KR101147493B1 - 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus)CS0218 (KFCC 11494P), 이를 이용한 다당류의 생산방법 및, 생산된 다당류의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P) 및 이를 발효균주로 사용하여 다량의 다당류를 생산하는 방법을 개시한다.
Description
본 발명은 신규한 담자균류의 구멍장이버섯과 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P) 균주, 이를 발효균주로 사용하여 다량의 다당류를 생산하는 방법 및 이 다당류의 용도에 관한 것이다.
미생물이 세포벽 밖에 침적시키는 세포외 다당류는 미생물의 종류, 생리적 상태에 따라 다양하며, 산업적으로 중요한 세포외 다당류 중에는 잔탄 (xanthan), 젤란(gellan) 및 풀루란 (pullulan)등이 있다. 이들은 화학적으로 합성한 고분자에 비하여 자연 친화적이며, 구조적인 특징에서 비롯되는 고유한 기능을 갖고 있다. 또한, 점성물질의 형태로 배지 속에 분비되거나 또는 세포벽이나 막과 연결된 캡슐의 형태로 생산된다.
다당류는 생분해성이 우수하고 인체에 대한 독성이 없으며, 산업이 급속하게 발전함에 따라 다당류의 용도 또한 광범위해져 조건에 따라 겔 형성능, 표면장력 조절능, 물 흡수능, 결착능, 점착능, 윤활능 및 필름형성능 등의 기능을 가지므로 화장품, 식품, 석유 및 의약산업 등에 광범위하게 사용되고 있다.
대부분의 다당류와 같은 생물고분자는 생합성 경로가 복잡하여 화학적으로 합성이 불가능하며 화학합성이 가능하여도 높은 생산비용 등의 경제적인 이유와 필요한 만큼 충분한 양을 대량으로 합성을 할 수 없기 때문에 생물체에서 추출하거나 미생물을 배양하여 생산하고 있다.
이러한 연구의 일환으로, 고등균류인 버섯이 생산하는 다당류를 보습 및 피부개선을 위한 기능성 첨가물로서 다양한 산업적 응용이 이루어지고 있다(Critical Rev in Immun 19, 65-96). 최근 식품 및 화장품 산업에서 기능성 원료의 고부가가치의 소재개발 일환으로써, 화학합성 및 천연물 소재의 한계성과 제한적 생산량을 극복하기 위해 미생물을 이용한 기능성 소재를 개발하고 있다. 그 중 고등균류인 버섯은 그 효능이 식품 및 의약적으로 어느 정도 입증되었으며, 버섯 자실체 및 균사체를 이용한 소재개발이 활발히 진행되고 있다.
질병의 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물 중 가장 주목받고 있는 버섯은 대부분 담자균류(Basidiomycetes)의 일종으로, 일반적으로 각종 영양원이 함유된 유기물에서 물질을 흡수, 이용하여 단백질, 아미노산, 효소, 비타민, 무기염류, 지방질 및 당 등과 같이 인체에 중요한 각종 영양성분을 함유하고 있고 광범위한 약리작용을 가지고 있어 전통적으로 민간의약 원료로 널리 활용되어 왔다. 최근에는 여러 종류의 버섯들이 항암효과가 있음이 과학적으로 검증되었는데 항암효능을 나타내는 주요 성분은 버섯 속에 함유되어 있는 다당류라고 밝혀져 있다.
이들은 기존의 합성 항암제와는 달리 직접 암세포에 작용하기보다는 숙주 매개성 면역활성화(host mediate immunity) 기능을 보유하고 있어, 면역계와 관계있는 보체(complement) 및 매크로파지(macrophage)를 활성화하여 암세포의 생물학적 반응을 변화시켜서 치료효과를 나타내므로 독성 및 부작용이 거의 없는 장점을 갖고 있다.
