CN115093985A

CN115093985A - 一种乳双歧杆菌及其发酵方法和应用

Info

Publication number: CN115093985A
Application number: CN202210456761.2A
Authority: CN
Inventors: 张烜赫; 张义淦
Original assignee: Shenzhen Duoweisheng Health Food Co ltd
Current assignee: Shenzhen Duoweisheng Health Food Co ltd
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN115093985B

Abstract

本发明提供一株新的乳双歧杆菌，其保藏号为CGMCC No.24307，保藏日期为2022年1月14日。本发明提供的乳双歧杆菌发酵产物中包含氨基酸、小肽、多糖、B族维生素等有益护肤的成分，可加强角质层代谢，去除细胞自由基，抑制脂质的过氧化，激活机体修复性能，抑制细胞酪氨酸酶活性，具有修复、美白、抗氧化的功能。产物中还富含乳酸和乳酸钠，是人体天然保湿因子中主要的水溶性酸类，吸湿性强，有效增强角质层的水合作用，防止皮肤水分流失；乳酸和乳酸钠组成缓冲溶液，对皮肤具有良好的亲和性，可调节皮肤酸碱值。

Description

一种乳双歧杆菌及其发酵方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域领域，具体涉及一种新型乳双歧杆菌。

背景技术

双歧杆菌属(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性菌，存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成，可以作为益生菌的一种，可应用于食品、医药和饲料等技术领域。

中国专利201710852338.3中公开了一种含有乳双歧杆菌发酵活性提取物的面膜，通过创造性地优化发酵工艺，并结合科学配比，获得抗敏具有突破性的超越氢化可的松的效果，此外还兼具刺激胶原蛋白再生的效果的面膜。该发明在发酵阶段加入白酒草皂苷R，结合其他优化的工艺条件(如多种碳源配合)，发现可以改变乳双歧杆菌的生理性能，产生具有极强活性的抗敏促进再生的生物活性的生物多糖等活性物质。但该发明对于乳双歧杆菌本身的优化并没有做出贡献。

中国专利201810015415.4公开一种益生菌组合物，使用该益生菌组合物制备的护肤精华液以及面膜，并公开了所述护肤精华液的制备方法。所述益生菌组合物包括植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactisV9)，植物乳杆菌C2(L.plantarum C2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)。所述益生菌组合物是通过生物发酵技术获得的含有改善面部皮肤的有益微生物和活性因子的菌剂，从而减少在皮肤上化学性药物的使用，所述护肤精华液以及面膜由所述益生菌组合物制备，富含活性益生因子，具有补水、抗氧化、美白和紧肤的作用，能够实现有效提升皮肤水润、亮丽和紧肤状态的效果。但其克服的技术问题为菌种复配，而非单一菌种的优化。

以上公开技术中均未对菌种进行优化，为了促进乳双歧杆菌大类在日化用品中的应用，有必要扩大乳双歧杆菌的种质资源库。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种乳双歧杆菌，利用该乳双歧杆菌进行发酵产物的制备，发酵产物中包括多种活性成分，能够用于制备多种日化产品。

一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌。

所述的乳双歧杆菌保藏号为CGMCC No.24307，于2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的乳双歧杆菌拉丁学名为Bifidobacterium lactis。

