс.кол. в 1 мкл	104±44,7	61,3±30,5	46,2±12,1
Лимфоциты:
%	34±4,3	40±4,7	37±2
Абс.кол. в 1 мкл	1744±316	2763±247	3199,6±192
Т-лимфоциты:
%	29,4±7,7	42±9,7	53±3
Абс.кол. в 1 мкл	468,9±118,5	1259,3±342	1137±95,1
В-лимфоциты:
%	13,2±1,7	16,9±2,9	20,5±1,8
Абс.кол. в 1 мкл	234,1±62	369±72	449±60,9
О-лимфоциты:
%	26,5±4,4	44,5±9,7	57,6±8,8
Абс.кол. в 1 мкл	608±108	1037±264	1208,3±197

Из данных таблицы видно, что ежедневный прием нового препарата способствовал увеличению абсолютного и относительного числа лимфоцитов, Т-лимфоцитов и О-лимфоцитов. Наряду с этим выявлена тенденция к снижению числа эозинофилов и увеличению абсолютного числа В-лимфоцитов. Анализ каждого конкретного случая применения препарата показал, что эффект его действия зависел от исходного состояния организма. При пониженных показателях наличия в крови иммунокомпетентных клеток препарат способствовал их повышению, при повышенных - снижению, в чем проявилось нормализующее действие этого препарата на количество и соотношение Т- и В-лимфоцитов.

Вторым свойством препарата является его положительное влияние на ферментативные системы печени. Состояние дезинтоксикационной функции печени предопределяет течение многих заболеваний. Метаболические превращения токсических продуктов в печени осуществляются с участием ферментной системы эндоплазматического ретикулума печени. Выявление нарушений функционального состояния оксидаз-смешанной функции печени особенно актуально в целях как ранней диагностики возможных нарушений в организме, так и для оценки эффективности применяемой терапии.

Определение активности оксидаз-смешанной функции печени проведено по методу Попова путем использования амидопирина (АП) в качестве тест-нагрузки на организм. Выделение АП рассматривается как проявление адаптации организма к повторяющимся поступлениям токсических веществ в организм. О состоянии оксидаз-смешанной функции печени судили по содержанию в моче метаболитов АП-4-аминоантипирина (4-ААП) и продукта его биологического ацетилирования - 4-ацетил-4-аминоантипирина (4-АцААП), а также их суммы (СМ).

Нагрузка всех обследованных больных проводилась однократным приемом амидопирина (АП) per os из расчета 6 мг/кг веса тела, что соответствует средней терапевтической дозе и ниже максимальной однократной дозы. Это наряду с многолетним опытом применения АП в качестве жаропонижающего препарата было основанием считать дозу 6 мг/кг совершенно безвредной для организма человека.

Определение основных метаболитов амидопирина - 4-ААП и 4-АцААП, а также их суммы (СМ) проводилось в 3-часовой порции мочи (от 22 до 24 часов). Содержание метаболитов в моче определяли колориметрическим методом, основанным на образовании ими индофенола красного цвета в результате реакции с фенолом в щелочной среде в присутствии феррицианида калия.

Результаты определения активности действия ферментов, участвующих в процесса дезинтоксикации токсических веществ в печени, полученные до и после проведения больными курса приема препарата, приведены в таблице 12.

Таблица 12 Изменение оксидаз-смешанной функции печени под действием препарата
Группа больных (18 чел.)	Выведение метаболитов в % от выведения АП
	4-ААП	4-АцААП	CM
До лечения	0,58±0,023	2,66±0,31	3,6±0,6
После лечения	0,40±0,036	2,40±0,16	3,0±0,4
Нормальные показатели	0,42±0,08	2,38±0,58	2,8±0,67

Из представленных данных видно, что повышенное выделение метаболитов АП и их суммы отмечалось у всех больных (18 чел.) до начала приема препарата, что указывает на значительное напряжение адаптационных механизмов у обследованных нами лиц.

Данные, полученные на тех же больных по окончании курса приема препарата, свидетельствуют о том, что препарат статистически достоверно способствовал восстановлению дезинтоксикационных функций печени. Положительный лечебный эффект проявился у всех 18 больных - у них наступило полное восстановление оксидаз-смешанной функции печени.

Проведенные клинические исследования лечебно-профилактических свойств нового препарата, производимого биотехнологическим способом на основе нового штамма гриба Trametes pubescens, показали, что его нормализующее влияние на клеточный иммунитет организма человека превышает такое же влияние лучших препаратов, созданных для этих целей, а также, что препарат способствует восстановлению до физиологической нормы оксидаз-смешанной функции печени.

Claims (2)

1. Штамм гриба Trametes pubescens ВКПМ F-839 - продуцент эргостерина.

2. Препарат, положительно влияющий на тканевый обмен, стимулирующий иммуногенез, способствующий восстановлению нарушенной оксидаз-смешанной функции печени, отличающийся тем, что он представляет собой высушенную и отделенную от посторонних примесей биомассу штамма гриба Trametes pubescens ВКПМ F-839 и имеет следующий состав, мас.%:

общий белок 40-50 углеводы 25-30 в том числе полисахариды бета-гликаны 1-4 липиды 3,5-5,0 в том числе ненасыщенные жирные кислоты,   фосфолипиды, эргостерин   нуклеиновые кислоты 3,0-4,5 минеральные вещества 6,5-8,5 в том числе кальций, калий, фосфор, магний,   железо, медь, цинк, хром, кобальт, марганец, молибден   витамины 0,35-0,45 вода остальное