DD282711A5 - Verfahren zur herstellung eines antibiotikums - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das als Antiinfektivum, Kokzidiostatikum und Virostatikum fuer die Therapie von Infektionskrankheiten von potentiellem Nutzen ist. Die Erfindung verfolgt das Ziel, das neue Polyen-Antibiotikum, welches die Bezeichnung Diffusomycin erhielt und eine breitspektrale antibakterielle Wirkung aufweist in einem effektiven Prozesz als Reinprodukt herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem ein Mikroorganismus der Art Streptomyces albus, vorzugsweise der Stamm Streptomyces albus JA 3453-D, auf einem komplexen Medium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischen Salzen unter submersen Kultivierungsbedingungen angezogen und das Antibiotikum Diffusomycin aus dem Myzel und dem Kulturfiltrat mittels organischer Loesungsmittel extrahiert sowie anschlieszend mit chromatographischen Verfahren bis zur Homogenitaet gereinigt wird.{Polyen-Antibiotikum; Diffusomycin; Herstellung durch Fermentation; Streptomyces albus Stamm JA 3453, breitspektrale antibakterielle Wirkung; Antiinfektivum; Kokzidiostatikum; Virostatikum; in vitro-Aktivitaet; Wirkstoff von potentiellem Nutzen}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft -.in Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das als Antiinfektivum, Kokzidostatikum sowie Virostatikum für die Therapie von Infektionskrankheiten bei Mensch, Nutztier und Pflanze von potentiellem Nutzen ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Trotz der großen Anzahl bisher aus Mikrooi ganismen, Tieren und Pflanzen isolierter Antibiotika hält die Suche nach neuen antibiotischen Wirkstoffen unvermindert an, wobei sich neue Schwerpunkte hinsichtlich der Anwendung als Antiparasitaria (z. B. Kokzidiostatika) und Virostatika abzeichnen. I Irsache für die anhaltende Suche nach neuen Antibiotika sowie nach verbesserten Verfahren zu ihrer Herstellung sind folgende Nachteile bzw. nachstehende Optionen:

- Ungenügende Wirksamkeit vorhandener Wirkstoffe gegen alte und neue Problemkeime, wobei die Entwicklung von Resistenzen unter Antibiotikaselektionsdruck bis zur volligen Inaktivität gebräuchlicher Präparate führen kann;

- hohe Toxizität und unerwünschte Nebenwirkungen bek.wnter Präparate;

- Auffinden neuer Präparate mit verbesserten Gebrauchswerten einschließlich Entwicklung von Verfahren zu ihrer ökonomisch günstigeren Herstellung sowie

- Möglichkeit einer partial- und totalsynthetischen Modifikation von neuen natürlichen Wirkstoffen bzw. Bereitstellung solcher Substanzen als „Leitstrukturen" und damit verbundene Möglichkeit zur jeweils zweckgerechten Anpassung von Struktur-Wirkungsbeziehungen.

Das Auffinden neuer Antibiotika und die Charakterisierung ihres Wirkungsmechanismus hat forner große Bedeutung für die Erkennung molekularer Ursachen von Krankheiten (z. B. Viruserkrankungen) und der zellulären Wirkorte pathogener Zellen (Mikroben, Parasiten, Viren).

Polyene bilden eine Gruppe ungesättigter und zum Teil Stickstoff enthaltender makrozyklischer Lactone und Lactame, die vor allem durch ihre antifungale Wirkung bekannt sind (BERDY, J. et al. CRC hundbock of antibiotic compounds. Vol. II, p. 165-313). Einzelne Vertreter dieser Wirkstoffklasse wie Amphotericin Bund Nystatin haben Eingang in die Therapie von Dermatomykosen sowie in die Landwirtschaft als Phytofungizide erlangt. Über den Einsatz von Polyenen als Kokudiostatika und Virostatika ist bisher keine Information bekannt (BERDY, J. et al., a. a. Ο., p. 169-175 (198O]; FINLAY u. RADlCS, cn. J. Chem. 58,579-590 [1980]).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Antibiotikums, um die Palette der bekannte Antibiotika mit antibakterieller, kokzidiostatischer und virostatischer Wirkung um einen Vertreter mit einer neuen, originären Struktur zu erweitern, der als Therapeutikum zur Bekämpfung von Krankheiten von potentie"em Nutzen ist.