이러한 다당류는 항원, 독성물질 그리고 중금속 등으로부터 보호막의 역할을 하며, 건조지역에서 수분을 유지시키는 역할도 한다. 약용버섯으로서 그 기능이 알려진 동충하초, 영지버섯, 표고, 구름버섯, 상황버섯 등의 생리 활성물질들은 식품산업의 건강보조식품 첨가제 및 안정제로 사용될 수 있고, 피부의 고유기능을 유지하고 피부세포를 활성화시켜 피부노화 억제뿐만 아니라 보습기능, 멜라닌 생성억제 및 자외선 차단 기능에 의한 미백 또는 항산화 기능이 우수한 것으로 알려져 있다.
한편, 기존의 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) 균주의 균사체 배양액 유래의 항당뇨 활성을 갖는 세포외 다당체 및 그 제조방법에 관한 것으로 한국특허출원 제2008-0019204호가 알려져 있으며, 버섯의 추출물을 이용한 화장료 조성물로는 눈꽃동충하초(한국 공개특허 제2000-0018909호), 상황버섯, 치마버섯(한국 공개특허 제2000-0055724호, 제1999-0076537호) 등이 있다. 그러나, 이들은 균사체의 활력 및 다당류의 생산 수율이 좋지 않으며, 생산된 다당류의 피부보습효과 및 피부노화방지효과가 미약하다는 문제가 있었다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 피부에 자극이 적고 피부세포 활성과 콜라겐 합성 증식 작용이 우수한 천연물질에 관해 연구하던 중, 담자균류의 버섯균주부터 다량의 다당류를 생산하는 새로운 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus)를 분리동정하는데 성공하여 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
본 발명은 균사체의 활력 및 세포외 다당류의 생산량이 탁월하게 우수한 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 발효균주로 이용하여 다당류를 매우 수율 좋게 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 발효균주로 이용하여 우수한 보습효과 및 노화방지효과를 갖는 다당류를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류를 함유하는 건강보조식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류 이용하여 인체에 무해하여 안전성이 우수한 식품첨가제 및 안정제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류를 함유하는 우수한 피부보습효과 및 노화방지효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류 이용하여 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 담자균류를 발효시켜 담자균류로부터 다당류를 생산하는 방법에 있어서, 발효 균주로 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체를 배양하는 단계; 상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체를 배양액에서 제거하는 단계; 및 상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체가 제거된 배양액을 열수추출 또는 알콜추출한 후, 침전물을 원심분리하여 얻은 상등액을 여과시켜 저분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는 다당류의 생산방법을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 다당류를 함유하는 건강보조식품을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다당류를 조성물 총중량에 대하며 0.01 ~ 30중량% 함유하는 건강보조식품을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 다당류를 함유하는 화장료 조성물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다당류를 조성물 총중량에 대하며 0.01 ~ 30중량% 함유하는 화장료 조성물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 피부보습용 화장료 조성물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 피부노화방지용 화장료 조성물을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 과제의 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)는 신규한 담자균류로 다당류를 생산하는 것을 특징으로 한다. 이러한, 본 발명에 따른 신규한 담자균류의 구멍장이버섯과 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 분리 및 동정 과정은 다음과 같다.
1. 신규 미생물의 분리
본 발명에서는 전라도 지리산 야산의 침엽수에서 자실체를 채취하여 자실체에 이물질(異物質)을 제거하고 건조되기 전에 자실체를 소독한 후, 자실체 조각을 떼어내어 한천 배지에 이식한다. 그 다음, 약 25℃ 전후에서 7일 동안 배양하여 균사를 얻고, 이 균사를 증식시켜 이를 균주로 한다. 이 균주를 폐목과 톱밥을 혼합한 배지에 넣어 증식시켜서 자실체 발생을 위한 종균을 얻는다.
2. 신규 미생물의 동정
1) 형태 및 배양학적 특성
상기에서 분리된 신균주 CS0218은 전형적인 담자균류의 특성을 보이는 균주로서 배양학적 특성은 다음과 같다.
포테이토 덱스트로스 아가 배지에서 배양시 균총의 색깔은 전체적으로 하얀색을 띄며, 7일간 배양 후 원형의 균총의 지름은 약 6 cm 정도 된다. 7일 이상 배양시 균사가 자란 배지 부분은 딱딱하게 되며, 중앙의 오래된 균총에는 하얀색의 기균사가 형성된다.
