DE4305351A1 - Aurantimycin, Peptidantibiotikum aus Streptomyces aurantiacus, und chemische Derivate mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben - Google Patents

Aurantimycin, Peptidantibiotikum aus Streptomyces aurantiacus, und chemische Derivate mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben

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Cornelia Dr Stengel
Rolf Dr Stengel
Werner Friedrich Dr Fleck
Klausjuergen Dr Dornberger
Wolfgang Dr Ihn
Wolfgang Dr Schade
Udo Prof Dr Graefe
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    • C07K4/04—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

Die Erfindung betrifft das Peptidantibiotikum Aurantimycin, welches von dem Pilz Streptomyces aurantiacus während der Fermentation synthetisiert wird und sich in der Kulturbrühe anhäuft, sowie die auf der Basis von Aurantimycin hergestellten chemischen Derivate, ein Herstellungsverfahren und die Verwendung von Aurantimycin und Aurantimycinderivaten als pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere als Arzneimittel.
Antibiotika mit den verschiedenartigsten chemischen Strukturen lassen sich mit Hilfe von Mikroorganismen herstellen. So beschreibt die deutsche Patentanmeldung P 41 34 168.6 die zur Gruppe der Oligoether-Antibiotika zugehörenden Pamamycine 607 und 621 und deren Herstellung unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces aurantiacus.
Antibiotika aus anderen chemischen Strukturklassen, z. B. Peptidwirkstoffe werden in verschiedenen Strukturvarianten durch pro- und eukaryotische Mikroorganismen gebildet und zeichnen sich durch eine Vielzahl interessanter biologischer Wirkungen aus (z. B. antimikrobielle Aktivitäten, kanzerostatische, kardiotone, immunmodulatorische Wirkungen, Wachstumsförderer für Nutztiere, Insektizide u. a.m., siehe z. B. Gräfe, U., Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J. Antibiot., 44, 263-270, 1991; M. Kaneda, J. Antibiot., 44, 792-796, 1991).
Neben der klassischen Anwendung von Peptidwirkstoffen in der Behandlung von Infektionskrankheiten und dem Einsatz als Antibiotika in der Erhaltung der Tiergesundheit und im Pflanzenschutz (z. B. als Antiparasitika) wurde in den letzten Jahren gezeigt, daß Peptidwirkstoffe mit einer Vielzahl pharmakologisch interessanter Makromoleküle wie Rezeptoren oder Enzyme von Signalketten interagieren und antagonistische bzw. inhibitorische Wirkungen hervorrufen (S. Miyata et al., J. Antibiot. 45, 74-82, 1992; Kamiyama et al., J. Antibiot. 45, 424-427, 1992; Weber et al., J. Antibiot., 44, 164-171, 1991).
Die eingesetzten Wirkstoffe sind allerdings häufig mit Mängeln behaftet, gekennzeichnet durch unbefriedigende Wirkhöhen, eine zu hohe Toxizität und/oder unerwünschte Nebenwirkungen.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue mikrobielle Wirkstoffe mit verbesserten Eigenschaften und neuen Wirkmechanismen zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem man Streptomyces aurantiacus in einem Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie den üblichen anorganischen Salzen fermentiert bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft, anschließend Aurantimycin aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls chemische Derivate von Aurantimycin herstellt. Das Peptidantibiotikum Aurantimycin und seine chemischen Derivate besitzen pharmakologische Wirksamkeit und können insbesondere als Arzneimittel mit antibakteriellen und/oder nematoziden Wirkungen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit:
  • 1. Eine Verbindung der Summenformel C38H64N8O14, erhältlich aus Streptomyces aurantiacus IMET4391 7 durch
    • - Kultivierung von Streptomyces aurantiacus IMET43917 für 1-10 Tage bei 15-37°C in einem Nährmedium, das 0,2-5% Sojamehl und 0,2-5% Glukose enthält und einen pH-Wert zwischen 5 und 9,5 aufweist, bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft, und
    • - Isolierung von Aurantimycin durch nachfolgende Separation von Pilzmyzel und Kulturmedium durch Filtration, Extraktion des Pilzmyzels mit Methanol und chromatographischer Auftrennung des Extraktes.