-2- 282 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches, mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe ein neues Antibiotikum unter Verwendung eines bakteriellen Mikroorganismus bei Einsatz eines billigen Nährmediums gewonnen und bis zur Homogenität gereinigt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus der Art Streptomyces albus, vorzugsweise der Stamm Streptomyces albus JA 3453-D, unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Medium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen wie Glucose, Stärke bzw. Sojamehl und mit den in der Fermentationsindustrie üblichen Mineralzusätzen zum Medium kultiviert wird (Submersfermentation).

Der Mikroorganismus JA 3453-D ist in der DDR-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900 Jena, Beutenbergerstr. 14, unter der Registriernummer ZIMET 43859 hinterlegt worden.

Die Kultivierung und Erhaltung des eingesetzten Mikroorganismus der Art Str. albus, vorzugsweise des Stammes ZIMET 43859, wird wie folgt vorgenommen:

In Glucose/Gelatine (5%ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien von o. g. Beschaffenheit eingeimpft, und das entstandene Myzel wird bei einer Temperatur zwischen 20°C und 38⁰C, vorzugsweise 26⁰C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einem pH-Wert kultiviert, der zu Beginn der Fermentation zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt. Die Fermentation des jeweils eingesetzten Str. albus-Stammes kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentoren bzw. V2A-Taη <s durchgeführt werden.

Der Nachweis des neuen Antibiotikums im Kulturfiltrat erfolgt nach Extraktion definierter Volumina mit CHCI₃, Einengen des Extraktes bis zur Trockne und Resolvatisation in einer definierten Menge Methanol mittels des Agarplatten-Diffusionstestes unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testkeim. Dabei werden an den Rändern scharf abgegrenzte Zonen erhalten, innerhalb derer das Antibiotikum das Bakterienwachstum partiell hemmt. Durch die Hemmwirkung des scharf abgegrenzten Antibiotikums kommt es zur Ausbildung in ihrer Lichtstreuung gegenüber der Umgebung deutlich veränderter „diffuser" Hemmzonen, in denen ein stark vermindertes Wachstum gtampositiver oder gramnegativer Testkeime gleichermaßen festgestellt wird. Für die Bezeichnung des neuen Antibiotikums aus Streptomyces albus, vorzugsweise aus dem Stamm Str. albus JA 3453, wurde daher der Name Diffusomycin gewählt.

Die Herstellung von reinem Antibiotikum Diffusomycin erfolgt dadurch, daß das Kulturfiltrat mit Chloroform sowie das Myzel mit Aceton extrahiert wird. Aus der mit Wasser verdünnten Acetonlösung kann Antibiotikum Diffusomycin durch Extraktion mit CHCI₃ gewonnen werden. Die Gewinnung aus den vereinigten CHCI₃-Extraktion erfolgt in an sich für lipophile Substanzen bekannter Weise durch Chromatographie an Kieselgel (Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie) unter Verwendung organischer Solventien als Elutionsmittel. Eine weitere Feinreinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von Aceton als Eluent. Auf diese Weise wird hochreines Antibiotikum Diffusomycin erhalten, das durch folgende physikochemische Charakteristika gekennzeichnet ist: Eigenschaften: schwachgelbliche, wachsartige Masse, Schmelzpunkt 54⁰C bis 56⁰C (unkorriyiert) Molekulargewicht: (FAB-MS) m/z 655: C₃₆H₄₉N₃Os Charakteristische Fragmentpeaks wurden durch EI-MS erhalten: gef. m/z 593,3504 (,3465 ber. für C₃₄H₄₇N₃O₆; M⁺ -COz-H₂O) gef. m/z 575,3349 (,3359 ber. für C₃₄H₄₆N₃O₆; M⁺ -CO₂^H₂O) gef. m/z 561,3207 (,3302 ber. für C₃₃H₄₃N₃O₆; M⁺ -CH₂-H₂O-CH₃OH) gef. m/z 543,3183 (,3097 ber. für C₃₃H₄₁N₃O₄; M⁺ -CO^H₂O-CH₃OH) gef. m/z 453,2762 (,2627 ber. für C₂₆H₃₆N₃O₄) Stabilität: Stabil in Aceton oder Dimethylsulfosid

Chemische Analyse: Stickstoffgehalt gef. 6,99%; ber. 6,75% Rf-Werte (Silufol-Kieselgelfolien): 0,4(Benzen/Aceton;3:5;v/v)

0,35 (CHCI₃/MeOH; 9:1, v/v)

