DE60110209T2

DE60110209T2 - Aerothricin analoge, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60110209T2
Application number: DE60110209T
Authority: DE
Inventors: Masami Fujisawa-shi KOHCHI; Kazunao Yokohama-shi MASUBUCHI; Takeshi Murata; Takehiro Fujisawa-shi OKADA; Nobuo Chigasaki-shi SHIMMA
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2001-01-11
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: WO2001053322A2; ZA200205115B; KR100474161B1; CA2396174C; EP1254161B1; MXPA02006963A; JP2003520804A; ATE293637T1; KR20020063932A; CN1189478C; ES2240394T3; CA2396174A1; AU2514801A; US6849709B2; US20010031728A1; DE60110209D1; BR0107609A; CO5261554A1; EP1254161A2; CN1396929A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf cyclische Verbindungen, die antifungale Aktivität haben (im weiteren Aerothricine genannt), die Verwendung von Aerothricinen in der medizinischen Therapie, pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Aerothricine sowie auf Verfahren zur Herstellung von Aerothricinen.
Gegenwärtig werden antifungale Azole weitverbreitet zur Behandlung systemischer Mykosen benutzt. Wegen ihrer fungistatischen Wirkung hat die prophylaktische Langzeitverwendung von antifungalen Azolen jedoch zur Entstehung azolresistenter Candida spp. geführt. Deshalb sind fungizide Agenzien insbesondere wichtig für die Behandlung ernster systemischer Mykosen, besonders gegen pulmonale Aspergillose. Weiterhin sind die derzeit verfügbaren antifungalen Agenzien nicht wirksam gegen Scedosporium spp., das eines der Pathogene ist, die unter immuninkompetenten Patienten auftreten. Amphotericin B ist ein gegenwärtig gebräuchliches hocheffektives fungizides Mittel, aber sein therapeutischer Index (wirksame Dosis zu toxischer Dosis) ist ziemlich eng. Gewisse cyclische Verbindungen wie LY303366 ( EP 736 541 ), WF11243 ( EP 584 360 ) zeigen bekanntermassen fungizide Wirkung aufgrund der Hemmung der β-1,3-Glucansynthetase. Sie haben jedoch noch Nachteile in Bezug auf das antifungale Spektrum und/oder das Sicherheitsprofil. Die Entwicklung neuer fungizider Mittel mit besserem Sicherheitsprofil und besserer Wirksamkeit gegen die die wichtigeren systemischen Pathogene einschliesslich Aspergillus fumigatus und Scedosporium spp. ist daher dringend erforderlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft Aerothricine der Formel (I)
worin
R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[-5-amino-2-N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino, N-(2-Aminoethyl)-N-[-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino or Ornityl-ornitylamino;
R² Wasserstoff oder Methyl;
R³ Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und
pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
Das Dokument WO 00/05251 A, veröffentlicht nach dem Prioritätstag dieser Anmeldung, offenbart eine Aerothricinverbindung, die von den Aerothricinen der vorliegenden Erfindung durch Disclaimer ausgeschlossen würde.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Aerothricin der Formel (I) und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Ausserdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Infektionskrankheiten verursacht durch pathogene Microorganismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Aerothricine der Formel (I), worin R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-5-amino-2-(N,N-bis (2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino, N-(2-Aminoethyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino oder (L)-Ornityl-(D)-ornitylamino; R² Wasserstoff oder Methyl, bevorzugt Wasserstoff; R³ Wasserstoff oder Hydroxy, bevorzugt Wasserstoff sind, und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I), worin R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-((2S)-2,5-diaminovaleryl]amino und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (IIIa)
und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I), worin R¹ (L)-Ornityl-(D)-ornitylamino und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (IVa)
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), worin R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (Va)
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), worin R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-5-amino-2-[N,N-bis- (2-aminoethyl)amino]valeryl]amino und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (VIa)
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), worin R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (VIIa)
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), worin R¹ N-(2-Aminoethyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis-(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, und R² und R³ Wasserstoffatome sind, nämlich eine Verbindung der Formel (VIIIa)
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
Aerothricine gemäss der vorliegenden Erfindung sind Aerothricine, wie in der folgenden Tabelle 1 exemplifiziert:
Tabelle 1

*(R) Konfiguration,
**(S) Konfiguration

Aerothricine der Formel (I) können nach den in Schema 1 und 2 dargestellten Methoden aus den Aerothricinen 1, 2 oder 3 hergestellt werden, wobei die Aminoschutzgruppen P₁ und P₂ ausgewählt sein können aus tert.-Butoxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und so weiter;
R² and R³ sind wie oben definiert.
Verfahren A
Die Ausgangsverbindungen, Aerothricine der Formel (II) können hergestellt werden durch Kultivierung eines Microorganismus, der zu Deuteromycotina gehört, der fähig ist, Aerothricin 1, 2 und 3 [Aerothricin 3 (= WF11243) ist in Referenzbeispiel 1 beschrieben] unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen oder festen Medium herzustellen, und Isolierung von Aerothricin 1, 2 und/oder 3 aus der Kultur.
[worin R² Wasserstoff oder Methyl und R³ Wasserstoff oder Hydroxy].
Die Verbindungen der Formel II können in Verbindungen der Formel I mit Hilfe der nachfolgenden Verfahren B oder C überführt werden: Verfahren B

