DE19943460A1 - Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel - Google Patents
Neue Lipopeptide und deren Verwendung als ArzneimittelInfo
- Publication number
- DE19943460A1 DE19943460A1 DE19943460A DE19943460A DE19943460A1 DE 19943460 A1 DE19943460 A1 DE 19943460A1 DE 19943460 A DE19943460 A DE 19943460A DE 19943460 A DE19943460 A DE 19943460A DE 19943460 A1 DE19943460 A1 DE 19943460A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- roseoferin
- aib
- val
- mycogone
- rosea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
- A61K36/062—Ascomycota
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Gegenstand der Erfindung ist das Lipopeptid-Gemisch Roseoferin, dessen Komponenten der folgenden allgemeinen Struktur zugeordnet werden können: DOLLAR A R 1 -Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R 2 , DOLLAR A worin R 1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R 2 = 2- (2'-Aminopropyl)-methylaminoFethanol oder 2-(2'-aminopropyl)-amino-ethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo-decansäure bedeutet, und welches dadurch erhältlich ist, daß man den Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie den üblichen Salzen fermentiert, bis sich Roseoferin in der Kulturbrühe anhäuft, und anschließend Roseoferin aus der Kulturbrühe isoliert. Aufgrund der starken antimikrobiellen und zytotoxischen Wirkungen ist Roseoferin als Heilmittel für bakterielle und fungale Infektionskrankheiten bei Mensch, Tier und Pflanze sowie als Kanzerostatikum geeignet.
Description
Die Erfindung betrifft eine Mischung neuer Lipopeptide mit der Bezeichnung Roseoferin,
die von dem Pilz Mycogone rosea DSM 12973 im Verlauf eines Fermentationsprozesses
synthetisiert wird und die sich im Myzel und in der Kulturbrühe anhäuft, ein Herstel
lungsverfahren und die Verwendung von Roseoferin als pharmakologische Wirkstoffe,
insbesondere Arznei- und Pflanzenschutzmittel.
Durch Mikroorganismen werden bekanntermassen zahlreiche Antibiotika produziert, von
denen eine Anzahl als solche oder in chemisch modifizierter Form praktische Anwendung
in der antibakteriellen und antifungalen Chemotherapie, als Krebstherapeutika, als phar
makologische Wirksubstanzen und Pflanzenschutzmittel gefunden hat. Insbesondere
zeichnet sich die Strukturmasse der mikrobiellen Peptidwirkstoffe durch interessante
Anwendungen, wie z. B. als Antibiotika (z. B. Bacitracin, Synergimycine, Echinocandin),
Antitumormittel, Immunmodulatoren (z. B. Cyclosporin A), Insektizide (z. B. Destruxin),
Enzyminhibitoren und Rezeptoragonisten und -antagonisten aus (z. B. Pepstatin; Gräfe,
U.: Biochemie der Antibiotika, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1992; W. Steglich et al.
Römpp Chemie-Lexikon, Naturstoffe 1998). Die für verschiedene Anwendungen vorge
sehenen und eingesetzten Wirkstoffe weisen häufig Nachteile auf, wie z. B. die zu geringe
Wirksamkeit gegenüber pathogenen Zellen, Enzymen und Rezeptoren sowie unerwünsch
te Nebenwirkungen und Bildung von Rückständen (z. B. in landwirtschaftlichen Produk
ten) auf. Ein besonderes im Verlauf der Behandlung mit Antibiotika und Kanzerostatika
auftretendes Problem ist die Entwicklung resistenter Bakterien, Pilze und Tumorzellen.
Aufgrund der geschilderten Nachteile der bisher in Anwendung befindlichen Naturstoffe
und Synthetika besteht weiterhin die Notwendigkeit der Suche nach neuen Strukturen mit
verbesserter und potentiell verbesserter Wirksamkeit.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue mikrobielle Wirkstoffe mit Peptidstruktur und verbes
serten Anwendungseigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass der Pilzstamm Mycogone rosea
DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie den übli
chen Salzen fermentiert wird, bis sich die Mischung bestehend aus neuen Lipopeptiden,
nachfolgend Roseoferin genannt, in der Kulturbrühe anhäuft, anschliessend Roseoferin
als Komplex von 16 eng verwandten homologen und chemisch ähnlichen Verbindungen
aus der Kulturbrühe isoliert, in reiner Form bereitgestellt und gegebenenfalls in chemi
sche Derivate überführt wird.