현미경 관찰 결과, 균사는 실 모양으로 길게 뻗어 서로 얽혀 있으며, 2핵 균사가 형성된 다음 꺾쇠연결에 의해서 2핵이 동시에 분열하면서 정확하게 2핵상을 유지하고 있어 담자균류의 일반적인 특성을 가진다. 이들 수십 가닥의 균사가 각종 크기의 다발을 형성하고, 이들 중 큰 다발들은 서로 그물망 모양으로 연결된다.
2) 생리학적 특성
CS0218 균주의 균사체 성장은 액체 배지에서 배양 6일째에 최고치에 도달하며, 다당류의 생산은 7일 배양시 생산량이 가장 높다. 생산을 위한 최적 배양온도는 27℃이며, 약산성 pH 5.5에서 배양이 시작되어 7일 후 pH 5.0 정도로 배양 종료시에도 유사하다. 다당류 생산조건으로 통기 1.5vvm, 교반속도 150rpm, 온도 27℃의 배양조건이 필요하다.
3) 신균주 미생물 CS0218의 동정 및 명명
신균주 미생물 CS0218의 형태적, 배양학적 및 생리적 특성 등의 균학적 성상을 분석한 결과, 본 발명에서 분리된 균주는 담자균류의 라티포러스속(sp.)에 속하는 미생물임을 "The Fifth Kingdom(2001, 3rd, Mycologue Publication, Sidney)"와 "Medical Important Fungi(1995, ASM press, Washington D.C.)"에서 확인할 수 있다.
이에, 본 발명에서 분리한 신균주를 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218로 명명하고, 2010년 8월 24일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KFCC 11494P를 부여받았다.
한편, 본 발명의 신규의 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 액체 배지 배양방법 및 이를 이용한 다당류 생산방법을 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 포자를 멸균된 증류수로 수회 세척한 후, 효모-맥아즙 한천배지(효모엑기스 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 L)에 도말하여 27℃에서 5일간 배양하여 균사체를 얻는다.
상기 균사체는 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용한다.
상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 액체 배지에 3~10%(v/v) 접종한다.
상기 사면배지에서 자란 균사체를 배양하는 액체 배지로는 포도당 2%, 효모액기스 0.6%, 폴리펩톤 0.2%, 황산마그네슘(MgSO4?7H2O) 0.05%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.05%, 이인산칼륨(K2HPO4) 0.05%, 황산망간(MgSO4 ?5H2O) 0.02%를 함유한 배지를 사용하며, 이와 같이 최적화된 영양 배지는 균사체 성장과 다당체 생산 측면에서 높은 수율을 가진다.
상기 균사체의 액체 배양은 발효조 조건하에서 온도 27℃, pH 5.5, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 4~6일간 배양한다.
배양 완료 후, 균사체를 제거한 배양액을 3~7배량의 알코올, 바람직하게는 에틸알코올을 가하여 4℃에서 하룻밤 방치한다. 생성된 침전물은 7000~20,000rpm에서 50~60분간 원심분리하여 수거한다. 수거된 침전물을 증류수에 녹여 고분자량의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 저분자 물질을 제거한 후, 동결건조하여 다당류를 얻는다.
본 발명은 이와 같이 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 발효 균주로 사용하여 다당류를 생산할 수 있다.
한편, 본 발명의 다당류 생산방법은 상기 방법에 한정되는 것은 아니고, 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 자실체 및 균사체 추출물로부터 다당류를 생산할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 건강보조식품, 식품의 첨가제 또는 안정제, 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 건강보조식품 또는 화장료 조성물은 상기 다당류를 조성물 총중량에 대하며 0.01 ~ 30중량% 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다당류를 0.01중량%보다 적게 함유하는 경우 그 효과가 미비하게 되고, 30중량%보다 많이 함유하게 되면 함유량의 증가분에 비해 효과의 상승폭이 적어 경제적이지 못하다.
한편, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 우수한 보습효과와 노화방지 효과를 가지므로, 화장료 조성물에 이용할 경우 우수한 피부개선효과를 가질 수 있다.
본 발명은 균사체의 활력 및 세포외 다당류의 생산량이 탁월하게 우수한 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 발효균주로 이용하여 다당류를 매우 수율 좋게 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 발효균주로 이용하여 우수한 보습효과 및 노화방지효과를 갖는 다당류를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류를 함유하는 건강보조식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류 이용하여 인체에 무해하여 안전성이 우수한 식품첨가제 및 안정제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류를 함유하는 우수한 피부보습효과 및 노화방지효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 균주인 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류 이용하여 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지 모두 포함한다.
실시예
:
신규한
라티포러스 설퍼레우스(
Laetiporus sulphureus
) CS0218 (KFCC 11494P) 유래의 다당류 제조
본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 효모-맥아즙 한천 배지(효모엑기스 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 L)가 든 시험관에 사면 배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대 배양하여 사용하였다.
상기 사면 배지에서 계대 배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여, 이를 포도당 2%, 효모액기스 0.6%, 폴리펩톤 0.2%, 황산마그네슘(MgSO4?7H2O) 0.05%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.05%, 이인산칼륨(K2HPO4) 0.05%, 황산망간(MgSO4?5H2O) 0.02%를 함유한 최적화된 합성 배지로 pH 5.5로 조정된 액체 배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 7일간 배양하였다.
배양완료 후, 균사체를 제거한 배양액에 4배의 에틸알코올을 가하여 4℃에서 하룻밤 방치하였고, 생성된 침전물은 1,000rpm에서 30분간 원심분리하여 수거하였다. 수거된 침전물을 증류수에 녹여 분자량 12,000의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 분자량 12,000 이하의 저분자 물질을 제거한 후, 동결건조하여 다당류를 얻었다.
비교예
1 :
라티포러스
설퍼레우스
(
Laetiporus
sulphureus
) (
KCTC
6358) 유래의 다당류 제조
담자균류로 한국생물자원센터(KCTC)에 기탁된 원균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 6358)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 배양하여 다당류를 생산하였다.
비교예
2 :
라티포러스
설퍼레우스
(
Laetiporus
sulphureus
) (
KCTC
26229) 유래의 다당류 제조
담자균류로 한국생물자원센터(KCTC)에 기탁된 원균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 26229)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 배양하여 다당류를 생산하였다.
비교예
3 :
라티포러스
설퍼레우스
(
Laetiporus
sulphureus
) (
KCCM
60117) 유래의 다당류 제조
담자균류로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 원균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCCM 60117)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 배양하여 다당류를 생산하였다.
시험예
1:
세포외
다당류 생산 비교
본 시험예에서는 상기 실시예와 비교예 1 내지 3에서 생산된 세포외 다당류의 생산량 및 균사체량을 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.
구분 | 균사체(g/L) | 세포외 다당체(g/L) |
실시예 | 8.46 | 2.14 |
비교예 1 | 3.75 | 1.02 |
비교예 2 | 3.98 | 1.20 |
비교예 3 | 2.31 | 0.98 |
상기 표 1에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 균사체 및 다당류의 함량은 각각 8.46 g/l와 2.14 g/l로서, 기존의 원 균주보다 균사체는 약 2.2배, 세포외 다당류 생산량은 약 2.0배 이상 생산하여 매우 우수한 수율을 가짐을 알 수 있었다.
시험예
2 : 보습효과 측정
본 시험예에서는 코르네오메타(Corneometer) CM825를 이용한 커패시턴스 측정법을 사용하였고, 시료는 상기 실시예와 비교예 1, 2에서 생산된 다당류를 0.5%의 양으로 녹인 것과, 양성 대조구로서 보습효과가 있는 물질로 공지된 0.5%의 히아론산을 녹인 것을 사용하여 보습효과를 측정하였다.
즉, 20~30대 여성 20명을 대상으로 하여, 시험 시작 직전에 전박 굴측면을 항온항습실(22℃, 상대습도 40~60%)에서 20분 동안 적응하게 하여 피부의 수분 자체를 일정하게 유지시켰다. 그 다음, 코르네오메타 CM825을 사용하여 각 시료 도포부위의 초기 수분 보유량을 측정한 후, 시료를 도포하였다. 시료의 도포는, 2.0 mg/cm2를 전박 굴측면에 따른 오차를 최소화하기 위하여 피검자마다 도포하는 시료의 위치를 달리하면서 도포하였다. 도포 10분, 30분, 50분, 90분, 120분에서 시간별로 피부 수분량을 1차 측정하고, 2시간 후에 다시 피부 수분량을 측정하였다. 각 측정부위를 3번 반복 측정하고 그 평균값으로 하기 수학식 1에 따라 피부 수분량을 계산한 다음, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Tdi : 시료도포부위의 n번째 측정값
Tdo :시료도포부위의 도포 전 측정값
NTdi :시료를 도포하지 않은 부위의 n번째 측정값
NTdo : 시료를 도포하진 않은 부위의 도포 전 측정값
성분 | 10분 | 30분 | 50분 | 90분 | 120분 |
정제수 | 70.21 | 54.23 | 43.12 | 37.66 | 35.02 |
0.5% 하이루론산 | 82.64 | 75.87 | 67.20 | 57.61 | 54.79 |
실시예 | 88.21 | 82.45 | 75.62 | 69.55 | 58.35 |
비교예 1 | 73.58 | 69.55 | 58.21 | 49.97 | 46.22 |
비교예 2 | 70.25 | 62.55 | 52.64 | 43.75 | 40.58 |
상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 기존의 원 균주 및 공지의 보습물질보다 보습 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있었다.
시험예
3: 항산화 효과 측정
본 시험예에서는 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성하는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소제거효과를 평가하였다.
크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소는 생성되는데, 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitroblue tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소량을 측정하였다.
사용한 시약은 다음과 같다.
1) 0.05M(50mM) Na2CO3완충액(MW=105.99) : 탄산나트륨 5.25g(50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO3(MW=84.01) 용액을 혼합하여 pH 10.2로 하였다.
2) 3mM 크산틴(xanthine)용액 : 크산틴(MW=152.11)) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 하였다.
3) 3mM EDTA용액 : 에틸렌디아민4초산나트륨(MW=60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 하였다.
4) 0.15% BSA용액 : BSA(Fraction V, powder, Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 하였다.
5) 0.75mM NBT용액 : 니트로블루 테트라졸리움(MW=817.65) 61.32mg을 증류수에 용해하여 100ml로 하였다.
6) 크산틴옥시다제(xanthine oxidase)용액 : 크산틴 옥시다제(Boehringer)를 증류수로 약 100배로 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2~0.23의 범위에 들도록 하였다. 즉, 흡광도의 변화가 A560=0.3/20분이 되게 정제수로 희석하였다.
7) 6mM CuCl2 용액 :염화구리(CuCl2-2H2O, MW=134.45)를 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 하였다.
측정방법은 다음과 같다.
가. 0.05M Na2CO3 -------------- 2.4ml
나. 3mM 크산틴(xanthine)용액 ------ 0.1ml
다. 3mM EDTA용액 ------ 0.1ml
라. BSA용액 ------------- 0.1ml
마. 0.72mM NBT용액 ----- 0.1ml
바. 크산틴옥시다아제용액 --- 0.1ml
사. 6mM CuCl2 용액 --------- 0.1ml
① 바이엘병에 상기 가., 나., 다., 라., 마.를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25~ 10분간 방치하였다.
② 바.를 가하여 빨리 교반하고 25~20분간의 배양을 개시하였다.
③ 그 후에 사.을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정하였다.
④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하였다.
⑤ 역시, 시료용액의 Blank는 바.대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다.
효과의 결과산출은 하기의 수학식 2에 의하여 구하였다.
St : 시료용액의 효소반응 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 효소반응후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도
시험에 사용한 시료는 상기 본 발명의 실시예와 비교예 1, 2에서 생산된 다당류 각각의 0.5% 수용액이며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.
구분 | 항산화효과(%) |
실시예 | 94 |
비교예 1 | 88 |
비교예 2 | 84 |
상기 표 3에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 기존의 원 균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 6358), 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 26229)로부터 생산된 다당류에 비하여 항산화 효과가 탁월하게 우수함을 알 수 있었다.
시험예
4: 세포 활성 효과 측정 (
MTT
assay
)
본 시험예에서는 MTT assay를 이용하여 세포 활성 효과를 측정하였다.
세포주는 마우스 유래 섬유아세포인 Hs-68 사용하였으며 12웰 플레이트에 웰 당 2 x 105 세포 수로 세포를 분주하고 24시간 배양하였다. 각 원료를 세포독성을 일으키지 않는 농도로 처리하고 시료를 처리한 후 24시간이 지나면 배지를 제거하고 각 웰당 500ul 새 배지와 60ul MTT용액을 넣은 후 2시간 동안 37℃에서 CO2 배양기에서 배양하였다. 세포를 용해시키고 각각을 100ul씩 96 웰플레이트에 옮겼다. ELISA 판독기로 565nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군은 시료를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기에서와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 실시예와 비교예 1, 2에서 생산된 다당류를 함유한 실험군과 대조군의 흡광도를 비교하여, 비교%를 표 4에 나타내었다.
구분 | 세포증식율(%) |
실시예 | 128 |
비교예 1 | 114 |
비교예 2 | 111 |
대조군 | 100 |
상기 표 4에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 원 균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 6358), 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 26229)로부터 생산된 다당류에 비하여 세포증식율이 탁월하게 우수함을 알 수 있었다.
시험예
5 : 콜라겐 생성 촉진 효과 측정
본 시험예에서는 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF)를 세포주로 사용하였으며, 시료를 첨가 후 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 주요성분인 콜라겐의 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.
시료가 첨가된 배지(serum free)로 교환하고 12시간 배양한 다음 PBS-T(0.02% tween-20 in PBS)로 HDF를 3회 세척하였다. 3% 포름알데히드로 세포를 20분간 고정화한 다음 5% 스킴밀크(skim milk)를 1시간 처리하여 블로킹하였다. 1차 항체(Primary antibody)인 단일클론 항-콜라겐 타입 I(monoclonal anti-collagen type I)를 37℃, 5% CO2에서 40분간 반응시켰다. PBS-T로 3회 세척 후, 2차 항체(secondary antibody)인 항-마우스(anti-mouse) IgG를 PBS-T 에 1/1,000로 희석하여 다시 40분 정도 반응시킨 후, PBS-T로 5회 세척하여 주었다. 기질인 다이에탄올아민 완충용액에 용해시킨 알칼린 포스파타아제 기질 용액(alkaline phosphatase substrate solution; 1mg/ml -nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군은 시료를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기에서와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 실시예와 비교예 1, 2에서 생산된 다당류를 함유한 실험군과 대조군의 흡광도를 비교하여, 비교%를 표 5에 나타내었다.
구분 | 콜라겐합성율(%) |
실시예 | 156 |
비교예 1 | 128 |
비교예 2 | 125 |
대조군 | 100 |
상기 표 5에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류는 기존의 원 균주 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 6358), 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) (KCTC 26229)로부터 생산된 다당류에 비하여 콜라겐 합성율이 탁월하게 우수함을 알 수 있었다.
이하에서는 본 발명의 신규한 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)로부터 생산된 다당류를 함유하는 건강보조식품 및 화장료 조성물의 몇 가지 제형 예를 들어 구성을 보다 구체적으로 설명하겠다.
제조예
1 : 건강보조식품의 제조
스피루리나 55 중량%, 구아검효소 분해물 10 중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량% 및 옥수수전분 1.85 중량%와 본 실시예에서 제조된 다당류 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.
제조예
2 :
화장료
조성물의 제조
제조예 2-1 : 에몰리언트 크림
표 6의 조성에 따라 정제수에 본 실시예에서 생산된 다당류가 포함된 나)항의 원료들을 가하고, 70℃로 가열하여 수상을 만들었다. 가)항의 원료들을 모두 혼합한 후 70℃로 가열하고 용해시켜서 유상을 만들었다. 수상에 유상을 서서히 가하여 예비 유화를 한 후 다시 호모믹서로 균일하게 유화하였다. 이후 열 교환기를 사용하여 30℃로 냉각하여 크림을 제조하였다.
원료명 | 중량 % | |
가 |
비스왁스 | 6.0 |
세로스테아릴알코올 | 5.0 | |
스테아린산 콜레스테롤 | 8.0 | |
유동파라핀 | 14.0 | |
사이클로디메치콘 | 0.5 | |
스쿠알란 | 6.0 | |
글세릴모노스테아레이트 | 1.5 | |
폴리옥시에칠렌솔비탄모노라우린산에스테르 | 2.5 | |
향료 | 적량 | |
파라옥시안식향산메칠 | 0.12 | |
파라옥시안식향산프로필 | 0.06 | |
나 |
색소 | 0.0004 |
농글리세린 | 3.0 | |
프로필렌글리콜 | 2.0 | |
디소디움히아루노네이트(5%) | 2.0 | |
본 실시예에서 생산된 다당류 | 1.0 | |
L-세린(1%) | 1.0 | |
정제수 | 적량 |
제조예 2-1 : 에몰리언트 로션
표 7의 조성에 따라 정제수에 본 실시예에서 생산된 다당류가 포함된 나)항의 원료들을 가하고, 70℃로 가열하여 수상을 만들었다. 가)항의 원료들을 모두 혼합한 후 70℃로 가열하고 용해시켜서 유상을 만들었다. 수상에 유상을 서서히 가하여 예비 유화를 한 후 다시 호모믹서로 균일하게 유화한 다음, 28℃로 냉각하여 로션을 제조하였다.
원료명 | 중량 % | |
가 |
스테아린산 | 2.5 |
세로스테아릴알코올 | 5.0 | |
유동파라핀 | 6.0 | |
멀티 왁스 | 2.0 | |
카르릴릭/카르릭트리글리세라이드 | 1.5 | |
페닐디메치콘 | 0.5 | |
모노올레인산소르비탄 | 0.8 | |
모노오레인산폴리옥시에칠렌소르비탄 | 2.2 | |
향료 | 0.06 | |
파라옥시안식향산메칠 | 0.13 | |
나 |
색소 | 0.0002 |
농글리세린 | 3.5 | |
1,3-부틸렌글리콜 | 1.0 | |
디소디움히아루노네이트(5%) | 2.0 | |
본 실시예에서 생산된 다당류 | 1.5 | |
L-시스테인 염산염(1%)위치하젤 추출물 | 1.5 | |
정제수 | 적량 |
제조예 2-3 : 화장수
표 8의 조성에 따라 정제수에 본 실시예에서 생산된 다당류가 포함된 가)항의 원료들을 가하고, 용해시켜서 수상을 만들었다. 에탄올에 나)항의 원료들을 모두 혼합하고 용해시켜서 알코올상을 만들었다. 수상에 알코올상을 서서히 가하면서 균일하게 교반하여 화장수를 제조하였다.
원료명 | 중량 % | |
가 |
농글리세린 | 2.0 |
1,3-부틸렌글리콜 | 1.0 | |
알란토인 | 0.05 | |
DL-판테놀 | 0.1 | |
폴리에칠렌글리콜 4000 | 0.2 | |
오이추출물 | 0.1 | |
녹차추출물 | 0.15 | |
L-글루타민 산(1%) | 2.0 | |
본 실시예에서 생산된 다당류 | 0.5 | |
카르복시비닐 폴리머 | 0.05 | |
나 |
에탄올(95%) | 10.0 |
파라옥시안식향산메칠 | 0.06 | |
트리에탄올아민 | 0.05 | |
폴리옥시에칠렌경화피마자유 | 0.25 | |
메칠페닐폴리실록산 | 0.1 | |
향 | 0.12 | |
색소 | 0.0005 | |
정제수 | 적량 |
제조예 2-4 : 아스트리젠
표 9의 조성에 따라 정제수에 본 실시예에서 생산된 다당류가 포함된 가)항의 원료들을 가하고, 용해시켜서 수상을 만들었다. 에탄올에 나)항의 원료들을 모두 혼합하고 용해시켜서 알코올상을 만들었다. 수상에 알코올상을 서서히 가하면서 아지믹서로 균일하게 교반하여 아스트리젠트를 제조하였다.
원료 | 중량% | |
가 |
농글리세린 | 1.0 |
1,3-부틸렌글리콜 | 0.5 | |
벤조페논-9 | 0.03 | |
DL-판테놀 | 0.15 | |
아이비추출물 | 0.1 | |
혼합식물 추출물 | 0.15 | |
유용성 감초추출물 | 0.02 | |
해조추출물 | 0.03 | |
본 실시예에서 생산된 다당류 | 1.0 | |
L-아르기닌 산(1.0%) | 2.5 | |
나 |
에탄올(95%) | 15.0 |
파라옥시안식향산메칠 | 0.1 | |
옥틸도데세스-16 | 0.2 | |
콜레스-24 | 0.1 | |
향 | 0.13 | |
색소 | 0.0003 | |
정제수 | 적량 |
제조예 2-5 : 에센스
표 10의 조성에 따라 정제수에 가)항의 원료 중 산탄검과 카르복시비닐폴리머를 가하고 충분히 분산시켜 완전히 용해시킨 후 여기에 본 실시예에서 생산된 다당류가 포함된 가)항의 나머지 원료들을 혼합하여 수상을 만들었다. 에탄올에 나)항의 원료들을 모두 혼합하고 용해시켜서 알코올상을 만들었다. 수상에 알코올상을 서서히 가하면서 아지믹서로 균일하게 교반하여 에센스를 제조하였다.
원료명 | 중량% | |
가 |
농글리세린 | 10.0 |
1,3-부틸렌글리콜 | 3.5 | |
알란토인 | 0.05 | |
DL-판테놀 | 0.15 | |
세로마틴 | 0.05 | |
벤조페논-9 | 0.05 | |
세라마이드 | 0.02 | |
해조추출물 | 0.03 | |
본 실시예에서 생산된 다당류 | 2.0 | |
아미노산복합체(1%) | 2.0 | |
흉선펩타이드 | 0.2 | |
산탄검 | 0.1 | |
카르복시비닐폴리머 | 0.17 | |
나 |
에탄올(95%) | 9.0 |
파라옥시안식향산메칠 | 0.1 | |
폴리옥시에틸렌경화피마자유 | 0.45 | |
초산토코페롤 | 0.2 | |
메칠페닐폴리실록산 | 0.2 | |
트리에탄올아민 | 0.17 | |
향 | 0.08 | |
색소 | 0.0002 | |
정제수 | 적량 |
상기의 제형 예에서 알 수 있듯이 본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 여러 피부 화장료로 제형화될 수 있다.
Claims (9)
- 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P).
- 담자균류를 발효시켜 담자균류로부터 다당류를 생산하는 방법에 있어서,
발효 균주로 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)를 사용하는 것을 특징으로 하는 다당류의 생산방법. - 제2항에 있어서,
상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체를 배양하는 단계;
상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체를 배양액에서 제거하는 단계; 및
상기 라티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494P)의 균사체가 제거된 배양액을 열수추출 또는 알콜추출한 후, 침전물을 원심분리하여 얻은 상등액을 여과시켜 저분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다당류의 생산방법. - 제2항의 방법에 의해 생산된 다당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 건강보조식품.
- 제4항에 있어서,
상기 다당류를 조성물 총중량에 대하며 0.01 ~ 30중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 건강보조식품. - 제2항의 방법에 의해 생산된 다당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 다당류를 조성물 총중량에 대하며 0.01 ~ 30중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
피부보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
피부노화방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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