Verfahren C
Die Verfahren A bis C können in grösserem Detail wie folgt veranschaulicht werden.
Verfahren A
Die Microorganismen, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden, können von jedem Stamm einschliesslich Mutanten und Varianten sein, der zu Deuteromycotina gehört, der fähig ist Aerothricin 1, 2 und 3 zu produzieren. Besonders bevorzugt ist der Stamm NR 7379, der aus herabgefallenen Blättern , vorzugsweise gesammelt bei Kagoshima in Japan, und identifiziert als ein Stamm, der zu Deuteromycotina gehört.
Die Kultivierungs- und morphologischen Charakteristika des Stammes NR 7379 sind wie folgt:
1. Kultivierungscharakteristika:
Maismehl Agar (CMA):
Wachstum war nicht beträchtlich. Die Kolonien erreichten 11 mm im Durchmesser vom Inoculum (Agar Pfropfen von 4.5 mm Durchmesser) nach 14 Tagen bei 25°C. Sie waren eben und blass creme-gelb. Die Rückseite war blass creme-gelb. Farblose schleimige Exudate waren vorhanden.
Miura's Medium (LCA):
Wachstum war nicht beträchtlich. Die Kolonien erreichten 11 mm im Durchmesser vom Inoculum nach 14 Tagen bei 25°C. Sie waren eben und blass creme-gelb. Die Rückseite war blass creme-gelb. Farblose schleimige Exudate waren nicht vorhanden.
Malzextrakt Agar (MEA):
Wachstum war nicht beträchtlich. Die Kolonien waren pustelförmig und erreichten einen Durchmesser von 18 mm vom Inoculum nach 14 Tagen bei 25°C. Die Farbe der Kolonien war blass gelblich braun. Die Rückseite war von gleicher Farbe. Exudate waren farblos und schleimig.
Kartoffel-Dextrose (PDA):
Wachstum war nicht beträchtlich. Die Kolonien waren pustelförmig erreichten einen Durchmesser von 14 mm vom Inoculum nach 14 Tagen bei 25°C. Die Farbe und Textur der Kolonien war ähnlich denen auf MEA. Exudate waren farblos und schleimig.
Keimung wurde zwischen 5°C und 30°C auf CMA, LCA. MEA und PDA beobachtet.
Morphologische Eigenschaften:
Mycel war teilweise eingetaucht, teilweise oberflächlich, verzweigt, septiert und hellbraun bis creme-gelb. Conidiophoren wurden von eingetauchtem Mycel gebildet. Sie waren glasig, septiert, verzweigt und unregelmässig. Konidiogene Zellen waren auf ausgeprägten Conidiophoren oder irregularen Hyphen. Sie waren enteroblastisch, phialidisch, terminal und subterminal. Terminale und subterminale Phialiden waren variabel in Länge und Form. Sie waren zylindrisch bis lageniform und ihre Länge und Breite waren bis zu 5,5 bis 10 μm bzw. 2,5 bis 5,5 μm. Unregelmässige, filiforme Conidiophoren mit lateralen conidiogenen Zellen unmittelbar unterhalb der Septa wurden häufig gebildet. Konidien waren einzellig, glasig, glatt, globos bis subglobos, 2,0 bis 5,5 μm in der Länge und 2,0 bis 5,0 μm in der Breite.
Auf Basis dieser ausgeprägten Kultivierungs- und morphologischen Charakteristika gehörte der vorliegende Stamm zu Deuteromycotina und wird als Deuteromycotina NR 7379 bezeichnet.
Der Stamm, bezeichnet als Deuteromycotina NR 7379, wurde am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan im Namen von Nippon Roche K. K., 6-1, Shiba 2-chome, Minato-ku Tokyo, 105 Japan am June 16, 1998 unter dem Budapest Abkommen als Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) hinterlegt.
Die Kultivierung gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, das übliche für zu züchtende Microorganismen verwertbare Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquellen können z. B. Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerin, Molasse, Dextrin, und Mischungen hiervon genannt werden. Stickstoffquellen sind z. B. Soyabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Corn Steep Liquor, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen davon. Weiterhin können dem Kulturmedium andere organische oder anorganische Verbindungen zur Förderung des Wachstums von Microorganismen und zur Erhöhung der Aerothricin 1 Produktion beigefügt werden. Beispiele solcher Substanzen sind anorganische Salze so wie Kalziumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und so weiter.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen vorzugsweise in einem flüssigen Medium durchgeführt durch Submersfermentation, oder in einem festen Medium durch statische Fermentation. Eine Temperatur von 20°C bis 30°C mit einer Optimaltemperatur von 27°C ist geeignet für die Kultivierung. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9 durchgeführt. Die Kultivierungszeit hängt von den Bedingungen ab, unter denen die Kultivierung duchgeführt wird. Im allgemeinen ist es ausreichend, die Kultivierung während 20 bis 360 Stunden durchzuführen.
Um die gewünschten Aerothricine 1, 2 und 3 von den Kulturen zu ernten, können die Abtrennungsmethoden gut eingesetzt werden, die normalerweise zur Isolierung von Metaboliten verwandt werden, die durch Microben aus ihren Kulturen produziert werden. Aerothricin 1, zum Beispiel, das eine mit Methanol extrahierbare amphotere Substanz ist, kann vorteilhaft in der folgenden Weise gewonnen werden.
Der gesamte Kulturfestkörper, der bei der Festkörper-Fermentation erhalten wird, wird mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Die Lösungsmittel, die benutzt werden können, um die Zielverbindung aus dem gesamten Kulturfestkörper zu extrahieren, schliessen wasserlösliche organische Lösungsmittel oder wässerige Lösungen wasserlöslicher organischer Lösungsmittel ein, wie z. B. Methanol, Ethanol und wässerige Alkohole.
Um Salze, wasserlösliche Substanzen usw. aus dem erhaltenen Extrakt zu entfernen, wird mit Vorteil eine Lösungsmitteltrennung zwischen Wasser und einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. n-Butanol, Ethylacetat, etc. Zur Entfernung färbender Substanzen, fettlöslicher Substanzen, usw. aus dem Extrakt wird mit Vorteil eine Lösungsmittelreinigung mit Methanol, Ethanol, einem Gemisch aus Acetonitril und 0.1 %iger wässeriger Trifluoressigsäure, etc. verwandt.
Zur vollständigen Reinigung von Aerothricinen wird vorteilhaft Säulenchromatographie eingesetzt. Träger, die bei einer derartigen Säulenchromatographie benutzt werden, sind z.B. YMC-GEL ODS (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) or Preparative C18 (Waters Millipore Corporation). Als ein Eluens wird ein Lösungsmittelsystem bestehend aus einer Mischung von wässeriger Trifluoressigsäure und geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Ethanol, Acetonitril, etc. eingesetzt. Die so gereinigte Eluatfraktion, die alle Komponenten enthält kann einer Konzentrierung oder Gefriertrocknung unterworfen werden, um die Aerothricine 1, 2 und 3 zu pulverisieren.
Die Aerothricine 1, 2 und 3 werden als Trifluoressigsäuresalz isoliert, die freien Aerothricine 1, 2 und 3 können jedoch nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Und zwar wird das Trifluoressigsäuresalz von Aerothricin 1, 2 und 3 in Wasser gelöst, dem ein Äquivalent Natriumhydroxid zugesetzt wurde, und das Gemisch einer Säulenchromatographie mit Sephadex LH-20 unterworfen, gefolgt von einer Eluierung mit einem wässerigen Alkohol, wie Methanol-Wasser, etc, um hierbei die Aerothricine 1, 2 bzw. 3 zu erhalten.
Verfahren B
Die Verbindungen der Formel (III) können aus den Aerothricinen der Formel (II) [worin R¹ eine Aminogruppe und R² und R³ wie oben definiert sind] in vier Stufen hergestellt werden: (1) N-Alkylierung mit Acrylonitril, (2) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (3) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁ und P₂) und (4) Reduktion der Cyanogruppe.
Die Verbindungen der Formeln (V, VI) können aus Aerothricinen der Formel (II) [worin R¹ eine Aminogruppe und R² und R³ wie oben definiert sind] in sechs Stufen hergestellt werden: (1) N-Alkylierung mit Acrylonitril, (2) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (3) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁), (4) reduktive N-Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (5) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₂) und (6) Reduktion der Cyanogruppe.
Die Verbindungen der Formel (VIII) können aus Aerothricinen der Formel (II) [worin R¹ eine Aminogruppe und R² und R³ wie oben definiert sind] in sechs Stufen hergestellt werden: (1) reduktive N-Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (2) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (3) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁), (4) reduktive N-Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (5) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁) und (6) Reduktion der Cyanogruppe.
Die Verbindungen der Formeln (VII) können aus Aerothricinen der Formel (II) [worin R¹ eine Aminogruppe und R² und R³ wie oben definiert sind] in sechs Stufen hergestellt werden: (1) N-Alkylierung mit Acrylonitril, (2) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (3) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁), (4) N-Alkylierung mit Acrylonitril, (5) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₂) und (6) Reduktion der Cyanogruppe.
Verfahren C
Die Verbindungen der Formeln (IV) können aus Aerothricinen der Formel (II) [worin R¹ eine Aminogruppe und R² und R³ wie oben definiert sind] in vier Stufen hergestellt werden: (1) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (2) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₁), (3) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin, (4) Entfernung der Aminoschutzgruppen (P₂).
In den oben genannten Verfahren B und C kann