Roseoferin besitzt starke antibakterielle, antifungale und zytotoxische Wirksamkeit und
kann daher als Heilmittel für bakterielle und pilzliche Infektionskrankheiten von Mensch,
Nutztier und Pflanze sowie als Antitumormittel eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit:
- 1. Roseoferin, enthaltend Lipopeptide, die der folgenden Struktur zugeordnet werden
können:
R1-Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R2,
worin R1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R2 = 2-[(2'-Aminopropyl)-methylamino]ethanol oder 2-(2'-amino propyl)-aminoethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo decansäure bedeutet. - 2. Die Verwendung von Roseoferin als Antibiotika für Human- und Tiertherapie sowie als Pflanzenschutzmittel und Kanzerostatika.
- 3. Verfahren zu dessen Herstellung unter Verwendung des Mikroorganismus Mycogone rosea DSM 12973.
- 4. Arzneimittel enthaltend Roseoferin nebst üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.
Die Erfindung wird nachfolgend in ihren Einzelheiten beschrieben, insbesondere in ihren
bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche
bestimmt.
Definitionen:
- - Die erfindungsgemässen Lipopeptide werden Roseoferine, die Mischung Roseoferin genannt.
- - Das erfindungsgemässe Antibiotikum Roseoferin besteht aus den homologen Kompo nenten (in Klammern deren Molmassen) Roseoferin A1 (1149), A2 (1149) A3 (1149); Roseoferin B1 (1135), B2 (1135), B3 (1135), Roseoferin C1 (1163), C2 (1163), Rose oferin D1 (1121), D2 (1121), D3 (1121); Roseoferin E1 (1107), E2 (1107), E3 (1107), F (1093) und Roseoferin G (1177).
Das erfindungsgemässe, aus 16 homologen Strukturen mit Roseoferin A1 als Hauptkom
ponente bestehende Antibiotikum wird durch Mycogone rosea DSM 12973 produziert.
Mycogone rosea LINK ex. LINK (J. A. von Arx, The genera of fungi sporulating in pure
culture, Ganthner Verlag KG, Vaduz, 1981) ist als Mykoparasit auf Basidiomyceten-
Fruchtkörpern im europäischen Raum weit verbreitet. Der Stamm Mycogone rosea DSM
12973 ist durch folgende morphologische Merkmale charakterisiert:
- - Myzel reich septiert, an den Septen mitunter schwach angeschwollen, Hyphen 5-7 µm im Durchmesser, hyalin.
- - Aleuriokonidien (Chlamydosporen) 24-29 µm im Durchmesser, rund, Wände bis 5 µm dick, Oberfläche warzig, Warzen bis zu 1 µm lang.
Reinkulturen lassen sich von befallenen Fruchtkörpern direkt isolieren, ggf. durch Ab
schwemmen, evtl. zum Beispiel Anlagen von Verdünnungsreihen, Ausplatten und Bebrü
ten auf ausgewählten Nährmedien.
Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten wurde von Mycogone rosea eine
Pilzkolonie isoliert, die das aus 16 Homologen bestehende Peptidantibiotikum Roseoferin
besonders effizient in der Kulturbrühe anhäuft. Ein Isolat von Mycogone rosea DSM
12973 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig,
Deutschland, am 10. 8. 1999 gemäss den Bedingungen des Budapester Vertrages hinter
legt.
Der Stamm bildet Luftmyzel und Chlamydosporen auf Malz-Agar. Die Koloniefarbe ist
rot bis braunrot. Das Myzel ist reich septiert, an den Septen mitunter schwach ange
schwollen. Der Hyphendurchmesser beträgt 5-7 µm. Die Basalzellen sind 7-12 µm
lang und 10-12 µm breit; die Terminalzellen 16-20 µm lang und 10-13 µm breit; reife
Makrokonidien weisen 24-29 µm Gesamtlänge auf. Die Hyphenwände sind bis 5 µm
dick, die Oberfläche ist mit bis zu 1 µm langen Warzen versehen. Die Bildung einzelliger
Phialokonidien an verticillat verzweigten Konidienträgern wurde nicht beobachtet. (Arx,
J. A. von 1981. The Genera of Fungi, Sporulating in Pure Culture, S. 337-339, A. L.
Ganthner-Verlag, FL-9490 Vaduz/Liechtenstein).
In einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den üblichen
Mineralsalzen produziert Mycogone rosea, bevorzugt Mycogone rosea DSM 12973, das
erfindungsgemässe Roseoferin. Anstelle des Stammes Mycogone rosea DSM 12973 kön
nen auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten
gelten alle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemä
ssen Verbindungen zu synthetisieren.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, bei
spielsweise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutage
ne erzeugt werden. Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemä
sse Verbindung synthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in
der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibioti
schen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methoden
durchgeführt werden.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare
Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z. B. Maltose, Cellobiose, Glucose, Lactose,
Glycerol, Mannitol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie
Malzextrakt.
Als Stickstoffquellen eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Ab
bauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, bei
spielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillations
produkte der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoni
umsalze und Nitrate.
Die Bildung der Roseoferine erfolgt gut in Nährmedien, die 0,2-6% Malzextrakt, be
vorzugt 2-4% Malzextrakt und 0,01-1% Hefeextrakt, bevorzugt 0,1-0,4% Hefeex
trakt enthalten. Alternativ können auch Nährmedien mit anorganischer Stickstoffquelle
gewählt werden, die 0,5-6% Maltose oder Glucose, bevorzugt 2-4%, und 0,1-0,6%
(NH4)2SO4, bevorzugt 0,2-0,4% (NH4)2SO4, und Spurenelemente (Mg, Zn) enthalten.
Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in
Schüttelkolben oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen. Die Fermen
tation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschie
dener Volumina durchgeführt werden. Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen
10-37°C, besonders bevorzugt 20-25°C, durchgeführt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und
7, bevorzugt zwischen 5,5 und 6,5. Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen
5-21 Tage, bevorzugt 7-18 Tage, kultiviert.
Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 250 ml),
aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m3), durchgeführt werden.
Vorteilhafterweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. zunächst werden eine oder
mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigent
liche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1 : 15 - 1 : 20,
überimpft werden.
Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z. B. Malzagar-
Nährböden in eine Nährlösung überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzel
bewachsenen Agarstücken, und diese 11-21 Tage, vorzugsweise 15-18 Tage, inkubiert.
Das versporte Myzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa
11-21 Tage, bevorzugt 15-18 Tage, auf einem Nährboden, wie z. B. Malz-Agar, Kartof
fel-Glucose-Agar oder Sojamehl-Glucose-Agar, wachsen lässt.
Das Peptidantibiotikum Roseoferin ist in Form des Gemisches der Homologen Roseofe
rin A1, A2, A3; Roseoferin B1, B2, B3; Roseoferin C1, C2; Roseoferin D1, D2, D3; Rose
oferin E1, E2, E3; Roseoferin F und Roseoferin G in der Kulturbrühe, vorzugsweise im
Myzel, enthalten. Roseoferin A1 wird als Hauptprodukt gebildet.
Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolie
rungsstufen ist die Fähigkeit der Roseoferine zur Ionenpaarbildung mit wasserlöslichen
Anionen (z. B. Helianthat) gut geeignet (Stengel, C. et al., J. Basic Microbiol. 32, 339-
345, 1992); ferner können die üblichen dem Fachmann vertrauten Methoden der biologi
schen Aktivitätsbestimmung, z. B. der Agarplatten-Diffusionstest unter Verwendung von
Sporobolomyces salmonicolor und Candida spec. oder die Dünnschichtchromatographie,
beispielsweise an Kieselgel RP18 mit Methanol/Tetrahydrofuran-Mischungen in gesättig
ter Ammoniak-Atmosphäre als Laufmittel, verwendet werden.
Die Detektion nach dünnschichtchromatographischer Aufreinigung (rf 0,6 des Roseofe
rin-Komplexes bei Verwendung eines Laufmittelgemisches Methanol/Tetrahydrofuran
99 : 1 in gesättigter Ammoniak-Atmosphäre) kann durch Iod-Dampf oder durch Färbe
agentien, z. B. Vanillin/H2SO4 (konz.), erfolgen.
Die Isolierung der Roseoferine aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden
unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften
der Produkte.
