CN110499277B - 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法 - Google Patents

一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法，所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基每升中含有以下原料组分：葡萄糖20 g、丙氨酸10 g、双孢蘑菇200 g、琼脂粉16 g。红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液在该产孢培养基4℃黑暗培养24 h，破除休眠，再置于25℃黑暗培养24 h，萌发率达27.55%。利用该培养基及萌发方法可筛选针对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的杀菌剂，这将对双孢蘑菇疣孢霉病的防控起到积极作用。

Description

一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法
技术领域
本发明涉及植物病原真菌研究技术领域，具体地说，涉及一种红丝疣孢霉（Mycogone rosea）厚垣孢子萌发培养基及萌发方法。
背景技术
由疣孢霉属真菌（Mycogone LK. ex Chev.）侵染引起的双孢蘑菇褐腐病是一种世界性的土传真菌病害。1888年，法国巴黎首次报道了双孢蘑菇褐腐病的大爆发，此后在英国、美国、荷兰、澳大利亚等国家均有不同程度的发生，造成了巨大的经济损失，在我国福建、浙江、江苏等地双孢蘑菇种植区均有该病害发生且日趋严重，有的菇房损失率达30%，严重的菇房损失率高达50%-60%，甚至绝收，严重影响双孢蘑菇的产量和质量。可用于疣孢霉属分类的形态特征较少，科学家根据菌丝颜色、厚垣孢子的颜色、厚垣孢子上下细胞的大小，将疣孢霉属鉴定出4个种，分别为红丝疣孢霉（Mycogone rosea）、马鞍菌疣孢霉（M. cervina）、夏氏菌疣孢霉（M. jaapii）和菌盖疣孢霉（M. perniciosa），国内学者认为，有害疣孢霉菌即菌盖疣孢霉，是造成我国双孢蘑菇疣孢霉病的主要病原菌，然而我们调查发现红丝疣孢霉（Mycogonerosea）在我国双孢蘑菇产区分布更广泛。疣孢霉属真菌分生孢子梗短而直立，轮枝型，有两种孢子，即无色小型的分生孢子和双细胞褐色的厚垣孢子。病原菌的厚垣孢子通常具有耐干燥、耐低温、生存周期长和不易受环境影响的特点，厚垣孢子的这些特性帮助病原菌度过不良环境条件而成为初侵染源，在病害循环中具有重要作用。疣孢霉的分生孢子、厚垣孢子均具致病作用，分生孢子极易萌发，而厚垣孢子不易萌发，有害疣孢霉厚垣孢子在PDA培养基上的萌发率约为3%，而红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的研究较少。因此，探寻影响红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的因子，建立稳定的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发技术体系，对筛选抑制孢子萌发的杀菌剂，控制红丝疣孢霉的侵染循环具有重要意义，将为双孢蘑菇疣孢霉病的防治提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红丝疣孢霉（M. rosea）厚垣孢子萌发培养基及萌发方法，综合利用碳源、氮源和双孢蘑菇提取物，结合温度变化破除红丝疣孢霉厚垣孢子的休眠，提高红丝疣孢霉厚垣孢子萌发率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案提供一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基，所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基每升中含有以下原料组分：葡萄糖20g、丙氨酸10 g、双孢蘑菇200 g、琼脂粉16 g。
将所述双孢蘑菇清水洗净，切片后加双孢蘑菇5倍质量的清水煮沸30 min，用双层纱布过滤，上清液中加入葡萄糖20g、丙氨酸10 g、琼脂粉16 g，加热溶解，加水定容，调节pH值至7.0，121 ℃高压灭菌25 min，冷却得到红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基。
病原菌采集自福建福建省莆田市仙游县园庄镇，由福建省农业科学院植物保护研究所分离保存（采集时间为2016年），采用柯赫氏法则验证，即观察分离纯化后的病原菌形态特征，并用PDA培养基培养所得的分生孢子、厚垣孢子接种双孢蘑菇，观察其发病症状，镜检分离病原菌。