(a) die N-Monoalkylierung einer Aminogruppe mit Acrylonitiril nach der Methode bechrieben in Organic Synthesis, Col. Vol. III, Seite 93 durchgeführt werden;
(b) die N-Alkylierung eines primären oder sekundären Amins durch eine herkömmliche reduktive Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd unter Verwendung eines Reduktionsmittels wie Natriumcyanoborhydrid in Gegenwart oder Abwesenheit einer schwachen Säure wie Essigsäure durchgeführt werden; die Reaktion kann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Essigsäure usw. ausgeführt werden.
(c) die Reduktion der Nitrilgruppe durch katalytische Hydrierung oder durch Reduktion mit Natriumborhydrid/Kobaltchlorid, Boranmethylsulfid-Komplex usw. durchgeführt werden [s. J. Med. Chem., 37, 222 (1994)];
(d) die N-Acylierung einer Aminogruppe mit Hilfe von N-geschütztem Ornitin durchgeführt werden unter Benutzung von Kondensationsmitteln, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, BOP, HBTU, TNTU, PyBroP^TM, PyBOP^TM, TBTU, TSTU, HOBt usw. oder einer Kombination von zweien hiervon; die Reaktion kann durchgeführt werden in einem Lösungsmittel wie Methanol. Ethanol, Pyridine, N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon usw. in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base wie Triethylamin, Di-isopropylethylamin, Pyridin usw. bei einer Temperatur zwischen zwischen –20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C;
(e) die Entfernung der Aminoschutzgruppen durch Fachleuten bekannte Methoden durchgeführt werden, z. B. Behandlung mit Trifluoressigsäure bei einer Boc-Gruppe oder Piperidin bei einer Fmoc-Gruppe.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Säureadditionssalze von Aerothricinen. Die Säureadditionssalze können als Trifluoressigsäuresalze nach üblicher Isolierung erhalten werden. Das so erhaltene Salz kann in Wasser gelöst und durch eine Anionenaustauschersäule beladen mit dem gewünschten Anion geschickt werden. Das Eluat enthaltend das gewünschte Salz wird dann eingeengt, um das Salz als Festprodukt zu gewinnen.
Die Aerothricine der Formel (I) können in ein entsprechendes Salz aufgrund der Anwesenheit der tertiären Stickstoffatome verwandelt werden.
Die Säureadditionssalze von Aerothricinen der Formel (I) können durch Behandlung der freien Base des Aerothricins mit zumindest einer stöchiometrischen Menge einer geeigneten Säure erhalten werden, wie Mineralsäuren, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpertersäure, Phosphorsäure usw, und organischen Säuren, z. B. Essigsäure, Propionsäure, Hydroxyessigsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Tartronsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Methylsulfonsäure, Ethylsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, usw. Typischerweise wird die freie Base in einem inerten organischen Lösungsmittel gelöst, wie Mehtanol, Ethanol usw., und die Säure in einem ähnlichen Lösungsmittel zugegeben. Die Temperatur wird auf ca. 40°C gehalten. Das erhaltene Salz fällt spontan aus oder kann mit einem weniger polaren Lösungsmittel aus der Lösung gebracht werden.
Die Säureadditionssalze von Aerothricinen der Formel (I) können in die entsprechende freie Base überführt werden durch Behandlung mit mindestens der stöchiometrischen Menge einer geeigneten Base, wie Natrium oder Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat, Kaliumbicarbonat, Ammoniak usw.
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Aerothricine zeigen breite fungizide Aktivität gegen verschiedene Pilze und können als Mittel zur Behandlung und Prophylaxe von Pilzinfektionskrankheiten verwendet werden. Die antifungale Aktivität in vitro und in vivo (s. Tabellen 2, 3-1 und 3-2) sowie die Hepatocyten-Toxizität (s. Tabelle 4) repräsentativer Aerothricine der Formel (I) stellt sich wie folgt dar:
1. Antifungale Aktivitäten in vitro
Die antifungalen Aktivitäten in vitro repräsentativer Aerothricine der vorliegenden Studie wurden ermittelt durch Bestimmung der 80% inhibitorischen Konzentration (IC₅₀), die als niedrigste Konzentration eines antifungalen Mittels kalkuliert wurde, um das Wachstum von Pilzen im Vergleich zum Wachstum einer drogenfreien Kontrolle spektrophotometrisch auf 20% Trübung zu begrenzen.
Die IC₅₀ Werte wurden mit Hilfe der "Broth-Microdilution"-Prozedur bestimmt, basierend auf dem NCCLS Approved Standard mit den folgenden kleineren Änderungen (National Commitee for Clinical Laboratory Standards, 1997 Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts, Approved Standard, Document M27-A). Yeast Nitrogen Base (YNB; Difco Lab.) ergänzt mit 1%Glucose und 0,25% K₂HPO₄ wurde als Testmedium für Hefen benutzt; das gleiche Medium mit 0,2% Agarose von niedrigem Schmelzpunkt (BRL) wurde für die Fadenpilze verwandt. Die Grösse des Inoculum war 1 – 3 × 10³ Zellen/ml, und die Inkubation erfolgte 1 – 2 Tage bei 35 °C.
Tabelle 2: Antifungale Aktivität in vitro, IC₈₀ (μg/ml)
2. Antifungale Wirksamkeit in vivo
2-1: Systemische Mäuse-Candidose
Die antifungale Wirksamkeit in vivo gegen systemische Candidose von Aerothricinen gemäss der vorliegenden Erfindung ist in der folgenden Tabelle 3-1 gezeigt. Mäuse eines herkömmlichen immunokompetenten Mäusestammes, Crj:CD-1(ICR), wurden als experimentelle Infektionsmodelle für systemische Candidose eingesetzt. Die Crj:CD-1(ICR) Mäuse wurden für die systemische Candidose vier Wochen alt eingesetzt, indem man ihnen Candida albicans 5 × 10⁶ Konidien/Maus über die Schwanzvene injizierte. Die Testverbindungen wurden einmal intravenös (i. v.) genau nach der Infektion an systemischer Candidose gegeben. Werte für die 50%-effektive Dosis (ED₅₀) wurden bei jeder Dosis aus der Überlebendenzahl am Tag 7 errechnet. Tabelle 3-1: Antifungale Aktivität in vivo gegen systemische Candidose in Mäusen ED₅₀ (mg/kg) am Tag 7