Zur Isolierung von Roseoferin werden am Ende der emersen Fermentation im Labor
maßstab wasserunlösliche organische Lösemittel, wie z. B. Ethylacetat, zur Kulturlösung
zugesetzt und somit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung von Roseoferin
aus submersen Kulturansätzen werden am Ende der Fermentation Kulturmedium und
Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösemitteln, wie Methanol oder Ethylace
tat, vorzugsweise Ethylacetat, extrahiert. Weitere Mengen an Roseoferin werden durch
Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kulturlösung mit wasserunlöslichen organischen
Lösemitteln, wie z. B. Ethylacetat, gewonnen.
Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des Methanolextraktes des
Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Essigsäureethyle
ster, Dichlormethan oder Chloroform erfolgt die Isolierung des Peptidantibiotikums Ro
seoferin unter Einsatz üblicher chromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermateriali
en, wie z. B. Kieselgel oder organophile Dextrangele.
Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelper
meations-Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren
organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kie
selgel RP18 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Triethylamin-Gemischen sowie
der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Anwendung von Metha
nol/Tetrahydrofuran-Gemischen, ferner Ausfällung aus Chloroform oder Dichlormethan
mittels n-Hexan bzw. Petrolether werden schliesslich die reinen Roseoferine erhalten.
Es wird schliesslich reines Roseoferin als Homologengemisch der allgemeinen Formel 1
und der in Tabelle 1 aufgeführten strukturellen Zusammensetzung mit Roseoferin A1 als
Hauptkomponente erhalten.
Die chemische Identität der Homologen des Lipopeptidantibiotikums Roseoferin entspre
chend der in Formel 1 aufgeführten allgemeinen und in Tabelle 1 spezifizierten Struktu
ren wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Elektrospray-Ionisations-Sektorfeld
analysator-Massenspektrometrie, Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (ESI-CID-
MS/MS) und Elektrospray-Ionisations-Ionenfallenanalysator-Massenspektrometrie (MSn)
bewiesen.
Die antibakteriellen und antifungalen Wirkungen der Roseoferine können durch die dem
Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise die Bestimmung der minimalen
Hemmzonenkonzentration (MHK) im Agarplattendiffusionstest aufgezeigt werden.
Die Fähigkeit zur Ionenpaarbildung mit Anionen (z. B. Helianthat) wird durch Anwen
dung bereits bekannter Testverfahren (Stengel, C. et al., J. Basic Microbiol. 32, 339-345,
1992) nachgewiesen.
Roseoferin ist gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Organismen, wie z. B.
Micrococcus luteus ATCC 10240, Mycobacterium smegmatis SG 987, Mycobacterium
aurum SB 66, Mycobacterium vaccae IMET 10670 und andere, wirksam. Die antibakte
riellen, minimalen Hemmkonzentrationen liegen in einem Bereich < 3.1 µg/ml. Starke
Wirksamkeit besteht ferner gegen Pilze, wie z. B. Penicillium notatum JP 36, Sporobo
lomyces salmonicolor SBUG 549 und andere (Tab. 2). Eine fungizide Wirkung kann
ebenfalls durch in vitro Test, in denen die Hemmung des Wachstums verschiedener Pilze
und Hefen bestimmt wird, gezeigt werden. Beispielsweise inhibieren die Roseoferine in
einer minimalen Konzentration von 1,56 µg/ml das Wachstum von Candida albicans-
Stämmen.
Das erfindungsgemässe Lipopeptid Roseoferin eignet sich aufgrund seiner wertvollen an
tibakteriellen und antifungalen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als antimikrobiell
wirksames Therapeutikum.
Das erfindungsgemässe Roseoferin kann als solches in Substanz oder in Verbindung mit
geeigneten Hilfsmitteln oder Trägermaterial verabreicht werden.
Die erfindungsgemässen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appli
ziert, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder
flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten,
Dragees.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiele näher erläutert.
- 1. Zur Gewinnung eines versporten Mycels wird Mycogone rosea DSM 12973 15 Tage
bei 25°C auf Nährböden folgender Zusammensetzung (g/) kultiviert:
Malzextrakt 40, Hefeextrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6,0 (Sterilisation 25 min. bei 110°C). - 2. Herstellung von emersen Standkulturen:
1-2 cm2 Areale von Oberflächenkulturen von Mycogone rosea DSM 12973, die auf Ag armedien entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden, dienen zur Beimpfung von 1-l- Erlenmeyerkolben mit 250 ml Malznährmedium folgender Zusammensetzung (g/l): Malz extrakt 20; Glucose 10; Hefeextrakt 2; (NH4)2HP04 0,5; Agar 4. Die Kultivierung er folgt 18-21 Tage bei 25°C als Oberflächenkultur.