  • 2. Chemische Derivate, abgeleitet aus einer Verbindung der Summenformel C38H64N8O14, erhältlich aus Streptomyces aurantiacus IMET43917 durch
    • - Kultivierung von Streptomyces aurantiacus IMET43917 für 1-10 Tage bei 15-37°C in einem Nährmedium, das 0,2-5% Sojamehl und 0,2-5% Glukose enthält und einen pH-Wert zwischen 5 und 9,5 aufweist, bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft, und
    • - Isolierung von Aurantimycin durch nachfolgende Separation von Pilzmyzel und Kulturmedium durch Filtration, Extraktion des Pilzmyzels mit Methanol und chromatographischer Auftrennung des Extraktes,
    • - Überführung des Peptidantibiotikums Aurantimycin in chemische Derivate durch Hydrierung von Doppelbindungen, Veresterungen von Alkohol- oder Säuregruppen, Alkylierung von Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatomen oder Acetylierung von Alkohol- oder Aminogruppen.
  • 3. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Summenformel C38H64N8O14, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces aurantiacus in einem Nährmedium kultiviert bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft und man nachfolgend Aurantimycin aus der Kulturbrühe isoliert.
  • 4. Eine Verwendung der Verbindung mit der Summenformel C38H64N8O14 und daraus abgeleiteter chemischer Derivate als pharmakologisch wirksamen Stoff, insbesondere als antibakteriellen und/oder nematoziden Wirkstoff.
Die Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.
Definitionen:
  • - Die erfindungsgemäße Verbindung wird Aurantimycin genannt.
  • - Als Kulturbrühe wird das Nährmedium, welches das darin gewachsene Pilzmyzel enthält, bezeichnet.
  • - Nichtproteinogene Aminosäuren sind Aminosäuren, die nicht zu den 20, natürlicherweise in Proteinen vorkommenden Aminosäuren gehören (L. Stryer, Biochemistry).
Die erfindungsgemäße Verbindung Aurantimycin wird durch Streptomyces aurantiacus, vorzugsweise Streptomyces aurantiacus IMET43917, produziert.
Streptomyces aurantiacus wurde erstmalig 1891 beschrieben (Int. J. Syst. Bacteriol., Vol. 19, 391-512).
In verschiedenen Stammsammlungen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, American Type Culture Collection) sind Streptomyces aurantiacus-Stämme verfügbar. Kulturen von Streptomyces aurantiacus, die die erfindungsgemäße Verbindung Aurantimycin produzieren, erhält man, indem man Streptomyces aurantiacus vorzugsweise unter Streßbedingungen kultiviert.
Streßbedingung sind z. B.
  • - Kultivierung in flüssigen Nährmedium unter Schütteln
  • - Kultivierung unter Bestrahlung mit energiereicher Strahlung, z. B. Ultraviolettstrahlung
  • - Kultivierung in Nährmedien mit unterschiedlicher Zusammensetzung.
Nach der Kultivierung unter Streßbedingungen erfolgt die Isolierung einzelner Pilzkolonien.
Reinkulturen von Pilzkulturen lassen sich durch dem Fachmann vertrauten Methoden durch Anlegung von Verdünnungsreihen, Ausplattieren und Bebrüten auf Nähragarmedien isolieren.
Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten kann man von Streptomyces aurantiacus eine Pilzkolonie isolieren, die das Peptidantibiotikum Aurantimycin sehr effizient in der Kulturbrühe anhäuft.