Aerothricin 132 0,43

Aerothricin 133 0,35

Aerothricin 135 0,35
2-2: Pulmonale Mäuse-Aspergillose
Die antifungale Wirksamkeit in vivo von Aerothricinen gemäss der vorliegenden Erfindung ist in der folgenden Tabelle 3-2 gezeigt. Pulmonale Mäuseaspergillose wurde in Cortison behandelten (250mg/kg, zweimalige subkutane Behandlung an drei Tagen vor und am Behandlungstag) männlichen ICR Mäusen erzeugt. Diese Mäuse wurden intratracheal mit Konidien von A. fumigatus (2,5 × 10⁵ Konidien/Maus) infiziert und Behandlungen wurden vier Tage einmal täglich vorgenommen. Die Wirksamkeit jeder Droge wurde aus der Überlebendenanzahl ermittelt und die 50%-effektive Dosis (ED₅₀) wurde aus der Überlebendenanzahl bei jeder Dosis an 14 Tagen bestimmt. Tabelle 3-2 Antifungale Aktivität in vivo gegen pulmonale Aspergillose in Mäusen, ED₅₀ (mg/kg) am Tag 14

Aerothricin 132 5,2

Aerothricin 134 5,8

Aerothricin 137 5,2

Aerothricin 3 > 15
3. In vitro Hepatotoxizitätstest
Die Mäusehepatocyten wurden mit Hilfe von Collagenaseverdauung isoliert und in Microtestplatten kultiviert. Die Hepatcytenmonoschichten wurden den Testaerothricinen in dem Kultivierungssystem einen Tag lang ausgesetzt. Nach einer Kultivierungszeit, wurden die Hepatocyten unter dem Mikroskop angeschaut und morphologisch beurteilt. Der Grad der morphologischen Veränderung (Degeneration) der Hepatocyten durch die Testaerothricine wurde mit WF11243 und LY303366 verglichen. Tabelle 4: Cytotoxiziät für Hepatocyten (μg/ml)

Aerothricin 132 > 100

Aerothricin 134 > 100

Aerothricin 135 > 100

WF11243 (= Aerothricin 3) 100

LY303366 10
Die Verabreichung von 5 mg/kg und 30 mg/kg of Aerothricin 132 (einmal täglich: i. v.) an Mäuse für zwei Wochen zeigte keine akute Toxizität.
Demnach zeigen die Aerothricine der Formel (I) sowie pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon starke antifungale Aktivität gegen verschiedene Pilzinfektionen in Mäusen, einschliesslich Aspergillose, und sind daher einsetzbar über einen breiten Dosisbereich und als antifungale Mittel verwendbar. Weiterhin sind die Aerothricine der vorliegenden Erfindung viel weniger cytotoxisch gegenüber Hepatocyten als die bekannten Peptidderivate (WF11243 und LY303366).
Aerothricine gemäss der vorliegenden Erfindung können auch zur Verhinderung oder Linderung von Pneumocystis carinii Infektionen in immunkompromitierten Patienten nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend die neuen Aerothricine der Formel (I) sowie pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
Die neuen Aerothricine der Formel (I) sowie deren pharmazeutisch akzeptable Salze sind also hochaktive fungizide Mittel. Sie sind aktiv gegen eine Vielzahl von Pilzarten einschliesslich Candida spp., Aspergillus spp., Scedosporium spp., Mucor spp. and Absidia spp.
Folglich sind die Aerothricine der vorliegenden Erfindung geeignet für die topische und systemische Behandlung von Mykosen in Tieren wie auch in Menschen. Beispielsweise sind sie geeignet zur Behandlung von topischen und mukosalen Pilzinfektionen, verursacht von Candida spp., Trichophyton spp., und Microsporum spp. Sie können auch verwandt werden für die Behandlung systemischer Pilzinfektionen, verursacht z. B. von Candida spp., Aspergillus spp. oder Scedosporium spp.
Für die klinische Verwendung können die neuen Aerothricine der Formel (I) sowie deren pharmazeutisch akzeptable Salze allein verabreicht werden, werden aber im allgemeinen in einer pharmazeutischer Abmischung verabreicht, die in geeigneter Weise für die bestimmte Verwendung und Zweck formuliert ist, indem man Hilfsstoffe, Bindemittel, Gleitmittel, Desintegrant, Beschichtungsmittel, Emulgator, Suspensionsmittel, Lösungsmittel, Stabilisator, Absorptionsverbesserer und/oder Salbenbasis zumischt.
Pharmazeutische Formulierungen der Aerothricine für orale Verabreichung können Granalien, Tabletten, zuckerbeschichtete Tabletten, Kapseln, Pillen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Für parenterale Injektion, z. B. intravenös, intramuskulär oder subkutan, können Aerothricine der Formel (I) in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwandt werden, die andere Substanzen enthalten kann, z. B. Glucose, um die Lösung isoton zu machen. Diese Zusammensetzungen können in Form von Einheitsdosen in Ampullen oder in Multidosis-Containern dargereicht werden, vorzugsweise mit beigefügten Konservierungsmitteln. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Pulverform sein zur Wiederaufbereitung mit einem geeigneten Trägervehikel vor der Verabreichung. Aerothricine können in Form von Suppositorien oder Pessaren verwandt werden, oder sie können topisch als Lotion, Creme, Salbe, oder Puder eingesetzt werden.
Die tägliche Dosis von Aertothricinen der Formel (I) ist von 0,1 bis 50 mg/kg (in geteilten Dosen), wenn auf oralem oder parenteralem Wege angewandt. Folglich kann man von Tabletten oder Kapseln von Aerothricinen erwarten, dass sie von 5 mg bis 0,5 g Aktivverbindung zur Verabreichung ein- oder zwei- oder mehrmals am Tag enthalten, je nach Erfordernis. In jedem Fall kann die tatsächliche Dosis vom Arzt bestimmt werden und sie kann variiert werden im Hinblick auf Alter, Gewicht und Reaktion eines bestimmten Patienten.
Wenn Aerothricine eingesetzt werden, um Pneumocystis Infektionen zu kontrollieren, ist es wünschenswert, direkt Lungen und Bronchien zu behandeln. Aus diesem Grund sind Inhalationsmethoden bevorzugt. Zur Verabreichung durch Inhalation oder nasal werden Aerothricine gemäss der vorliegenden Erfindung in einfacher Weise in Aerosolsprayform aus Druckflasche und Zerstäuber eingesetzt. Das bevorzugte Darreichungssystem zur Inhalation oder nasal ist ein Dosierinhalationsspray, das als Puder, Suspension oder Lösung einer Verbindung der Formel (I) in einem passenden Treibgas wie Fluorkohlenwasserstoffen oder Kohlenwasserstoffen formuliert sein kann.
Obwohl die Aerothricine der vorliegenden Erfindung als Tabletten, Kapseln, topische Zusammensetzungen, Insuftlationspulver, Suppositorien und so weiter eingesetzt werden können, macht sie die Löslichkeit der Aerothricine der vorliegenden Erfindung in Wasser oder wässerigen Medien anwendbar für Injektionsformulierungen und auch in flüssiger Zusammensetzung geeignet für Aerosolsprays.
Die folgenden Beispiele, die nicht den Zweck haben, den Schutzbereich der Erfindung auf sie einzuschränken, illustrieren bevorzugte Verfahren für die Herstellung von Aerothricinen der vorliegenden Erfindung.
In den nachfolgenden Beispielen wurden die Produkte mit Hilfe von HPLC analysiert und gereinigt, unter Benutzung einer Umkehrphasensäule ausgewählt aus jenen, die unten aufgelistet sind. Das Lösungsmittelgemisch bestand aus 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril mit dem in jedem Beispiel angegebenen passenden Verhältnis.
HPLC Säulen:

Säule A : CAPCELL PAK C18, UG-120, 4,6 × 250mm
Säule B : CAPCELL PAK C18, UG-120, 10 × 250mm
Säule C : CAPCELL PAK C18, UG-80, 20 × 250mm
Säule D : CAPCELL PAK C18, SG-120, 4,6 × 250mm
Säule E : CAPCELL PAK C18, SG-120, 10 × 250mm
Säule F : TSK GELODS-80Ts, 20 × 250mm

In den folgenden Beispielen wurden die Aerothricine als Trifluoressigsäuresalze erhalten, wenn nicht anders angegeben.
Referenzbeispiel 1
Herstellung von Aerothricin 1, 2 und 3
a) Festkörperfermentation
Eine 0,1 ml Portion der gefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10%er (v/v) Glycerinlösung wurde aufgetaut und in einen 500ml Erlenmeyer Kolben inokuliert, enthaltend 100 ml eines Mediums bestehend aus 2% Glucose, 1 % Kartoffelstärke, 1,5% Glycerin, 1 % Toast-Soya (Nissin Seiyu), 0,35% Hefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Polypepton (Nihon Seiyaku), 0,3% NaCl, 0,5% CaCO₃, 0,005% ZnSO₄·7H₂O, 0,0005% CuSO₄·5H₂O und 0,0005% MnSO₄·4H₂O. Der pH des Mediums wurde nicht eingestellt. Die Inkubation der Saatkultur erfolgte auf einer Rotationsschüttelmachine während 7 Tagen bei 27°C und 220 upm. 2 ml der Saatkultur wurden in einen 3-Liter Erlenmeyerkolben überführt, der ein festes Medium bestehend aus 200 g gepresster Gerste, 0,12 g Hefeextrakt (Difco), 0,06 g Natriumtartrat, 0,06 g KH₂PO₄, und 120 ml Wasser enthielt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter statischen Bedingungen durchgeführt. Die Produktion erreichte das Maximum bei rund 240 h Fermentation, und die Kultur wurde einer Isolierungsprozedur für Aerothricin 1, 2 und 3 unterzogen.
Zum Kulturfestkörper (10 kg) wurde Methanol (40 l) gegeben und das Gemisch gerührt, gefolgt von einer Filtration, um einen Methanolextrakt (39 l) zu erhalten. Der so erhaltene Methanolextrakt wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockene eingeengt, und zu dem Rückstand (64,8g) wurden Ethylacetat (1 l) und Wasser (1 l) gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, gefolgt von der Abtrennung der Ethylacetatschicht.
Die wässerige Schicht wurde ebenso zweimal mit Ethylacetat (1 l) gewaschen. Die verbleibende wässerige Schicht wurde dreimal mit n-Butanol (1 l) extrahiert. Die erhaltenen Extrakte wurden kombiniert und unter reduziertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand (28,5 g) in einer Mischung (250 ml) von Acetonitril-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (1:1) gelöst. Nach Entfernung von unlöslichem Material durch Zentrifugieren wurde die so erhaltenen Lösung unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft und Methanol (300 ml) zum Rückstand gegeben und das Gemisch gerührt, gefolgt von einer Filtration, um eine Methanollösung (280ml) zu erhalten. Das in Methanol lösliche Material wurde dann einer Säulenchromatographie auf Umkehrphasensilikagel C18 (1 l) unterworfen. Die Säule wurde schrittweise eluiert unter Benutzung von Methanol-0,1% wässeriger Trifluoressigsäure (2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 und 8:2). Die Aerothricine 1, 2 und 3, eluiert in dieser Reihenfolge mit Methanol-0,1% wässeriger Trifluoressigsäure (7:3), wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt, um weisses, pulveriges Aerothricin 3 Trifluoressigsäuresalz (731 mg) bzw Aerothricin 1 Trifluoressigsäuresalz (747 mg) zu ergeben. Die Fraktion enthaltend Aerothricin 2 wurde unter reduziertem Druck eingeengt und weiter mit HPLC unter den folgenden Bedingungen gereinigt: Capsell Pak C18 (i.D. 30 × 250 mm, Shiseido Co., LTD.); mobile Phase Acetonitril-0,1% wässerige Trifluoressigsäure (45:55); Flussrate: 40ml/min; Detektion: UV 220 nm. Die entsprechenden Eluate erhalten unter den oben angegebenen Bedingungen wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt, um weisses, pulveriges Aerothricin 2 Trifluoressigsäuresalz (42 mg) zu erhalten.
b) Fermentierung im Kolben
Eine 2 ml Portion der gefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10%er (v/v) Glycerinlösung wurde aufgetaut und in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, enthaltend 100 ml eines Mediums bestehend aus 1 % Glucose, 1 % Hafermehl, 4% Tomatenpaste, 0,5% Corn Steep Liquor (Ando kasei), 0,001 % FeSO₄·7H₂O, 0,001 % MnSO₄·4H₂O, 0,0001 % CaCl₂, 0,0002% ZnSO₄·7H₂O, 0,00002% (NH₄)6MoO₂·4H₂O, und 0,00006% H₃BO₃. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Inkubation der Saatkultur erfolgte auf einer Rotationsschüttelmachine während 3 Tagen bei 27°C und 220 upm. 2 ml der ersten Saatkultur wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, der 100ml desselben Mediums enthielt, und auf einer Rotationsschüttelmaschine unter gleichen Bedingungen 3 Tage inkubiert. 2ml der zweiten Saatkultur wurden in einen 500ml Erlenmeyerkolben inokuliert, enthaltend 100 ml eines Mediums bestehend aus 8,5% Glycerin, 1 % Citruspectin, 0,4% Erdnusspulver, 0,4% Kasein aus vitaminfreier Milch, 0,4% Tomatenpaste, 0,4% Corn Steep Liquor (Ando kasei), 0,2% Glycin und 0,2% KH₂PO₄. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 27°C mit einer Bewegung von 220 upm. durchgeführt. Nach 10 Tagen Kultivierung erreichte die Produktion das Maximum, und die gesamte Kultur wurde der Isolierungsprozedur für Aerothricin 1, 2 und 3 unterworfen.
c) Jar-Fermentierung
Eine 2 ml Portion der gefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10%er (v/v) Glycerinlösung wurden aufgetaut und in einen 500ml Erlenmeyerkolben inokuliert, enthaltend 100 ml desselben Saatmediums wie oben beschrieben. Der Kolben wurde 3 Tage bei 27°C und 220 upm. geschüttelt. 2 ml der ersten Saatkultur wurden in einen 500ml Erlenmeyerkolben überführt, der 100ml desselben Mediums enthielt und auf einer Rotationsschüttelmaschine unter gleichen Bedingungen 3 Tage inkubiert. 600ml der zweiten Saatkultur wurden in einen 50-Liter Jar-Fermenter, der 30 l desselben Zuchtmediums enthielt wie oben beschrieben, sowie 0.4% Entschäumer (Nissan Disfoam CA-123). Die Fermentation wurde bei 27°C durchgeführt mit einer Belüftung von 30 l/min und einer Bewegung von 400 upm. Die Produktion erreichte das Maximum bei ungefähr 168 h Fermentation, und die gesamte Kultur wurde der Isolierungsprozedur für Aerothricin 1, 2 und 3 unterworfen.
Aerothricin 1

1) Aussehen: Weisser Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS Methode): m/z 1547 (M+H)⁺
3) Summenformel: C₇₂H₁₁₈N₁₄O₂₃
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1547,8568 Berechnet für C₇₂H₁₁₈N₁₄O₂₃: 1547,8572
5) UV-Spektrum (1): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (10600 sh), 270±5 (2000), 278±5 (2100) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240±5 (7700), 268±5 (1800), 298±5 (1800)
6) IR Spektrum (KBr) (2): Wellenzahlen der Hauptabsorptionen (cm^–1) sind wie folgt:: 3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837
7) ¹H-NMR Spektrum (3): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR Spektrum (4): 100 MHz, inCD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith Reagenz, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi Reagenz, Bromocresolgrün, 2, 4-Dinitrophenylhydrazine- Schwefelsäure
11) Dünnschichtchromatographie (TLC):
*¹ E. Merck AG., Germany
12) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Träger: Capcell Pak C18 gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase : Acetonitril : 0,05% wässerige Trifluoressigsäure = 1 : 1 Durchflussrate: 1 ml/min. Rt = 12,1±0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 1 wurde 24h erhitzt auf 120°C in 6N HCl, gefolgt von einer Aminosäureanalyse zur Festellung von Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Thyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Aerothricin 2

1) Aussehen: Weisser Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS Methode): m/z 1549(M+H)⁺
3) Summenformel: C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₄
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1549,8384 Berechnet für C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₄: 1549,8365
5) UV-Spektrum (5): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (10200 sh), 275±5 (1900), 278±5 (2000) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240±5 (7700), 293±5 (2000)
6) IR Spektrum (KBr) (6): Wellenzahlen der Hauptabsorptionen (cm^–1) sind wie folgt:: 3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837
7) ¹H-NMR Spektrum (7): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR Spektrum (8): 100 MHz, inCD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith Reagenz, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi Reagenz, Bromocresolgrün, 2, 4-Dinitrophenylhydrazine-Schwefelsäure
11) Dünnschichtchromatographie (TLC):
*¹ E. Merck AG., Germany
12) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Träger: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase : Acetonitril : 0,05% wässerige Trifluoressigsäure = 1 : 1 Durchflussrate: 1 ml/min. Rt = 9,9±5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 2 wurde 24h erhitzt auf 120°C in 6N HCl, gefolgt von einer Aminosäureanalyse zur Festellung von Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, 3-Hydroxythyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Aerothricin 3

1) Aussehen: Weisser Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS Methode): m/z 1533(M+H)⁺
3) Summenformel: C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₃
4) UV-Spektrum: in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (11000 sh), 275±5 (1900), 280±5 (1900) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 243±5 (7800), 295±5 (1800)
5) IR Spektrum (KBr): Wellenzahlen der Hauptabsorptionen (cm^–1) sind wie folgt:: 3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836
6) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
7) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith Reagenz, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi Reagenz, Bromocresolgrün, 2, 4-Dinitrophenylhydrazine-Schwefelsäure
8) Dünnschichtchromatographie (TLC):
*¹ E. Merck AG., Germany
9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Träger: Capcell Pak C18 gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase : Acetonitril : 0,05% wässerige Trifluoressigsäure = 1 : 1 Durchflussrate: 1 ml/min. Rt = 9,1±0,5
10) Aminosäureanalyse: Aerothricin 3 wurde 24h erhitzt auf 120°C in 6N HCl, gefolgt von einer Aminosäureanalyse zur Festellung von Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Thyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Beispiel 1
Herstellung von Aerothricin 132

(a) Zu einem Gemisch von Aerothricin 3 (500 mg, 0,326 mmol) und Triethylamin (682 μl, 4,89 mmol) in MeOH (10 ml) wurde Acrylnitril (214 μl, 3,27 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Das Gemisch wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft wurde, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum eingeengt. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren genaue Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und gefriergetrocknet, um 207mg of Aerothricin 120 (Verbindung der Formel (I), worin R² und R³ Wasserstoff sind und R¹ (2-cyanethyl)-amino) sind) als farblosen amorphen Feststoff zu ergeben. HPLC (Rt) 27,5 min (Säule F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 53:47); FAB-MS (m/z) 1586 [M+H]⁺.
(b) Zu einer gerührten Lösung von Boc-L-Orn(Boc)-OH (46 mg, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) wurden BOP Reagenz (62 mg, 0,14 mmol), HOBT Hydrat (22 mg, 0,144 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (24 μl, 0,138 mmol) gegeben. Nachdem 2 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde eine Lösung von Aerothricin 120 (100 mg, 0,063 mmol) and N-Ethyldiisopropylamin (24 μl, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) dem Reaktionsgemisch zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur 20 h gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Eine Lösung des oben erhaltenen rohen Rückstandes in TFA (3 ml) wurde bei 0°C 30 min gerührt. Das Reaktionsgefäss wurde geöffnet und TFA unter einem Strom trockenen Stickstoffs verdampft. Der Rückstand wurde durch päparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die reinen Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 60,5 mg der Verbindung 1 als weissen amorphen Festkörper zu erhalten. HPLC (Rt) 20,7 min (column F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57 : 43); FAB-MS(m/z) 1700 [M+H]⁺.
(c) Zu einer Mischung der Verbindung-1 (60,5 mg, 0,0356 mmol) in Dioxan (2 ml) und Wasser (2 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (10 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem bei Raumtemperatur 14 h gerührt wurde, wurde die Mischung durch ein Membranfilter (Porengrösse: 0,2 mm) filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 27,8 mg Aerothricin 132 als einen farblosen Feststoff zu ergeben. HPLC (Rt) 18,9 min (column F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60 : 40); FAB-MS (m/z): 1704[M+H]⁺.

Beispiel 2
Herstellung von Aerothricin 134

(a) Zu einer gerührten Lösung von Fmoc-L-Orn (Boc)-OH (379 mg, 0,834 mmol) in DMF (6 ml) wurde BOP Ragens (368 mg, 0,832 mmol), HOBT Hydrat (128 mg, 0,836 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (145μl, 0,832 mmol) zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur 2 h gerrührt wurde, wurde eine Lösung von Aerothricin 120 (600 mg, 0,378 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (145 μl, 0,832 mmol) in DMF (3 ml) der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem 18 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde Piperidin (3 ml) dem Gemisch zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Ragenzien zu entfernen. Das Rohprodukt wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
(b) Zu einer Lösung des oben erhaltenen Rohprodukts (320 mg) in MeOH (10 ml) wurden (2-Oxoethyl)carbaminsäure-tert-butylester (roh, 530 mg), AcOH (2 ml) und NaBH₃CN (210 mg, 3,342 mmol) in MeOH (4 ml) zugegeben. Nachdem das Gemisch 20 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum eingedampft. Eine Lösung das oben erhaltenen Rohprodukts in TFA (6 ml) wurde bei 0°C 30 min gerührt. Das Reaktionsgefäss wurde geöffnet und TFA unter einem Strom trockenen Stickstoffs verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 88,2 mg der Verbindung-2 als weissen amorphen Festkörper zu erhalten. HPLC (Rt) 22,4 min (Säule F, Flussrate: 10ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60 : 40)
(c) Zu einer Mischung der Verbindung-2 (88,2 mg, 0,0494 mmol) in Dioxan (1,5 ml) und Wasser (1,5 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem bei Raumtemperatur 16 h gerührt wurde, wurde die Mischung durch ein Membranfilter (Porengrösse: 0,2 mm) filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 22,0 mg Aerothricin 134 als einen farblosen amorphen Feststoff zu ergeben. HPLC (Rt) 25,7 min (column F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 63 : 37); FAB-MS (m/z): 1790 [M+H]⁺.

Beispiel 3
Herstellung von Aerothricin 135
Aerothricin 135 wurde entsprechend einer Methode ähnlich der in Beispiel 2 beschriebenen hergestellt:
HPLC (Rt) 25,5 min (Säule F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 63 : 37); FAB-MS (m/z): 1790 [M+H]⁺.
Beispiel 4
Herstellung von Aerothricin 136

(a) Zu einer gerührten Lösung von Fmoc-L-Orn(Boc)-OH (379 mg, 0,834 mmol) in DMF (6 ml) wurde BOP Reagenz (368 mg, 0,832 mmol), HOBT Hydrat (128 mg, 0,836 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (145 μl, 0,832 mmol) zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur 2 h gerührt wurde, wurde eine Lösung von Aerothricin 120 (600 mg, 0,378 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (145 μl, 0,832 mmol) in DMF (3 ml) der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem 18 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde Piperidin (3 ml) dem Gemisch zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Ragenzien zu entfernen. Das Rohprodukt wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
(b) Zu einer Lösung des oben erhaltenen Rohprodukts (300 mg) in EeOH (10 ml) wurden Acrylonitril (110 μl, 1,68 mmol)) und N-Ethyldiisopropylamin (44 μl, 0,253 mmol) zugegeben. Nachdem das Gemisch 14 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden Acrylonitril (440 μl, 6,72 mmol)) und N-Ethyldiisopropylamin (44 μl, 0,253 mmol) zugegeben. Nachdem das Gemisch 22 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden Acrylonitril (220 μl, 3,36 mmol)) und N-Ethyldiisopropylamin (44 μl, 0,253 mmol) zugegeben. Nachdem das Gemisch 6 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Reagenzien zu entfernen. Eine Lösung das oben erhaltenen Rohprodukts in TFA (3 ml) wurde bei 0°C 30 min gerührt. Das Reaktionsgefäss wurde geöffnet und das TFA unter einem Strom trockenen Stickstoffs verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 104,6 mg der Verbindung-3 als weissen amorphen Festkörper zu erhalten. HPLC (Rt) 27,8 min (Säule F, Flussrate: 10ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57 : 43)
(c) Zu einer Mischung der Verbindung-3 (104,6 mg, 0,0596 mmol) in Dioxan (3 ml) und Wasser (3 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (25 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem bei Raumtemperatur 16 h gerührt wurde, wurde die Mischung durch ein Membranfilter (Porengrösse: 0,2 mm) filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen unten gezeigt sind. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 40,3 mg Aerothricin 136 als einen farblosen amorphen Feststoff zu ergeben. HPLC (Rt) 25,8 min (column F, Flussrate: 10 ml/min, Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 63 : 37); FAB-MS (m/z): 1761 [M+H]⁺.

Beispiel 5
Herstellung von Aerothricin 133

(a) Zu einer Lösung von Aerothricin 3 mono-TFA-Salz (2,5g) in DMF (10 ml) wurden Fmoc-L-Orn(Boc)-OH (850 mg), BOP (180 mg), HOBT (279 mg) und N-Ethyldiisopropylamin (0,795 ml) zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur 3 h gerührt wurde, wurde eine Lösung von Piperidin (4,0 ml) zugegeben. Das Rühren bei Raumtemperatur wurde 30 min fortgesetzt und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan gelöst, und tropfenweise Zugabe von Diethylether ergab das rohe Produkt als weisses amorphes Pulver. Es wurde mit Ether gewaschen und im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
(b) Das oben erhaltene Rohprodukt wurde in DMF (20 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Boc-L-Orn(Boc) OH (656 mg), BOP (872 mg), HOBT (302 mg) und N-Ethyldiisopropylamin (0,793 ml) gegeben. Nachdem die Mischung 3 h. bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft.
(c) TFA (15 ml) wurde bei 0°C zum oben erhaltenen Rückstand gegeben. Nachdem die Mischung 30 min bei 0°C gerührt wurde, wurde tropfenweise Ether zugegeben, um einen weissen Niederschlag zu erhalten Er wurde mit Ether gewaschen und mit Hilfe von präparativer Umkehrphasen HPLC gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereint, gefroren und lyophilisiert, um 515 mg Aerothricin 133 als farblosen amorphen Feststoff zu ergeben: HPLC (Rt): 19,7 min. (Säule F, Flussrate: 10 ml/min., Eluens : 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0.05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60 : 40); FAB-MS (m/z) : 1761(MH⁺].

Beispiel 6
Herstellung von Aerothricin 137

(a) Zu einer Lösung von Aerothricin 3 mono-TFA-Salz (622 mg) in Dichlormethan (16 ml) und MeOH (4 ml) wurden N-Boc-Aminoethanal (120 mg) und N-Ethyldiisopropylamin (0,072 ml) zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur 1 h gerührt wurde, wurden zu der Reaktionsmischung Natriumcyanoborhydrid (48 mg) und Schwefelsäure 0,04 ml) gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung 72 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und danach 0,1N HCl zugegeben. Es wurde mit nBuOH extrahiert und eingeengt.
(b) Der Rückstand wurde in DMF (6 ml) gelöst, dem 2-(S)-[Bis-(2-boc-aminoethyl)-amino]-5-Boc-aminopentansäure (294 mg), HOAt (77 mg), HBTU (215 mg) and N-Ethyldiisopropylamin (0,148 ml). Nachdem 48 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurde Ether gegeben, um einen weissen Niederschlag zu erhalten. Er wurde mit Ether gewaschen und ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
(c) Zu der oben erhaltenen Verbindung wurde TFA (3 ml) bei 0°C gegeben. Nachdem 30 min bei 0°C gerührt wurde, wurde zu der Reaktionsmischung Ether gegeben, um einen weissen Niederschlag zu ergeben. Er wurde mit Ether gewaschen und mit Hilfe von präparativer Umkehrphasen HPLC gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, gefroren und lyophilisiert, um 95 mg Aerothricin 137 als farblosen amorphen Feststoff zu ergeben: HPLC (Rt): 14,6 min. (Säule F, Flussrate : 10 ml/min., Eluens: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 61 : 39); FAB-MS (m/z): 1776 [M+H]⁺.

Beispiel A
Injizierbare Lösungen, jede enthaltend die folgenden Bestandteile wurden in für sich herkömmlicher Weise hergestellt:

Aerothricin 132 20 mg

Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 7,6 mg

Natriumbiphosphatdihydrat 2,0 mg

Ethylalcohol 150 mg

Destilliertes Wasser, deionisiert, steril 850 mg

Total 1029,6 mg

Claims

Aerothricine, welche durch die Formel (I) dargestellt werden,
wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino, N-(2-Aminoethyl)-N-[-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino oder Ornityl-ornitylamino ist; R² Wasserstoff oder Methyl ist; R³ Wasserstoff oder Hydroxy ist; sowie pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen, ausser solchen, wo R² und R³ Wasserstoff sind und R¹ (R)-Ornityl-(R)-ornitylamino ist.
Aerothricin gemäss Anspruch 1, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2- aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-5-amino-2-(N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino, N-(2-Aminoethyl)-N-((2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino oder (L)-Ornityl-(D)-ornitylamino ist.
Aerothricine gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei R² und R³ Wasserstoff sind.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ (L)-Ornityl-(D)-ornitylamino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ N-(2-Aminoethyl)-N-((2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino ist.
Aerothricin gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R¹ N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino ist und R² und R³ Wasserstoff sind.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 4, wobei das Verfahren umfasst: (a) N-Alkylierung einer Verbindung der Formel (II) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind] mit Acrylnitril, (b) Acylierung der resultierenden Verbindung mit N-geschütztem Ornitin, (c) Entfernen der Aminoschutzgruppen (P₁ und P₂) und (d) Reduktion der Cyanogruppe.
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Ansprüche 6 und 7, wobei das Verfahren umfasst: (a) N-Alkylierung einer Verbindung der Formel (II) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind] mit Acrylnitril, (b) Acylierung der resultierenden Verbindung mit N-geschütztem Ornitin, (c) Entfernen der Aminoschutzgruppe, die zu der Ketogruppe benachbart ist (P₁), (d) reduktive N-Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (e) Entfernen der verbleibenden Aminoschutzgruppe (P₂) und (f) Reduktion der Cyanogruppe.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 9, wobei das Verfahren umfasst: (a) reduktive N-Alkylierung einer Verbindung der Formel (II) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind] mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (b) Acylierung der resultierenden Verbindung mit N-geschütztem Ornitin, (c) Entfernen der Aminoschutzgruppe, die zu der Ketogruppe benachbart ist (P₁), (d) reduktive N-Alkylierung mit N-geschütztem Aminoacetaldehyd, (e) Entfernen der verbleibenden Aminoschutzgruppe (P₂) und (f) Reduktion der Cyanogruppe.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 8, wobei das Verfahren umfasst: (a) N-Alkylierung einer Verbindung der Formel (II) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind] mit Acrylnitril, (b) Acylierung der resultierenden Verbindung mit N-geschütztem Ornitin, (c) Entfernen der Aminoschutzgruppe, die zu der Ketogruppe benachbart ist (P₁), (d) N-Alkylierung mit Acrylnitril, (e) Entfernen der verbleibenden Aminoschutzgruppe (P₂) und (f) Reduktion der Cyanogruppe.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 5, wobei das Verfahren umfasst: (a) Acylierung einer Verbindung der Formel (II) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind] mit N-geschütztem Ornitin, (b) Entfernen der Aminoschutzgruppe, die zu der Ketogruppe benachbart ist (P₁), (c) Acylierung mit N-geschütztem Ornitin und (d) Entfernen der verbleibenden Aminoschutzgruppe (P₂).
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Mykosen.
Die Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, die durch pathogene Mikroorganismen verursacht werden.