- 1. Das Impfmaterial wird wie unter 1a) beschrieben hergestellt.
- 2. Herstellung von Submerskulturen:
1-2 cm2 Areale von Oberflächenkulturen von Mycogone rosea DSM 12973, die auf Ag armedien entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden, dienen zur Beimpfung von 1-l- Erlenmeyerkolben mit Schikanen und 250 ml Nährmedium Wb6-1/14 folgender Zusam mensetzung (g/l): Maltose30; Glucose 10; (NH4)2SO4 3,5; K2HPO4 2; MgSO4 × 7H2O 0,5; CaCO3 5,1; ZnSO4 × 7H2O 0,008; Agar 4.
Die Kultivierung erfolgt bei 25°C und 110 U/min für 7-12 Tage.
Das nach 18 Tagen bei 25°C in Standkultur auf Malz-Medium (120 l) bzw. nach 7 Tagen
bei 25°C in Submerskultur auf Wb 6-1/14 (Frequenz des Schüttlers 110 U/min) gebilde
te Myzel wird durch Filtration von dem Nährmedium abgetrennt und mit einer der Hälfte
des Ausgangsvolumens des Ansatzes entsprechenden Menge Ethylacetat unter Rühren bei
Raumtemperatur für 16 Stunden extrahiert. Eine Steigerung der Ausbeute wird durch er
neute Extraktion des Myzels mit Ethylacetat erreicht. Durch Extraktion der Kulturbrühe
mit dem Aliquot an Ethylacetat kann eine weitere Erhöhung der Ausbeute erzielt werden.
Nach Abtrennung des Myzels wird der Ethylacetat-Extrakt am Vakuumrotationsverdamp
fer bis zur Trockene eingeengt, der Rückstand wird in Methanol aufgenommen und die
Verunreinigungen aus der methanolischen Lösung bei einer Temperatur von -15°C für
48 Stunden ausgefällt. Nach Abtrennung des Überstandes wird das Filtrat am Vakuumro
tationsverdampfer zur Trockenheit eingeengt. Eine weitere Aufreinigung wird durch er
neutes Lösen des Rückstandes und Wiederholung der Fällung erreicht. Nach Konzentrati
on des Methanolextraktes im Vakuum wird der trockene Rückstand zunächst mit n-Hexan
bzw. Petrolether gewaschen und nach Abtrennung des Lösemittels mit destilliertem Was
ser. Nach vollständiger Entfernung des destillierten Wassers im Vakuum wird der trockene
Rückstand in Dichlormethan bzw. Chloroform gelöst und das Roseoferin mit dem
20fachen Überschuß an n-Hexan bzw. Petrolether, vorzugsweise n-Hexan, bei einer Tem
peratur von 4°C ausgefällt. Der Rückstand der Fällung wird nach Abtrennung des Über
standes in Methanol aufgenommen. Ausbeute: 860 mg
Roseoferin wird als Gemisch von 16 Homologen, bestehend in der Hauptsache aus Rose
oferin A1 sowie wechselnden Anteilen der anderen in Tabelle 1 aufgeführten Roseoferi
ne, aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 120 l Fermentationsbrühe durch die
nachfolgenden chromatographischen Aufarbeitungsschritte erhalten:
Zunächst wird der Rückstand der Fällung in Methanol gelöst und auf eine Chromatogra phiesäule, gefüllt mit Dextrangelen, wie z. B. Sephadex LH-20, in Methanol, gegeben. Mit dem gleichen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, da nach eluiert man die Hauptmenge an Roseoferin sowie nachfolgend niedermolekulare Verunreinigungen. Ausbeute: 425 mg. In einer zweiten säulenchromatographischen Rei nigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel G 60 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Triethylamin (70 : 27 : 3 bzw. 60 : 37 : 3) als Eluent. Ausbeute: 60 mg. Nach Konzentration des Eluentengemischs am Vakuumrotationsverdampfer wird der Rückstand mit Wasser versetzt und bis zur vollständigen Entfernung des Triethylamins gefriergetrocknet. Der lyophilisierte Rückstand wird in Chloroform oder Dichlormethan aufgenommen und der Roseoferin-Komplex durch präparative Dünnschichtchromatogra phie unter Verwendung geeigneter Laufmittel-Systeme, beispielweise eines Gemisches aus Methanol/Tetrahydrofuran = 99 : 1 in gesättigter Ammoniak-Atmosphäre (rf-Wert 0,6), aufgereinigt. Beispielsweise beträgt die Ausbeute der Aufarbeitung eines 120-1- Fermentationsansatzes für Roseoferin ca. 40 mg.