IR-Spektrum (cm-')IKBr): 500; 645; 700; 750; 810; 830; 890; 900; 950; 960; 992; 1040; 1080; 1100; 1120; 1180; 1290; 1330;

1380; 1385; 1395; 1430; 1450; 1510; 1535; 1645; 1695; 1826; 2930; 2960; 3350; UV-Spektrum (EtOH)(nm): 335,268,277,290 (Trien-Chromophor) Optischer Drehwert: [a]_D = 36,0° (0,5dm; 10mg; 1ml) Abb. 1 zeigt das 400-Hz-'H-Protonenspektrum

Abb.2 zeigt das 100-MHz-^l3C-NMR-Spektrums des Antibiotikums Diffusomycin Antimikrobielle Aktivität bei Anwendung von 50\ig Diffusomycin im Agardiffusionstest:

Mit folgenden Testkeimen wurden Hemmzonendurchmesser von 16rnm bis 45 mm Durchmesser (scharf abgegrenzte Partidlhemmung) festgestellt: Bacillus äubtilis ATCC 6633; Staphylococcus aureus SG 511; Escherichia soli mutabile SG 458; Serratia marcescens SG 621; Proteus vulgaris SG 2 (OX 19); Escherichia coli C 600; Klebsiella aerogenes SG 117; Pseudomonasseruginosa SG 137; Pseudomonas aeruginosa K 799.

Die antiviralen In-vitro-Aktivitäten des Antibiotikums Diffusomycin in Einstufenreplikationszyklus-Versuchen mit Influenza A/Stamm WSN; Herpes simplex hominis-Virus Typ 1 Stamm Kupka und Vaciniaviru3 Stamm Lister in Hühnerembryonal- und RH-Zellen zeigt Tabelle 1.

Tabelle 2 gibt die Ergebnisse der Plaquereduktionsversuche mit Antibiotikum Diffusomycin bei Influenza Α-Virus, Herpes simplex hominis-Virus Typ 1 und Vacciniavirus in Hühnerembryonalzellen wieder (TONEW, E. u. TONEW, M., ZbI. Bakt. I, Orig.

211,437-444 (1969); TONEW, M. u. GLÜCK, B., J. Basic Microbiol. 26,173-189 (1986); REED, J. u. Münch, H., Am. J. Hyg. 27, 493-497(1938).

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der kokzidiostatischen Wirksamkeitsprüfung am Brutei nach WIESNER, J. (Diss. FSU Jena, 1973).

Die Vorteile der Erfindung werden wie folgt gesehen:

- Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein in seiner chemischen Struktur neuartiges Antibiotikum vom Typ der Polyenlactame auf fermentativem Wege hergestellt.

- Wie die Ergebnisse der Prüfung hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit gezeigt haben, handelt es sich um ein Antibiotikum eines neuen Wirkungstyps, da eine breitspektrale partielle Wachstumshemmung auftritt, die im Vergleich zu einer Vielzahl bekannter Antibiotika ein wesentliches Charakteristikum von Diffusomycin darstellt.

- Nach den Ergebnissen der antiviralen und kokzidiostatischen In-vitro-Untersuchungen weist das Antibiotikum eine gute Wirksamkeit gegenüber Testkeimen bzw. -Organismen und zugleich eine niedrige Toxizitat gegenüber lebende Zellen auf.

- Unter definierten Bedingungen, z. B. in acetonischer Lösung, bzw. gelöst in Dimethylsulfoxid, ist das Antibiotikum Diffusomycin unter Ausschluß von Luftsauerstoff langzeitig chemisch stabil.

- Das Antibiotikum Diffusomycin wird als Einzelkomponente gebildet. Eine Anwesenheit bioaktiver Nebenprodukte mit ähnlicher Struktur (Kongenoren) ist nicht festgestellt worden. Die Abtrennung eines coproduzierten Vertreters eines anderen Strukturtyps (Pentalenolacton) gelingt problemlos bei Anwendung chromatographischer Methoden.

Aüsführungsbelspiel

An Erde lyophil getrocknete Myzelfragmente des Stammes Str. »!bus ZIMET 43859 dienen zur Beimpfung eines für Streptomyceten übixhen Agarmediums folgender Zusammensetzung (g/l):

Backhefe 15; Maisstärke 10; NaCI 5; Fleischpepton 1; Agar 20;

Inokulumkulturen werden durch Einsatz von Myzelstücken der Agarkultur oder von gefriergetrockneten Myzelien als Stammkultur in ein Medium folgender Zusammensetzung erhalten (g/l):

Sojamehl 40; Glucoso 40; NaCI 2,5; NaCO₃ 5; KH₂PO₄ 0,25; pH6,3.

Die zweite Vorkultur erfolgt auf dem gleichen Medium. Nach 48stündiger Bebrütung der Vorkultur in 500-ml-Stoilbrustflaschen

(80ml Inhalt, 25°C, Rundschwingtisch, 180UpM) wird die stufenweise Maßstabvergrößerung durch Übertragung von Kulturproben in 5-l-Steilbrustflaschen und weitere 24 Stunden Bebrütung bei 27⁰C durchgeführt.

Für die Kultivierung in 500-ml-Steilbrustflaschen oder in Fermentoren wird ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet

Sojamehl 40; Glucose 20; Kartoffelstärke 30; NH₄NO₃ 2; CaCO₃ 2; pH 6,2 (vor der Sterilisation).

Die Belüftung erfolgt mit steriler Luft (1:1). Die Fermentationszeit beträgt 72 Stunden bis 120 Stunden und die Rührgeschwindigkeit in Fermentoren 280UpM. Eine Schaumbildung kann in an sich bekannter Weise durch Zusatz kleiner Mengen an Polypropyienglykol kontrolliert werden.

Nach Beendigung der Fermentation wird das My:el durch Separatoren abgetrennt. Aus 2Ol Fermentationslösung werden etwa 0,7 kg feuchter Myzelrückstand erhalten, der in 51 Aceton über Nacht suspendiert wird. Nach dem Absaugen von extrahierten Myzel wird der Acetonextrakt mit 51 Wasser verdünnt und gemeinsam mit dem Kulturfiltrat 2mal mit je 51CHCI₃ extrahiert. Nach dem Trocknen des CHCI₃-Extraktes mit Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand (Öl, 50g bis 100g) in 20-g-Portionen an einer Kieselgelsäule (300g Kieselgel) unter Verwendung von Benzen/Aceton (3:5; v/v) als Laufmittel chromatographiert. Bioaktive Zonen, erkenntlich entweder durch die deutliche Partialhemmung des Bakterienwachstums unter Verwendung von Bacillus subtllis ATCC 6633 im üblichen Agarplatten-Diffusionstest oder durch charakteristische Anfärbung mit 3% Vanillin in konz. H₂SO₄ beim Tüpfeln auf Chromatogrammfolien (Silufol, Kieselgel), werden vereinigt. Ausbeute: 4g bis 5g (Öl).

Zur Feinreinigung wird das Rohprodukt auf Chromatogrammplatten Kieselgel H (1 mm Schichtdicke, lufttrocken) (20 χ 20cm; O,5g/Platte) aufgetragen, die mit Benzen/Aceton (3:5; v/v) entwickelt werden. Die durch die o. g. Farbreaktion mit 3% Vanillin/ H₂SO₄ festgestellten substanzhaltigen Zonen werden mit Aceton eluiert und konzentriert.

Anschließend wird das erhaltene Produkt (etwa 2 g) auf Silufol-Folien (Kieselgel) aufgetragen, die mit CHCI3/M00H (9:1, v/v) entwickelt werden. Die das Antibiotikum Diffusomycin enthaltende Substanzzone wird mit Aceton eluiert. Ausbeute: 0,5g, Reinheit etwa 85%.

Hochreines Antibiotikum Diffusomycin wird schließlich erhalten, indem je 0,1 g Diffusomycin auf Kieselgelplatten aufgetragen und 2mal im System Benzen/Aceton (5:3, v/v) entwickelt wird. Die Substanz wird von den entsprechenden Zonen mit Aceton eluiert. Der Rückstand des nach Einengen erhaltenen Produktes wird in wenig Aceton gelöst und der Säulenchromatographie (Säule 15cm x 0,6cm) an organophilen Dextrangel unter Verwendung von Aceton als Eluent unterworfen. Dabei erscheint Diffusomycin vor den Verunreinigungen im Eluat und wird nach Einengen der entsprechenden bioaktiven Fraktionen im Vakuum als schwach gelblicher, wachsartiger Feststoff erhalten. Die Lösung des Antibiotikums Diffusomycin in Aceton ist bei 4⁰C unter Ausschluß von Luftsauerstoff mehr als 6 Monate, bei Raumtemperatur mindestens 3 Wochen, haltbar.

Tabelle 1

Ergebnisse der antiviralen Wirkung von Diffusomycin in Einstufenreplikatlonszyklusversuchen mit Influenza A/Stamm WSN, Herpes simplex hominis-Virus Typ 1 Stamm Kupka und Vacciniavirus Stamm Lister in Hühnerembryonal- und RH-Zellen.

Virus Stamm

Zellen

Influenza

HSVTypi Kupka

Vaccinia Lister

HEZ

HEZ

HEZ

Influenza A/WSN

HSVTypi Kupka

Vaccinia Lister

RH

RH

RH

Konz.	Titersenkung in 1OgI0TCID6Q	%
in	in 0,2 ml zur Viruskontrolle	Hem
mcg/ml		mung
125	6,33	>99,9
62,5	6,0	>99,9
31,25	4,17	>99,9
15,62	3,0	>99,9
125	6,17	>99,9
62,5	6,0	>99,9
31,25	3,67	>99,9
15,62	2,5	99,7
125	4,5	>99,9
62,5	2,5	99,7
31,25	2,0	99,0
15,62	1,65	97,2
250	6,5	>99,9
125	6,33	>99,9
62,5	3,23	>99,9
31,25	3,0	99,9
250	6.17	>99,9
125	5,67	>99,9
62,5	3,75	>99,9
31,25	2,5	99,7
250	4,0	>99,9
125	1,6	97,5
62,5	1,0	90
31,25	0,33	n.s.

Mittelwerte aus 3 Versuchen; n. s. = nicht signifikant HEZ = Hühnerembryonalzellen; RH = permanente humane Nierenzellen

Tabelle 2

Ergebnisse der PIaquereduktionsversuche mit Diffusomycin und Influenza Α-Virus, Herpes simplex hominis-Virtis Typ 1 und Vacciniavirus in Hühnerembryonalzellen

Virusstamm Konzentration Plaquereo iktion berechnet zur

in mcg/ml unbehandc Iten Viruskontrolle in %

Influenza	125	97
A/WSN	62,5	83
	31,25	67
	15,62	51
Herpes Kupka	125	91
simplex	62,5	84
hominis	31,25	62
Typ1	15,62	49
Vaccinia	125	87
Lister	62,5	71
	31,25	62
	15,62	43

Titerbestimmungen aus 3 Versuchen

Tabelle 3

Ergebnisse der Testung von Diffusomycin auf kokzidiostatische Aktivität gegen Eimaria tenalla, Stamm WC AM-P 20, in Intraallantoisch Infizierten Hühnerembryonen

Konzentration	Gruppen	Latalität	Letalität	Testergebnio
im Test	stärke	im Experi	der Kon
(pg/Embryo)		ment	trollgruppe
1. Akute Toxizität
100	10	100%	-
33	10	70%	-	LD60 = 28 [ig
11	10	10%	-
2. Kokzidiostase
10	17	6%	100%	+++
3	18	0%	100%	+++
1	22	0%	100%	+++

+++ = ρ < 0,001 (Vierfeldertest nach FISHER)

Legenden zu den Abbildungen Abb.1: 400MHz-'H-NMR-Spektrum des Antibiotikums Diffusomycin (Varian XLAA-400) Abb.2: 100MHz-"C-NMR-Spektrum das Antibiotikums Diffusomycin (Varian XLAA-400)

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, bezeichnet als Dif .'usomycin, auf mikrob ellem Wege unter aeroben Bedingungen, gekennzeichnet dadurch, daß ein Mikroorganismus der Art Streptomyces albus in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 2O⁰C bis 38⁰C über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen kultiviert und das Antibiotikum aus dem Myzel und dem Kulturfiltrat isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Streptomyces albus JA 3453-D eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle Glucose, Stärke bzw. Sojamehl eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation bei 26⁰C über einen Zeitraum von 4 Tagen vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß der eingesetzte Mikroorganismus bsi einem pH-Wert, der zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt, kultiviert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Antibiotikum aus dem Myzel und dem Kulturfiltrat mittels organischer Lösungsmittel gewonnen und durch chromatographische Methoden bis zur Homogenität gereinigt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß das Antibiotikum Dikffusomycin die Bruttoformel C₃₅H₄₉N₃O₉ aufweist und durch ¹³C- und ¹H-NMR-spektrale Daten als Polyenlactam-Struktur charakterisiert ist.