本发明还提供所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发方法，具体方法为：用直径5 mm打孔器从红丝疣孢霉病菌菌落边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至马铃薯葡萄糖培养基表面，25℃黑暗培养7 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后配制成每毫升1×105个孢子的红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液，将红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液0.5 mL涂布于所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基平板上置于4℃黑暗培养24 h，破除休眠，再置于25℃黑暗培养24 h，促进萌发，红丝疣孢霉厚垣孢子萌发率约27.55%。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基配料简单，取材方便，可操作性强，分别以葡萄糖为碳源，丙氨酸为氮源，提供了红丝疣孢霉厚垣孢子萌发所需要的碳、氮元素，加入的双孢蘑菇煎汁诱导了红丝疣孢霉厚垣孢子的萌发。本发明提供的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基和萌发方法，萌发率明显优于常用的PDA培养基，萌发率是PDA培养基的9倍。本发明提供的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基和萌发方法可用于后续的杀菌剂筛选等研究工作。
附图说明
图1为pH值对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响；
图2为不同培养基对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响；
图3碳源对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响；
图4氮源对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或替换，均属于本发明的范畴。
实施例1：温度对破除红丝疣孢霉厚垣孢子休眠的影响
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后，配制成1.0×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）双孢蘑菇煎汁培养基（MuDA培养基）配制：将双孢蘑菇200 g切片，加水1000 mL煮沸 30 min，用双层纱布过滤，上清液加入琼脂粉16 g，加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000 mL，121℃下高压湿热灭菌25 min，调节pH值至7.0。
（3）取供试的双孢蘑菇煎汁培养基10 mL倒入9 cm培养皿中，制成培养基平板，取红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液0.5 mL均匀涂布于双孢蘑菇煎汁培养基平板上，风干多余水分，分别置于-80℃、-20℃、0℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃黑暗培养12 h、24h、48h，破除休眠，再分别置于25℃黑暗培养12 h、24 h、48h，促进萌发，在显微镜下随机观察不少于300个红丝疣孢霉厚垣孢子萌发情况，统计其萌发率和萌发类型，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，试验设置3次重复。
（4）在0℃、4℃黑暗培养12 h、24h、48h均能破除红丝疣孢霉厚垣孢子的休眠，其中在0℃黑暗培养12 h，再置于25℃黑暗培养24 h和48 h的萌发率分别为5.90%和13.86%，在0℃黑暗培养24h，再置于25℃黑暗培养24 h和48 h的萌发率分别为13.79%和15.25%，在0℃黑暗培养48 h，再置于25℃黑暗培养24 h和48 h的萌发率分别为14.19%和16.05%；而在4℃黑暗培养12 h，再置于25℃黑暗培养12 h、24 h和48 h的萌发率分别为2.68%、5.22%和15.34%，在4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养12 h、24 h和48 h的萌发率分别为3.64%、15.29%和17.14%，在4℃黑暗培养48 h，再置于25℃黑暗培养12 h、24 h和48 h的萌发率分别为3.45%、17.30%和17.83%。在25℃处理72 h和96 h红丝疣孢霉厚垣孢子也有一定的萌发率，但萌发率较低。其它供试温度红丝疣孢霉厚垣孢子均未萌发（表1）。
表1 温度对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发率的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：数据后不同小写字母分别表示在5%水平上差异显著。
实施例2：pH对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后，配制成1×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）分别用0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节双孢蘑菇煎汁培养基的pH值至3、4、5、6、7、8、9和10，取双孢蘑菇煎汁培养基10 mL倒入9 cm培养皿中，制成培养基平板，取红丝疣孢霉菌株的厚垣孢子悬浮液0.5 mL均匀涂布于双孢蘑菇煎汁培养基平板上，风干多余水分，置于4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养24 h，在显微镜下观察300个红丝疣孢霉厚垣孢子萌发情况，统计其萌发率和萌发类型，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，试验设置3次重复。
（3）红丝疣孢霉厚垣孢子在pH值为3、4、5、6、7、8、9和10双孢蘑菇煎汁培养基上均可萌发，其中pH值5、6、7、8和9为较适合的酸碱度，其萌发率分别为16.21%、17.62%、19.20%、16.86%和15.35%，显著高于其它供试pH值上的萌发率，如图1所示。
实施例3：培养基对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后，配制成1×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）培养基配制：
水琼脂培养基(WA培养基)：取蒸馏水1000 mL，加入琼脂粉16 g，加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000 mL，121℃下高压湿热灭菌25 min。
双孢蘑菇煎汁培养基（MuDA培养基）：将双孢蘑菇200 g切片，加水1000 mL煮沸 30min，用双层纱布过滤，上清液加入琼脂粉16 g，加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000mL，121℃下高压湿热灭菌25 min，调节pH值至7.0。
双孢蘑菇浸出液培养基（MuEA培养基）：将钮扣状的双孢蘑菇洗净，切片，40℃烘干48 h，用研钵研磨成粉，取2克粉末加入100 mL的无菌水中，35℃水浴1 h，并不断搅拌，然后用双层纱布过滤，上清液再用滤纸过滤，用除菌滤膜过滤后分别装入5 mL离心管中，放入0℃，备用。使用时将5 mL上清液加入融化的5 mL 3.2%水琼脂培养基中，混合均匀后倒入灭菌的培养皿使用。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：将马铃薯200g切成小块，加水煮沸25分钟，用四层纱布过滤，上清液加入葡萄糖20 g、琼脂粉16 g、加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000 mL，在121℃下高压湿热灭菌25 min。
V8培养基：V-8 果汁200 g，CaCO3 3.0 g，琼脂粉16 g，加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000 mL，调节pH 至5.8，121℃下高压湿热灭菌25 min。
（3）分别取供试的水琼脂培养基、双孢蘑菇浸出液培养基、双孢蘑菇煎汁培养基、PDA培养基和V8培养基10 mL倒入9 cm培养皿中，制成培养基平板，取红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液0.5 mL分别涂布于水琼脂培养基、双孢蘑菇浸出液培养基、双孢蘑菇煎汁培养基、PDA培养基和V8培养基平板上，风干多余水分，置于4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养24 h，在显微镜下随机观察不少于300个红丝疣孢霉厚垣孢子萌发情况，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，统计其萌发率和萌发类型，试验设置3次重复。
（4）红丝疣孢霉厚垣孢子在水琼脂培养基上未萌发，在双孢蘑菇浸出液培养基、双孢蘑菇煎汁培养基、PDA培养基和V8培养基上的萌发率分别为12.78%、18.99%、3.03%和15.15%，在双孢蘑菇煎汁培养基培养基上萌发率最好，显著优于其它供试培养基上的萌发率，如图2所示。
实施例4：碳源对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后，配制成1×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）在供试的每升双孢蘑菇煎汁培养基中分别加入20 g的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-乳糖、海藻糖、山梨糖、D-棉子糖、肌醇和甘露醇9种碳源，取10 mL倒入9 cm培养皿中，制成含有不同碳源的培养基平板，取红丝疣孢霉菌株的厚垣孢子悬浮液0.5 mL分别涂布于含有各碳源的双孢蘑菇煎汁培养基平板上，风干多余水分，置于4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养24 h，以不加碳源的双孢蘑菇煎汁培养基为对照，在显微镜下随机观察不少于300个红丝疣孢霉厚垣孢子萌发情况，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，统计其萌发率和萌发类型，试验设置3次重复。
（3）红丝疣孢霉厚垣孢子在葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-乳糖、海藻糖、山梨糖、D-棉子糖、肌醇和甘露醇上均可萌发，但萌发率差异较大。红丝疣孢霉厚垣孢子在葡萄糖的萌发率最好，显著优于在其它碳源的萌发率，如图3所示。
实施例5：氮源对红丝疣孢霉厚垣孢子萌发的影响
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后，配制成1×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）在供试的每升双孢蘑菇煎汁培养基中分别加入10 g的蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵、脯氨酸（L-proline）、色氨酸（Tryptophan）、丝氨酸（L-serline）、甘氨酸（Glycine）、胱氨酸（L-cystine）、丙氨酸（L-alanine）、鸟氨酸（L-qrnithine）、酪氨酸（L-tyrosine）、天门冬氨酸（L-aspartic acid）13种氮源，取10 mL倒入9 cm培养皿中，制成含有不同氮源的培养基平板，取红丝疣孢霉菌株的厚垣孢子悬浮液0.5 mL分别涂布于含有各氮源的双孢蘑菇煎汁培养基平板上，风干多余水分，置于4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养24 h，以不加氮源的双孢蘑菇煎汁培养基为对照，在显微镜下随机观察不少于300个红丝厚垣孢子萌发情况，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，统计其萌发率和萌发类型，试验设置3次重复。
（3）红丝疣孢霉厚垣孢子在加入蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵、脯氨酸（L-proline）、色氨酸（Tryptophan）、丝氨酸（L-serline）、甘氨酸（Glycine）、胱氨酸（L-cystine）、丙氨酸（L-alanine）、鸟氨酸（L-qrnithine）、酪氨酸（L-tyrosine）和天门冬氨酸（L-aspartic acid）的双孢蘑菇煎汁培养基上均可萌发，加入脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和鸟氨酸后萌发率分别为22.55%、23.16%、19.87%、22.41%和20.16%，显著优于不加任何氮源（CK）萌发率，而蛋白胨、硝酸钾和酪氨酸不能提高红丝疣孢霉厚垣孢子的萌发率，甚至有一定的抑制作用，如图4所示。
实施例6：红丝疣孢霉在加入碳源和氮源的双孢蘑菇煎汁培养基上的萌发率
（1）将保存于滤纸片上的供试菌株转至PDA培养基平板上，28 ℃培养5 d，再转接至新的PDA培养基平板上，28 ℃培养10 d，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，四层灭菌纱布过滤后，配制成1×105个孢子/mL的厚垣孢子悬浮液，备用。
（2）加入碳源和氮源的双孢蘑菇煎汁培养基：将双孢蘑菇200 g切片，加水1000 mL煮沸 30 min，用双层纱布过滤，上清液加入葡萄糖20 g、丝氨酸10 g、琼脂粉16 g，加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1000 mL，121℃下高压湿热灭菌25 min，调节pH值至7.0。
取10 mL加入碳源和氮源的双孢蘑菇煎汁培养基倒入9 cm培养皿中，将红丝疣孢霉菌株的厚垣孢子悬浮液0.5 mL分别涂布于含有碳源、氮源的双孢蘑菇煎汁培养基平板上，风干多余水分，置于4℃黑暗培养24 h，再置于25℃黑暗培养24 h，以不加碳源、氮源的双孢蘑菇煎汁培养基为对照，在显微镜下随机观察不少于300个红丝厚垣孢子萌发情况，当芽管长度超过萌发细胞的半径时就记为萌发，统计其萌发率和萌发类型，试验设置3次重复。
（3）红丝疣孢霉厚垣孢子在加入碳源和氮源的双孢蘑菇煎汁培养基上萌发率为27.55%，显著提高了红丝疣孢霉厚垣孢子的萌发率。
上述所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，所作出的修改与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基，其特征在于：所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基每升中含有以下原料组分：葡萄糖20g、丙氨酸10 g、双孢蘑菇200 g、琼脂粉16 g。
2.一种如权利要求1所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜的双孢蘑菇称量后清水洗净，切片后加双孢蘑菇5倍质量的清水煮沸30 分钟，用双层纱布过滤，上清液中加入葡萄糖、丙氨酸和琼脂粉，加热至琼脂粉溶解，加水定容至1000mL，调节pH值至7.0，121 ℃高压灭菌25 分钟。
3.一种利用权利要求1所述培养基萌发红丝疣孢霉厚垣孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：用直径5 mm打孔器从红丝疣孢霉病菌菌落边缘打取菌碟，然后将菌碟转移至马铃薯葡萄糖培养基表面，25℃黑暗培养10 天，用灭菌毛笔和无菌水将马铃薯葡萄糖培养基表面的红丝疣孢霉厚垣孢子刷下，过滤后用无菌水配制成每毫升1×105个孢子的厚垣孢子悬浮液，将红丝疣孢霉厚垣孢子悬浮液0.5 mL涂布于所述的红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基平板上置于4℃黑暗培养24 小时，破除休眠，再置于25℃黑暗培养24 小时，促进萌发。
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