Zunächst wird der Rückstand der Fällung in Methanol gelöst und auf eine Chromatogra phiesäule, gefüllt mit Dextrangelen, wie z. B. Sephadex LH-20, in Methanol, gegeben. Mit dem gleichen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, da nach eluiert man die Hauptmenge an Roseoferin sowie nachfolgend niedermolekulare Verunreinigungen. Ausbeute: 425 mg. In einer zweiten säulenchromatographischen Rei nigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel G 60 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Triethylamin (70 : 27 : 3 bzw. 60 : 37 : 3) als Eluent. Ausbeute: 60 mg. Nach Konzentration des Eluentengemischs am Vakuumrotationsverdampfer wird der Rückstand mit Wasser versetzt und bis zur vollständigen Entfernung des Triethylamins gefriergetrocknet. Der lyophilisierte Rückstand wird in Chloroform oder Dichlormethan aufgenommen und der Roseoferin-Komplex durch präparative Dünnschichtchromatogra phie unter Verwendung geeigneter Laufmittel-Systeme, beispielweise eines Gemisches aus Methanol/Tetrahydrofuran = 99 : 1 in gesättigter Ammoniak-Atmosphäre (rf-Wert 0,6), aufgereinigt. Beispielsweise beträgt die Ausbeute der Aufarbeitung eines 120-1- Fermentationsansatzes für Roseoferin ca. 40 mg.
Physikalisch-chemische und mikrobiologische Eigenschaften des Roseoferinkomplexes
(siehe auch Tabelle 1):
Aussehen: farblose semikristalline Substanz
Massenspektrum ([M+H]+): m/z 1094; m/z 1108; m/z 1122; m/z 1136; m/z 1150; m/z 1164; m/z 1178
Aussehen: farblose semikristalline Substanz
Massenspektrum ([M+H]+): m/z 1094; m/z 1108; m/z 1122; m/z 1136; m/z 1150; m/z 1164; m/z 1178
Testorganismus | ||
MHK-Werte (µg/µl) | ||
Micrococcus luteus ATCC 10240 | 3,11 | |
Enterococcus faecalis 1528 | 12,51 | |
Mycobacterium smegmatis SG 987 | 6,21 | |
Mycobacterium aurum SB 66 | 6,21 | |
Mycobacterium vaccae IMET 10670 | 3,11 | |
Mycobacterium fortuitum B | 25,01 | |
Mycobacterium cheloni B | 50,01 | |
Candida albicans BMSY 212 | 1,52 | |
Sporobolomyces salmonicolor SBUG 549 | 0,43 | |
Penicillium notatuum JP 36 | 0,43 | |
1) Anonymous: European Pharmacopoia 3rd Ed., Deutscher Apothekerverlag Stuttgart, pp. 113~118, 1997@ | 2) National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard M7-A. NCCLS, Villanova, Pa., 1991@ | 3) National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of yeasts. M27-P. NCCLS. Volume 12, 25 NCCLS, Villanova, Pa., 1991@@ |
Die zytotoxische und antiproliferative Wirksamkeit des Roseoferins wurde nach
WINKELMEIER, GLANNER und LINDL (Quantification of cytotoxicity by cell volu
me and cell proliferation. ATLA 21: 269~280, 1993) ermittelt.
L-929 Maus-Fibroblastenzellinie: IC50 : 0.4 µg/ml,
K 562 humane Leukämie: IC50: 0.08 µg/ml,
HeLa humanes Zervikal-Karzinom: IC50: 3.3 µg/ml.
L-929 Maus-Fibroblastenzellinie: IC50 : 0.4 µg/ml,
K 562 humane Leukämie: IC50: 0.08 µg/ml,
HeLa humanes Zervikal-Karzinom: IC50: 3.3 µg/ml.