Die stark produzierende Pilzkolonie wird vermehrt. Ein Isolat von Streptomyces aurantiacus IMET43917 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Außenstelle Jena, Beutenbergstraße 11, O-6900 Jena am 11.09.1989 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Der Stamm bildet Luftmyzel und Sporen auf Sojamehl-Mannit-Agar. Die Koloniefarbe ist graugelb bis rötlich, wobei jedoch keine Melanine gebildet werden. Es werden kurze Sporenketten, spiralig oder in offenen Haken und Schleifen gebildet. Die Sporenoberfläche ist glatt.
In einem Nährmedium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den üblichen Mineralsalzen produziert Streptomyces aurantiacus, bevorzugt Streptomyces aurantiacus IMET43917, die erfindungsgemäße Verbindung Aurantimycin. Anstelle des Stammes Streptomyces aurantiacus IMET43917 können natürlich auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden.
Als Mutanten und Varianten gelten all jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäße Verbindung zu synthetisieren.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemischen Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2- Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguanidin (MMNG) erzeugt werden.
Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäße Verbindung synthetisieren kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibiotischen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z. B. Glukose, Laktose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte wie Malzextrakt.
Als Stickstoffquelle eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Die Bildung des Peptidantibiotikums erfolgt besonders gut in Nährmedien, die 0,2-5% Sojamehl, bevorzugt 1-4% Sojamehl und 0,2-5% Glukose, bevorzugt 1-4% Glukose enthalten.
Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff.
Die Fermentation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen oder Rundkolben verschiedener Volumina, in Glasfermentern oder V2A-Stahltanks durchgeführt werden.
Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 15-37°C, bevorzugt zwischen 23-37°C, besonders bevorzugt zwischen 27-30°C durchgeführt.
Der pH-Wert liegt zwischen 5 und 9,5, bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5.
Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 1-10 Tage, bevorzugt 2-6 Tage, kultiviert.
Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 200 l), aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m3) durchgeführt werden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst ein oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1 : 5, überimpft werden.
Die Vorkultur erhält man, indem man Myzelfragmente, die in 2,5-7,5%iger, bevorzugt 5%iger Glukose-Gelatinelösung lyophil getrocknet wurden, in eine Nährlösung überführt und 1-10 Tage, bevorzugt 2-6 Tage inkubiert.
Das versporte Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 3-40 Tage, bevorzugt 4-10 Tage auf einen Nährboden, z. B. Hefe-Malz-Agar oder Sojamehl-Glukose-Agar wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf und die Bildung des Aurantimycins kann entsprechend dem Fachmann bekannten Methoden wie z. B. durch Austesten der biologischen Aktivität gegenüber Testorganismen oder durch chromatographische Methoden wie Dünnschichtchromatographie (DC) oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verfolgt werden.
Das Peptidantibiotikum Aurantimycin ist in der Kulturbrühe, vorzugsweise im Mycel, enthalten.
Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen kann die Dünnschichtchromatographie, beispielsweise an Kieselgel mit Chloroform/Methanol-Mischungen als Laufmittel verwendet werden.
Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise durch Färbereagentien wie 2% Vanillin in konz. Schwefelsäure erfolgen.
Die Isolierung des Aurantimycins aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte.
Zur Isolierung des Aurantimycin werden am Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol extrahiert.
Nach Einengen des Extraktes und Reextraktion des Extraktes mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Chloroform erfolgt die Isolierung des Peptidantibiotikums unter Einsatz üblicher chromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien wie z. B. Kieselgele oder organophile Dextrangele.
Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelchromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lösungsmittel wie z. B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kieselgel RP-18 unter Verwendung von Methanol/Wasser bzw. Acetonitril/Wasser-Gemischen sowie durch Umkristallisieren aus Methanol mit geringen Wasseranteilen wird schließlich Aurantimycin erhalten.
Die chemische Identität des Peptidantibiotikums Aurantimycins wird durch chemischen Abbau und Analyse der gebildeten Aminosäuren, durch hochauflösende Massenspektrometrie (EI-MS, FAB-MS) und durch hochauflösende 500 MHz-Protonen und 125 MHz-13C-NMR-Spektroskopie, bestimmt (siehe Bsp. 5).
Das von Streptomyces aurantiacus und insbesondere von Streptomyces aurantiacus IMET43917 synthetisierte, dann teilisolierte oder isolierte Aurantimycin kann für chemische Modifikationen eingesetzt werden. Modifikationen erfolgen gemäß dem in der Fachliteratur beschriebenen und dem Fachmann bekannten Verfahren. Diese Verfahren sind z. B.
  • - Hydrierung von Doppelbindungen zwischen Kohlenstoffatomen, Stickstoffatomen, aber auch zwischen Kohlenstoff- und Stickstoffatomen oder Kohlenstoff- und Sauerstoffatomen, beispielsweise durch katalytische Hydrierung;
  • - Veresterungen von Alkohol- und Säuregruppen, bevorzugt zur Herstellung von Alkylestern mit einer Kettenlänge von 1 bis 5, besonders bevorzugt zur Herstellung von Dimethylestern;
  • - Alkylierung von Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatomen, bevorzugt zur Bildung von Alkylgruppen mit einer Kettenlänge von 1 bis 5;
  • - Acylierung von Alkohol- oder Aminogruppen zu Säureestern bzw. Säureamiden, bevorzugt mit Acylverbindungen einer Kettenlänge von 1 bis 5.
Eine antibakterielle Wirkung kann durch dem Fachmann bekannte Methoden wie beispielsweise Hemmhoftests oder Plattendiffusionstests in vitro gezeigt werden.
Das Antibiotikum Aurantimycin ist gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Bakterien, wie z. B. Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus flavus, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes wirksam.
Die minimalen Hemmkonzentrationen liegen in einem Bereich von < 0,001 bis < 0,1 µg/ml.
Eine nematozide Wirkung kann ebenfalls durch in vitro Tests, in denen die Vermehrung und Beweglichkeit der Nematoden bestimmt wird, gezeigt werden. Aurantimycin inhibiert in einer Konzentration von 100 ppm sowohl die Vermehrung als auch die Beweglichkeit von Caenorhabditis elegans.
Die erfindungsgemäße Verbindung Aurantimycin und daraus abgeleitete chemische Derivate eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als Arzneimittel.
Die erfindungsgemäße Verbindung und daraus abgeleitete Derivate können grundsätzlich als solche in Substanz verabreicht werden. Bevorzugt ist die Verwendung in Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen oder Trägermaterial. Als Trägermaterial können bei Tierarzneimitteln die üblichen Futtermittelmischungen bzw. beim Menschen alle pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.
Die Anwendung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen der erfindungsgemäßen Verbindung und der daraus abgeleiteten chemischen Derivate.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.
Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung oder daraus abgeleiteter chemischer Derivate enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 200 mg, bevorzugt jedoch etwa 0,1 bis 100 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 200 mg, vorzugsweise aber etwa 0,5 bis 100 mg, pro Tag betragen.
Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man die erfindungsgemäße Verbindung oder daraus abgeleitete chemische Derivate mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
  • 1. a) Herstellung von Vorkulturen des Stammes Streptomyces aurantiacus IMET43917
    Schrägagareprouvetten des Stammes Streptomyces aurantiacus IMET43917 dienen zur Beimpfung eines Vorzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l) in 500 ml Steibrustflaschen (80 ml Inhalt, 28°C; Rotationsschüttler; 48 Stunden Kultivierungszeit): Glukose 15; Sojamehl 15; CaCO3 1; NaCl 5; KH2PO4; pH 6.5.
    Die zweite Vorzucht wird auf dem gleichen Vorzuchtmedium in 5 l- Flaschen mit 400 ml Inhalt durchgeführt (48 Stunden, 28°C, Rotationsschüttler 100 u.p.m.).
  • b) Anlage von Fermenterkulturen des Stammes Streptomyces aurantiacus IMET43917
    150 l Fermenter werden mit 20 l Vorkulturen angeimpft. Für die Vorkultur und den Fermenter wird ein Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet (g/l): Sojamehl 20; Glucose 20; NaCl 5; CaCO3 3.
    Die Fermentation wird in 150 l-Tankfermentoren für 5 Tage bei 28°C durchgeführt.
  • 2. Herstellung und Aufreinigung des Peptidantibiotikums Aurantimycin
    Das nach 5 Tagen bei 28°C in 150 l Fermentern gebildete Myzel wird durch Filtration von dem Nährmedium abgetrennt und mit dem fünffachen Anteil des Myzelfeuchtgewichtes mit Methanol 10 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur extrahiert. Dann wird das extrahierte Myzel abgetrennt und der methanolische Extrakt wird im Vakuumrotationsverdampfer konzentriert. Der wäßrige Rückstand wird mit 10 l Chloroform reextrahiert und zur Trockenheit eingeengt.
  • 3. Chromatographische Aufreinigung des Aurantimycins
    Aurantimycin wird aus dem eingeengten Chloroformextrakt von 100 l Fermentationsbrühe durch die nachfolgenden chromatographischen Aufarbeitungsschritte erhalten:
    Zunächst wird der Rückstand des eingeengten Extraktes auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit Kieselgel 60 n-Hexan gegeben. Mit dem gleichen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, danach eluiert man weitere unpolare Verunreinigungen mit trockenem Chloroform. Die Hauptmenge an Aurantimycin wird nachfolgend mit Aceton aus der Säule eluiert. Ausbeute ca. 1,8 g. In einer zweiten säulenchromatografischen Reinigungsstufe erfolgt die Chromatografie an Kieselgel 60 unter Verwendung von Chloroform/Methanol (99 : 1, v/v) als Eluent. Ausbeute 1,1 g. Die weitere Reinigung wird durch Gelchromatografie an organophilen Dextrangelen (Sephadex LH-20; Methanol als Eluent), durch Mitteldruckchromatografie an Kieselgel RP-18 unter Verwendung von Methanol/Wasser bzw. Acetonitril/Wasser-Gemischen, sowie durch Umkristallieren aus Methanol mit geringen Wasseranteilen durchgeführt. Ausbeute an Aurantimycin: 0,5 g.
  • 4. Herstellung eines Aurantimycin-Dimethylesters
    200 mg Aurantimycin werden in destilliertem Methanol gelöst und mit etherischer Diazomethanlösung bis zur bestehenden Gelbfärbung versetzt. Nach dem Abdampfen des Lösemittels wird der verbliebene Aurantimycin- Dimethylester mittels präparativer HPLC auf einer Kieselgel RP-18-Säule im System Methanol-Wasser (75 : 15; v/v) gereinigt. Ausbeute 110 mg.
  • 5. Physikalisch-chemischen Eigenschaften des Aurantimycins
    Aussehen: farblose kristalline Substanz Schmelzpunkt: < 220 °C (Zersetzung)
    Massenspektrum:FAB-MS:
    m/z 895,4538 (M⁺ + K⁺)
    m/z 879,4466 (M⁺ + Na⁺)
    m/z 839,4576 (M⁺ + H⁺-H2O)EI-MS (Dimethylester, Herstellung durch Umsetzung mit Diazomethan)
    M⁺
    m/z 884 (schwach)
    M⁺-H2O m/z 866,47290 (C40H66N8O13)
    M⁺-2 H2O m/z 848,46118 (C40H64N8O12)
    Summenformel: C38H64N8O14
    Molmasse: 856 Dalton
    Mikroanalyse (Dimethylester):C: 50.74% (ber. 54.3% für C40H68N8O14)
    H: 7.58% (ber. 7.75% für C40H68N8O14)
    N: 10.92% (ber. 10.92% für C40H68N8O14)Chemische Verschiebung im 125 MHz-13C-NMR-Spektrum des Aurantimycins (in Dimethylsulfoxid und Chloroform; Signal bei 39.6 ppm bei Aufnahme in CDCI3):176.8872; 174.4667; 171.4969; 169.0118; 168.8855; 168.0428;
    167.1620; 98.6279; 77,7083; 75.5611; 70.4726; 67.1250; 57.9180;
    57.3462; 57.1717; 52.7616; 48.4293; 48.0730; 47.7623; 46.5998;
    46.5692; 46.3310; 45.5692; 41.3298; 40.7887; 39.7638; 29.1472;
    28.994; 26.9862; 24.8010; 24.2413; 24.1006; 24.0371; 23.7683;
    21.4422; 20.7239; 20.6438; 19.0454; 18.6691; 18.3743; 13.7106.
  • Aminosäuren im Hydrolysat:
    Glycin, Alanin, Serin, Ornithin, 1 unbekannte nichtproteinogene Aminosäure.
  • Chromatografisches Verhalten:
    Rf 0.8 (Chloroform/Methanol; 98 : 2; v/v, Kieselgel 60 Merck) charakteristische grüne Anfärbung durch 2% Vanillin in konz. Schwefelsäure.

Claims (10)

1. Verbindung der Summenformel C38H64N8O14, erhältlich aus Streptomyces aurantiacus IMET43917 durch
  • - Kultivierung von Streptomyces aurantiacus IMET43917 für 1-10 Tage bei 15-37°C in einem Nährmedium, das 0,2-5% Sojamehl und 0,2-5% Glukose enthält und einen pH-Wert zwischen 5 und 9,5 aufweist, bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft und
  • - Isolierung von Aurantimycin durch nachfolgender Separation von Pilzmyzel und Kulturmedium durch Filtration, Extraktion des Pilzmyzels mit Methanol und chromatographischer Auftrennung des Extraktes.
2. Chemische Derivate, abgeleitet aus der Verbindung der Summenformel C38H64N8O14, erhältlich aus Streptomyces aurantiacus IMET43917 durch
  • - Kultivierung von Streptomyces aurantiacus IMET43917 für 1-10 Tage bei 15-37°C in einem Nährmedium, das 0,2-5% Sojamehl und 0,2-5% Glukose enthält und einen pH-Wert zwischen 5 und 9,5 aufweist, bis sich Aurantimycin in der Kulturbrühe anhäuft,
  • - Isolierung von Aurantimycin durch nachfolgender Separation von Pilzmyzel und Kulturmedium durch Filtration, Extraktion des Pilzmyzels mit Methanol und chromatographischer Auftrennung des Extraktes,
  • - Überführung des Peptidantibiotikums Aurantimycin in chemische Derivate durch Hydrierung von Doppelbindungen, Veresterungen von Alkohol- oder Säuregruppen, Alkylierung von Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatomen oder Acetylierung von Alkohol- oder Aminogruppen.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als Arzneimittel.
4. Arzneimittel, enthaltend Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 und einen oder mehrere pharmazeutische Träger.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces aurantiacus in einem Nährmedium kultiviert, bis sich die erfindungsgemäße Verbindung in der Kulturbrühe anhäuft.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces aurantiacus IMET43917 oder dessen Mutanten und Varianten kultiviert.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-6, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,2-5% Sojamehl und 0,2-5% Glukose enthält und man die Kultivierung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9,5 und einer Temperatur zwischen 15 und 37°C über 1-10 Tage durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 1-4% Sojamehl und 1-4% Glukose enthält und man die Kultivierung bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 und einer Temperatur zwischen 23 und 37°C über 2-6 Tage durchführt.
9. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 als pharmakologisch wirksamen Stoff.
10. Verwendung nach Anspruch 9 als Wirkstoff gegen Bakterien und/oder Nematoden.
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