本发明的乳双歧杆菌的菌落形态为不透明乳白色或浅黄色，有光泽，圆形或短杆状，有时一端有分叉，边缘整齐，表面凸起且湿润，单个或成对成簇分布，革兰氏阳性。

本发明的乳双歧杆菌的16S rDNA的序列为SEQ ID NO.1。

另一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌制备物。

所述的乳双歧杆菌制备物通过前述的乳双歧杆菌制备得到。

所述的制备物为活菌、死菌、发酵液，发酵液上清、发酵液沉淀、发酵液提取物、培养物、培养物提取物、冻干粉中的一种或多种。

所述的活菌可以是乳双歧杆菌培养物中提取得到。

所述的发酵液可以由乳双歧杆菌接种于培养基发酵后得到。

所述的发酵液沉淀可以由发酵液离心分离或过滤后得到。

所述的发酵液上清可以由发酵液离心分离后得到。

所述的培养物提取物中包括本发明提供的乳双歧杆菌培养过程中产生的各种酶、氨基酸、多糖和次级代谢产物的总和，其具有独特性，非单一的某种成分。

在一些情况下，所述的次级代谢产物包括已经公开过的和未公开过的所有成分，且其全部存在于所述的培养物提取物中。

所述的发酵液提取物中包括本发明提供的乳双歧杆菌发酵液中所具有的各种酶、氨基酸、多糖和次级代谢产物的总和，其具有独特性，非单一的某种成分。

在一些情况下，所述的次级代谢产物包括已经公开过的和未公开过的所有成分，且其全部存在于所述的发酵液提取物中。

再一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌的培养方法。

所述的培养方法包括以下步骤：

S1、将权利要求1所述的乳双歧杆菌接种于培养基；

S2、条件培养。

所述的培养基可以是固体培养基、液体培养基或者半固体培养基。

所述的接种采用本领域一般接种方式。

所述的接种包括但不限于：涂布式、平板划线式、倾注法、斜面接种法。

所述的接种可以用接种环挑取菌落后接种至培养基。

所述的接种量可根据具体需求进行调节。

所述的培养基包括但不限于MRS培养基、LB培养基、LBS培养基、MC培养基中的一种或多种。

所述的条件培养的条件为：莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基，37±1℃，厌氧，培养72±3h。

在一些情况中，所述的条件培养还包括补液，即补充培养基，尤其在投产中，需要大量产物时。

所述的补液培养基可以与接种培养基相同，也可以与接种培养基不同。

所述的补液培养基的添加量可以与初始培养基的量相同，也可以多于或少于初始培养基的用量。

又一方面，本发明提供了前述的乳双歧杆菌在制备日用品中的应用。

具体地，所述的日用品中包括前述的乳双歧杆菌和/或其制备物。

可选择地，所述的日用品中还可能包括其他种类的辅料。

具体地，所述的辅料包括但不限于赋形剂、增稠剂、乳化剂、分散剂、抗氧化剂、防腐剂、保湿剂、表面活性剂、香精、色素等。

所述的日用品包括但不限于化妆品。

所述的化妆品包括但不限于面膜、面部精华或面霜。

又一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌冻干粉。

所述的冻干粉通过前述的乳双歧杆菌进行制备。

所述的冻干粉的制备方法可以是本领域通用的制备方法。

又一方面，本发明提供了一种活性菌剂。

所述的活性菌剂通过前述的乳双歧杆菌进行制备。

所述的活性菌剂中可以包括前述乳双歧杆菌的活菌、死菌、培养物、发酵液等。

本发明的有益效果：

本发明提供的乳双歧杆菌发酵产物中包含氨基酸、小肽、多糖、B族维生素等有益护肤的成分，可加强角质层代谢，去除细胞自由基，抑制脂质的过氧化，激活机体修复性能，抑制细胞酪氨酸酶活性，具有修复、美白、抗氧化的功能。

产物中富含乳酸和乳酸钠，是人体天然保湿因子(NMF)中主要的水溶性酸类，吸湿性强，有效增强角质层的水合作用，防止皮肤水分流失；乳酸和乳酸钠组成缓冲溶液，对皮肤具有良好的亲和性，可调节皮肤酸碱值。

保藏说明：

菌株名称：乳双歧杆菌A13；

保藏编号：CGMCC No.24307；

拉丁学名：Bifidobacterium lactis；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏时间：2022年1月14日；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简写：CGMCC。

附图说明

图1为实施例4的面部精华和实施例5的面膜中主要活性成分电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1乳双歧杆菌乳双歧杆菌A13的鉴定

采用常规溶钙圈法进行分离、富集筛选，选用Biolog全自动微生物鉴定仪和Biolog Micro Station System软件对菌种进行鉴定，以发现目的菌种。

本发明筛选到的乳双歧杆菌的菌落特征：不透明乳白色，有光泽，圆形，边缘整齐，表面凸起且湿润，成对成簇分布，革兰氏阳性；

理化特性：于37℃连续培养72h，在14h进入对数生长期，40h活菌数达峰值4.214×10⁹CFU/mL，之后进入相对稳定生长状态，显示A13是一种厌氧菌，在37℃生长能力最佳，可有效利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等。A13具有优良的胃肠液和胆汁盐耐受性等，肠液存活率高，胆汁盐环境适应时间更短，能以活性状态进入人体肠道并存活于人及动物的胃肠道器官，发挥健康功能。

16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。

最终筛选出的菌株命名为乳双歧杆菌A13，于2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24307。

实施例2乳双歧杆菌发酵产物

取实施例1中的乳双歧杆菌进行发酵，发酵培养基选择莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基(青岛海博生物)，发酵条件为37℃，厌氧，培养72h，并对发酵产物进行检测。

结果表明：产物中包含氨基酸(14.26mg/g)、小肽(3.29mg/g)、多糖(13.24mg/g)、B族维生素(0.15mg/g)等有益护肤的成分，可加强角质层代谢，去除细胞自由基，抑制脂质的过氧化，激活机体修复性能，抑制细胞酪氨酸酶活性，具有修复、美白、抗氧化的功能。

产物中富含乳酸(12.74mg/g)和乳酸钠(9.86mg/g)，是人体天然保湿因子(NMF)中主要的水溶性酸类，吸湿性强，有效增强角质层的水合作用，防止皮肤水分流失；乳酸和乳酸钠组成缓冲溶液，对皮肤具有良好的亲和性，可调节皮肤酸碱值。

化妆品领域中，乳双歧杆菌发酵产物也可归为乳酸杆菌发酵产物的一类。

实施例3一种护肤品活性成分的制备方法

对实施例2中的发酵产物进行处理制备乳双歧杆菌发酵产物活性成分，具体步骤如下：发酵结束后，采用乳酸菌发酵液分离碟式离心机去除菌体、悬浮颗粒等固态杂质，继而微滤去除可能导致发酵液变性的可溶性杂质等，得发酵上清液。

对产物进行检测结果如下：氨基酸(13.83mg/g)、小肽(3.15mg/g)、多糖(12.38mg/g)、B族维生素(0.15mg/g)、乳酸(11.84mg/g)和乳酸钠(9.23mg/g)。

各类活性成分检测分析方法如下：

(1)氨基酸

氨基酸标准曲线的绘制：氨基酸称取0.5g，用水溶解后，定容至100mL配成5g/L的氨基酸标准溶液，HPLC测定不同浓度的氨基酸标准溶液对应的峰面积，绘制标准曲线。发酵上清液中氨基酸含量测定：吸取发酵上清液2μL，使用特定衍生缓冲液稀释及定容，采用HPLC测定方法，根据氨基酸的保留时间和紫外吸收谱进行定性分析；外标峰面积法进行氨基酸定量测定，计算氨基酸的含量。

(2)小肽

定量取样，采用三氯乙酸TCA沉淀法，离心分离高分子蛋白，得到小肽和氨基酸的混合液体，再用凯氏定氮法测定总氮含量，得到小肽和氨基酸混合液中的氮含量，折算成绝对量，除以取样样品量，乘以6.25，即可得到发酵上清液中的小肽和氨基酸总含量，扣除氨基酸的含量，即为小肽的含量。

(3)多糖

蒽酮-硫酸比色法，葡萄糖标准曲线的绘制：定量称取葡萄糖标准品，配制浓度为0.5mg/mL的对照品溶液，并稀释成不同浓度，按照葡萄糖：0.1％蒽酮-硫酸溶液体积比1:4的比例，混匀，煮沸10min，迅速放冷，黑暗中房放置10min，显色后采用紫外分光光度法测定其在特定波下的吸光度，绘制标准曲线。定量量取发酵上清液上清液，经过浓缩干燥等后处理，得粗多糖。定量称取粗多糖，配制成特定浓度的溶液，照标准曲线制备项下的方法，显色后采用紫外分光光度法测定其吸光度，计算含量。

(4)B族维生素

B族维生素标准曲线的绘制：定量称取并溶解定容，然后稀释至不同的浓度，采用HPLC测定不同浓度的维生素标准溶液对应的峰面积，绘制标准曲线。发酵上清液中B族维生素含量测定：定量吸取发酵上清液，并溶解定容，采用HPLC测定方法，根据不同维生素的保留时间和紫外吸收谱进行定性分析；外标峰面积法进行维生素定量测定，计算B族维生素的含量。

(5)乳酸

L-乳酸标准曲线的绘制：定量量取L-乳酸标准品，配制成一定浓度对照品母液，并稀释成不同浓度，采用HPLC测定在210nm下的峰面积，绘制标准曲线。发酵上清液中乳酸含量测定：定量吸取发酵上清液，稀释并定容，采用HPLC测定方法，根据乳酸的保留时间和紫外吸收谱进行定性分析；外标峰面积法进行定量测定，计算乳酸的含量。

(6)乳酸钠

乳酸钠标准曲线的绘制：定量称取乳酸钠标准品100mg，稀释定容至100mL，摇匀，配制对照品母液，并稀释成不同浓度，采用HPLC测定峰面积，绘制标准曲线。发酵上清液中乳酸钠含量测定：定量吸取发酵上清液，稀释并定容，采用HPLC测定方法，根据乳酸钠的保留时间和紫外吸收谱进行定性分析；外标峰面积法进行定量测定，计算乳酸钠的含量。

实施例4一种生物发酵面部精华

包括以下重量份的成分：

水	91％
		银耳(TREMELLA FUCIFORMIS)提取物	1.50％
甘油	1.00％
		水解胶原	1.50％
乳双歧杆菌发酵产物	2.50％
		芽孢杆菌/谷氨酸发酵产物滤液	1.00％
1,2-戊二醇	0.50％
		1,2-己二醇	0.50％
对羟基苯乙酮	0.50％

银耳(TREMELLA FUCIFORMIS)提取物购自西安优硕生物技术有限公司；

水解胶原购自武汉百瑞森生物医药有限公司；

芽孢杆菌/谷氨酸发酵产物滤液为以谷氨酸为原料，通过芽孢杆菌常规条件发酵，然后过滤，得到发酵产物过滤液，本实施例中选用的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC1.3358。

实施例5一种生物发酵面膜

包括以下重量份的成分：

水解胶原购自武汉百瑞森生物医药有限公司；

二裂酵母发酵产物溶胞物购自上海比莱化工。

实施例6乳双歧杆菌发酵产物抗氧化能力检测

称取DPPH 4mg溶于100mL无水乙醇。

取不同稀释倍数(蒸馏水稀释)的乳双歧杆菌发酵产物各1mL，加入3mL DPPH溶液，室温避光反应，6h后测定OD₅₁₇(三组平行计算平均值，记为A值)。对照组1：1mL样品+3mL无水乙醇(三组平行计算平均值，测OD₅₁₇记为B值)；对照组2：1mL水+3mL DPPH溶液(三组平行计算平均值测OD₅₁₇记为C值)；DPPH自由基清除率计算公式如下：

C-(A-B)/C×100％；

最终测得本申请乳双歧杆菌发酵产物DPPH自由基清除率为42.7％。

实施例7面部精华和面膜主要活性成分分析

将实施例4中的面部精华和实施例5中的面膜委托第三方进行活性成分分析，分析过程如下：

1、样品及预处理

收集委托样品，提取、浓缩，BCA定量，准备进行监测分析。

2、样品主要活性成分分析

选择Anti-EGF antibody[EPR19899](ab206423)为主要抗体，以WesternBlotting检测样品中活性成分，结果显示：样品含有具有显著免疫学活性的生物活性物质。如图1所示，参见第4、5、6道，1道为对照品，2、3道为市售其他产品。

结论，生物发酵面膜和精华中富含活性成分。

实施例8面部精华和面膜样品透皮吸收分析

对实施例4中的面部精华和实施例5中的面膜进行透皮吸收分析，以《化学品皮肤吸收体外试验方法》(GB/T 27818-2011)为参考，选用Franz扩散池试验方案对样品活性物质透皮能力进行检测分析。

结果显示：样品0.5h的渗透水平达到23％，1h渗透水平为37％，2h渗透水平为46％，接近峰值水平，4、12h渗透水平稳定48％。

结论：面膜和面部精华的活性成分具有显著透皮能力。

实施例9面部精华人群实验

征集80名志愿者(女性，年龄25-35)，分为2组，每组40人，使用不包括乳双歧杆菌发酵产物的面部精华的为对照组，其他为实验组，实验季节冬季，初次检测时间早上8：00，检测部位脸部，分别在使用面部精华前和使用面部精华后0h、6h、12h、24h进行皮肤含水量测试，对测试结果进行平均数计算，结果如下：

组别	使用前(％)	0h(％)	6h(％)	12h(％)	24h(％)
						对照组	40.3	68.9	50.8	42.7	41.4
实验组	41.5	72.6	61.5	60.2	52.2

对比例

与现有技术中的部分乳双歧杆菌进行对比：

序列表

<110> 深圳市多微生保健食品有限公司

<120> 一种乳双歧杆菌及其发酵方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actanagaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgggatcc ctggcagctt 60

gctgtcgggg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accaacctgc cctgtgcacc 120

ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatac cggatgctcc gctccatcgc atggtggggt 180

gggaaatgct tttgcggcat gggatggggt cgcgtcctat cagcttgttg gcggggtgat 240

ggcccaccaa ggcgttgacg ggtagccggc ctgagagggt gacccggcca cattgggact 300

gagatacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 360

gcctgatgca gcgacgccgc gtgcgggatg gaggccttcg ggttgtaaac cgcttttgtt 420

caagggcaag gcacggtttc ggccgtgttg agtggattgt tcgaataagc accggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tatccggatt tattgggcgt 540

aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg gtgtgaaagt ccatcgccta acggtggatc 600

tgcgccgggt acgggcgggc tggagtgcgg taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg 660

tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca atggcgaagg caggtctctg ggccgtcact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacggtg gatgctggat gtggggccct ttccacgggt cccgtgtcgg agccaacgcg 840

ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg 960

cttgacatgt gccggatcgc cgtggagaca cggtttccct tcggggccgg ttcacaggtg 1020

gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

accctcgccg catgttgcca gcgggtgatg ccgggaactc atgtgggacc gccggggtca 1140

actcggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttacgtcca gggcttcacg 1200

catgctacaa tggccggtac aacgcggtgc gacacggtga cgtggggcgg atcgctgaaa 1260

accggtctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaaggcgga gtcgctagta 1320

atcgcggatc agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

agtcatgaaa gtgggtagca cccgaagccg gtggcccgac ccttgtgggg ggagccgtct 1440

aaggtgatac tagtgattg 1459

Claims

1.一种乳双歧杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.24307，于2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种乳双歧杆菌制备物，其特征在于，通过权利要求1所述的乳双歧杆菌制备得到，所述的制备物为活菌、死菌、发酵液，发酵液上清、发酵液沉淀、发酵液提取物、培养物、培养物提取物、冻干粉中的一种或多种。

3.一种乳双歧杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将权利要求1所述的乳双歧杆菌接种于培养基；

S2、条件培养。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基为MRS培养基、LB培养基、LBS培养基、MC培养基中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的条件培养的条件为：莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基，37±1℃，厌氧，培养72±3h。

6.权利要求1所述的乳双歧杆菌在制备日用品中的应用。

7.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的日用品为化妆品，所述的化妆品为面膜、面部精华或面霜。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的面膜、面部精华或面霜中包括权利要求1所述的乳双歧杆菌和/或其制备物。

9.一种乳双歧杆菌冻干粉，其特征在于，通过权利要求1所述的乳双歧杆菌进行制备。

10.一种活性菌剂，其特征在于，通过权利要求1所述的乳双歧杆菌进行制备。