Claims (3)
1. Lipopeptid-Gemisch Roseoferin, dessen Komponenten der folgenden allgemeinen
Struktur zugeordnet werden können:
R1-Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R2,
worin R1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R2 = 2-[(2'-Aminopropyl)-methylamino]ethanol oder 2-(2'-aminopropyl)- amino-ethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo-decansäure bedeutet, und welches dadurch erhältlich ist, daß man den Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie den üblichen Salzen fermentiert, bis sich Roseoferin in der Kulturbrühe anhäuft, und anschliessend Roseoferin aus der Kulturbrühe isoliert.
R1-Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R2,
worin R1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R2 = 2-[(2'-Aminopropyl)-methylamino]ethanol oder 2-(2'-aminopropyl)- amino-ethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo-decansäure bedeutet, und welches dadurch erhältlich ist, daß man den Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie den üblichen Salzen fermentiert, bis sich Roseoferin in der Kulturbrühe anhäuft, und anschliessend Roseoferin aus der Kulturbrühe isoliert.
2. Verwendung von Roseoferin gemäß Anspruch 1 zur die Behandlung von
Infektionskrankheiten.
3. Arzneimittel enthaltend Roseoferin gemäß Anspruch 1 nebst üblichen pharmazeu
tischen Hilfs- und Trägerstoffen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19943460A DE19943460A1 (de) | 1999-09-11 | 1999-09-11 | Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19943460A DE19943460A1 (de) | 1999-09-11 | 1999-09-11 | Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19943460A1 true DE19943460A1 (de) | 2001-03-15 |
Family
ID=7921590
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19943460A Withdrawn DE19943460A1 (de) | 1999-09-11 | 1999-09-11 | Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19943460A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110499277A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法 |
CN111500760A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用 |
CN111549166B (zh) * | 2020-05-09 | 2022-05-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用 |
-
1999
- 1999-09-11 DE DE19943460A patent/DE19943460A1/de not_active Withdrawn
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110499277A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法 |
CN110499277B (zh) * | 2019-08-30 | 2021-04-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法 |
CN111500760A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用 |
CN111549166B (zh) * | 2020-05-09 | 2022-05-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用 |
CN111500760B (zh) * | 2020-05-09 | 2022-05-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0864584B1 (de) | Lipopeptide aus Actinoplanes sp. mit pharmakologischer Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung derselben | |
DE2463138C2 (de) | Das Antibiotikum Cyclosporin B (S 7481/F-2), seine Herstellung und Verwendung | |
EP0916680B1 (de) | Lantibiotikum verwandt mit Actagardine, Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben | |
DE3521436C2 (de) | ||
DE19943460A1 (de) | Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel | |
EP0829487B1 (de) | Neue Polyenantibiotika 3874 H1 bis H6, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung | |
DD252116A5 (de) | Verfahren zur bekaempfung von pflanzennematoden | |
DE69913369T2 (de) | Mikrobielle transformationsprodukte | |
DE19740030A1 (de) | Ampullosporin, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung | |
EP0848064B1 (de) | Neues Antibiotikum, Feglymycin, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung | |
DE19948644A1 (de) | Neue Peptaibole mit neuroleptischer Wirkung | |
EP0472186B1 (de) | Antibiotika AB-023 und deren Herstellung | |
DD298276A5 (de) | Verfahren zur herstellung von cyclosporin a | |
EP0026485B1 (de) | Herbicolin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende Mittel | |
EP1740566B1 (de) | Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung | |
DE4305249A1 (de) | Galaktosylbrefeldin A, ein neuer Metabolit mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
DE10238697A1 (de) | Neue Peptaibole mit neuroleptischer Wirkung | |
DE4415345A1 (de) | Helioferine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
DE10065606A1 (de) | Altamiramycin, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung | |
CH589716A5 (en) | Antibiotics S 7481-F-1 and 2 - prepd. from new strains of Cylindrocarbon or Trichoderma esp. useful as immunosuppressant | |
EP0272668A1 (de) | Amycin und dessen Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung | |
EP1940848A1 (de) | Antimitotische rhizoxin-derivate aus burkholderia rhizoxina, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung | |
CH603790A5 (en) | Antibiotics S 7481-F-1 and 2 | |
DE4305351A1 (de) | Aurantimycin, Peptidantibiotikum aus Streptomyces aurantiacus, und chemische Derivate mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben | |
GB2306480A (en) | Antifungal agents |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |