CN101381682A - 玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化的方法，以玻片悬浮法培养玉米弯孢菌萌发分生孢子为受体，用含真菌转化载体系统的农杆菌与萌发分生孢子共培养，然后在抗生素培养基上筛选出具有抗性的转化子。该体系以玉米弯孢菌为始发菌，在PDA培养基上培养5－7天后用0.9％生理盐水刮下孢子，然后用玻片悬浮培养法使之萌发后，用于农杆菌感染。感染后的萌发分生孢子经共培养、抑菌培养和连续2代的抗选择剂筛选培养，获得抗性转化子，以此构建玉米弯孢菌突变体库，为筛选弱致病性和致病缺陷性弯孢菌株提供了丰富的筛选菌源，同时还可用于克隆玉米弯孢菌致病性相关基因，为深入研究玉米弯孢菌菌株致病机理奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化的方法，具体涉及一种通过农杆菌介导的，以玻片悬浮法培养出的萌发分生孢子为材料进行遗传转化而获得玉米弯孢菌突变体的方法，属于生物技术领域。
背景技术
玉米弯孢菌叶斑病是由玉米弯孢菌(Curvularia lunata(Wakker)Boed)引起的，在世界的大部分国家造成过重大危害。1996年，该病在中国造成严重的玉米损失，40％玉米产区被该病侵染。为了更好的防治该病和选育抗病品种，对该病菌的致病分子机理进行深入研究具有重要意义。分离和鉴定弯孢菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在，而创造致病缺陷性突变体则是分离和鉴定致病相关基因的一种有效途径之一。目前获得丝状真菌突变体有很多方法，例如质粒共转化、电激转化、基因枪、限制性内切酶介导转化(REMI)和农杆菌介导转化(农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化，自然生物技术，1998)。但质粒共转化、电激转化、限制性内切酶介导转化(REMI)、基因枪法方案中要使用原生质体电转化或原生质体结合氯化钙和聚乙二醇(PEG)，转化子不稳定、转化效率较低，其转化效率低使得真菌遗传转化发展缓慢。近来年的研究表明利用农杆菌介导转化比这些方法有许多优点。该方法具有易于操作、转化效率高、转化子稳定、插入位点无序列特异性和转化受体多样性等优点，这些优点使农杆菌介导的突变技术成为丝状真菌插入突变的重要工具。
农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系可以利用各种形式的受体，如原生质体、分生抱子、菌丝体等，但有时并不是所有的受体都能用于转化，在转化米根霉Rhizopus oryzae和卷枝毛霉Mucor circinelloides时只能用原生质体作为受体。在转化盾壳霉Coniothyrium minitans和晚疫病菌Phytophthora infestans时则用萌发的孢子最理想，因此在转化某些真菌时可能只能利用萌发孢子的才能转化。制备转化的萌发孢子是用分生孢子涂布在玻璃纸或纤维素膜，萌发几天后用生理盐水洗下。由于这时萌发孢子的芽管附着在膜孔上，要从膜上洗下萌发孢子在操作中比较困难，同时洗下的孢子液中混有较多其它杂质，其杂质不易除掉，使转化效率低，重复性差。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化的方法，操作简单，转化效率高，重复性好，获得的转化子可为筛选弱致病性和致病缺陷性突变体提供丰富的筛选菌源。
为实现上述目的，本发明以载玻片和弯孢菌分生孢子为材料，把玉米弯孢菌分生孢子悬浮液滴置于无菌洁净的载玻片上，然后在保湿的环境中培养使玉米弯孢菌分生孢子萌发，萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用生理盐水洗下后直接做为遗传转化的受体用于农杆菌感染。感染后的萌发分生孢子经共培养、抑菌培养和连续2代的抗选择剂筛选培养，获得转化子，从而建立了弯孢病菌高效的遗传转化体系。
本发明的方法具体包括以下步骤：
1、玉米弯孢菌萌发分生孢子的制备
在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上将玉米弯孢菌培养5-7天后，用生理盐水将玉米弯孢菌的分生孢子刮下后用无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的玉米弯孢菌分生孢子滤液用0.9％生理盐水调整到浓度为105-108孢子/毫升；取有一层保水滤纸培养皿，加无菌水使滤纸湿润并在表面形成水膜，上加两根木棒，然后取浓度为105-108孢子/毫升的玉米弯孢菌分生孢子悬浮液100-200μL滴置于无菌洁净的载玻片中央，分开滴成3-4滴，然后迅速将载玻片倒置，把它两端隔放在培养皿中两根木棒上，25-30℃下在黑暗中培养3-9小时；萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用生理盐水洗下，经2000-5000rpm离心5分钟，用生理盐水再次调节玉米弯孢菌萌发分生孢子浓度为105-108萌发孢子/毫升，获得玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液备用；上述一切操作在无菌的条件下进行。
2、载体的准备
取含有双元载体的农杆菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养至对数生长期，得到OD660＝0.6的农杆菌菌液；然后取农杆菌菌液250-400μ加到新鲜的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养过夜至对数生长期，然后在液体IM培养基上诱导培养4-6小时，将农杆菌菌液浓度调至OD660＝0.15-0.2备用；其中，所述液体IM培养基的组分为10mM K2HPO4，10mMKH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mM CaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μM acetosyringone，0.5wt％ glycerol。
3、转化
取诱导后的农杆菌菌液与玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液等体积混合后，涂布于IM固体培养基的玻璃纸上，在黑暗下22-28℃培养24-72小时，然后将IM固体培养基上的玻璃纸转移到含有200微克/毫升的头孢霉素和250微克/毫升潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板培养基上筛选转化子；将平板培养基在22-28℃下培养5-7天，将能够抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落转移到预先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落即为转化子；其中，所述IM固体培养基由每升IM液体培养基加15-18克琼脂构成。
本发明方法具有操作简单，转化效率高，重复性好，从而解决了目前用农杆菌转化丝状真菌时在制备材料上的困难，转化效率低，重复差的缺点。由玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化方法获得的转化子可为筛选弱致病性和致病缺陷性突变体提供丰富的筛选菌源，同时还可用于克隆玉米弯孢菌致病性相关基因，为深入研究玉米弯孢菌菌株致病机理奠定基础。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1
1、玉米弯孢菌萌发分生孢子的制备
在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上将玉米弯孢菌培养7天后，用0.9％生理盐水将玉米弯孢菌的分生孢子刮下后用无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的玉米弯孢菌分生孢子滤液用0.9％生理盐水调整到浓度为108孢子/毫升；取有一层保水滤纸培养皿，加无菌水使滤纸湿润并在表面形成水膜，上加两根木棒，然后取浓度为108孢子/毫升的玉米弯孢菌分生孢子悬浮液200μL滴置于无菌洁净的载玻片中央，分开滴成4滴，然后迅速将载玻片倒置，把它两端隔放在培养皿中两根木棒上，30℃下在黑暗中培养9小时；萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用0.9％生理盐水洗下，经5000rpm离心5分钟，用生理盐水再次调节玉米弯孢菌萌发分生孢子浓度为108萌发孢子/毫升，获得玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液备用；上述一切操作在无菌的条件下进行。
2、载体的准备
取含有双元载体的农杆菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养至对数生长期，得到OD660＝0.6的农杆菌菌液；然后取农杆菌菌液250μ加到新鲜的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养过夜至对数生长期，然后在液体IM培养基上诱导培养6小时，将农杆菌菌液浓度调至OD660＝0.2备用；其中，所述液体IM培养基的组分为10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mM CaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μMacetosyringone，0.5wt％ glycerol。
3、转化
取诱导后的农杆菌菌液与玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液等体积混合后，涂布于IM固体培养基的玻璃纸上，在黑暗下28℃培养72小时，然后将IM固体培养基上的玻璃纸转移到含有200微克/毫升的头孢霉素和250微克/毫升潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板培养基上筛选转化子；将平板培养基在28℃下培养7天，将能够抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落转移到预先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落即为转化子；其中，所述IM固体培养基由每升IM液体培养基加18克琼脂构成。
实施例2
1、玉米弯孢菌萌发分生孢子的制备
在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上将玉米弯孢菌培养7天后，用0.9％生理盐水将玉米弯孢菌的分生孢子刮下后用无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的玉米弯孢菌分生孢子滤液用0.9％生理盐水调整到浓度为106孢子/毫升；取有一层保水滤纸培养皿，加无菌水使滤纸湿润并在表面形成水膜，上加两根木棒，然后取浓度为106孢子/毫升的玉米弯孢菌分生孢子悬浮液200μL滴置于无菌洁净的载玻片中央，分开滴成3滴，然后迅速将载玻片倒置，把它两端隔放在培养皿中两根木棒上，28℃下在黑暗中培养6小时；萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用0.9％生理盐水洗下，经5000rpm离心5分钟，用生理盐水再次调节玉米弯孢菌萌发分生孢子浓度为106萌发孢子/毫升，获得玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液备用；上述一切操作在无菌的条件下进行。
2、载体的准备
取含有双元载体的农杆菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养至对数生长期，得到OD660＝0.6的农杆菌菌液；然后取农杆菌菌液250μ加到新鲜的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养过夜至对数生长期，然后在液体IM培养基上诱导培养6小时，将农杆菌菌液浓度调至OD660＝0.2备用；其中，所述液体IM培养基的组分为10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mM CaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μMacetosyringone，0.5wt％ glycerol。
3、转化
取诱导后的农杆菌菌液与玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液等体积混合后，涂布于IM固体培养基的玻璃纸上，在黑暗下28℃培养48小时，然后将IM固体培养基上的玻璃纸转移到含有200微克/毫升的头孢霉素和250微克/毫升潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板培养基上筛选转化子；将平板培养基在28℃下培养7天，将能够抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落转移到预先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落即为转化子；其中，所述IM固体培养基由每升IM液体培养基加15克琼脂构成。
实施例3
1、玉米弯孢菌萌发分生孢子的制备
在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上将玉米弯孢菌培养7天后，用0.9％生理盐水将玉米弯孢菌的分生孢子刮下后用无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的玉米弯孢菌分生孢子滤液用0.9％生理盐水调整到浓度为107孢子/毫升；取有一层保水滤纸培养皿，加无菌水使滤纸湿润并在表面形成水膜，上加两根木棒，然后取浓度为107孢子/毫升的玉米弯孢菌分生孢子悬浮液200μL滴置于无菌洁净的载玻片中央，分开滴成4滴，然后迅速将载玻片倒置，把它两端隔放在培养皿中两根木棒上，30℃下在黑暗中培养3小时；萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用0.9％生理盐水洗下，经5000rpm离心5分钟，用生理盐水再次调节玉米弯孢菌萌发分生孢子浓度为108萌发孢子/毫升，获得玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液备用；上述一切操作在无菌的条件下进行。
2、载体的准备
取含有双元载体的农杆菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养至对数生长期，得到OD660＝0.6的农杆菌菌液；然后取农杆菌菌液250μ加到新鲜的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养过夜至对数生长期，然后在液体IM培养基上诱导培养6小时，将农杆菌菌液浓度调至OD660＝0.2备用；其中，所述液体IM培养基的组分为10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mM CaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μMacetosyringone，0.5wt％ glycerol。
3、转化
取诱导后的农杆菌菌液与玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液等体积混合后，涂布于IM固体培养基的玻璃纸上，在黑暗下28℃培养48小时，然后将IM固体培养基上的玻璃纸转移到含有200微克/毫升的头孢霉素和250微克/毫升潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板培养基上筛选转化子；将平板培养基在28℃下培养7天，将能够抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落转移到预先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落即为转化子；其中，所述IM固体培养基由每升IM液体培养基加18克琼脂构成。
Claims (1)
1、一种玉米弯孢菌萌发分生孢子遗传转化的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)玉米弯孢菌萌发分生孢子的制备：在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上将玉米弯孢菌培养5-7天后，用生理盐水将玉米弯孢菌的分生孢子刮下后用无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的玉米弯孢菌分生孢子滤液用0.9％生理盐水调整到浓度为105-108孢子/毫升；取有一层保水滤纸培养皿，加无菌水使滤纸湿润并在表面形成水膜，上加两根木棒，然后取浓度为105-108孢子/毫升的玉米弯孢菌分生孢子悬浮液100-200μL滴置于无菌洁净的载玻片中央，分开滴成3-4滴，然后迅速将载玻片倒置，把它两端隔放在培养皿中两根木棒上，25-30℃下在黑暗中培养3-9小时；萌发后的玉米弯孢菌分生孢子用生理盐水洗下，经2000-5000rpm离心5分钟，用生理盐水再次调节玉米弯孢菌萌发分生孢子浓度为105-108萌发孢子/毫升，获得玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液备用；上述一切操作在无菌的条件下进行；
2)载体的准备：取含有双元载体的农杆菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养至对数生长期，得到OD660＝0.6的农杆菌菌液；然后取农杆菌菌液250-400μ加到新鲜的5毫升LB液体培养基中，28℃下震荡培养过夜至对数生长期，然后在液体IM培养基上诱导培养4-6小时，将农杆菌菌液浓度调至OD660＝0.15-0.2备用；其中，所述液体IM培养基的组分为10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mMCaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μM acetosyringone，0.5wt％glycerol；
3)转化：取诱导后的农杆菌菌液与玉米弯孢菌萌发分生孢子悬浮液等体积混合后，涂布于IM固体培养基的玻璃纸上，在黑暗下22-28℃培养24-72小时，然后将IM固体培养基上的玻璃纸转移到含有200微克/毫升的头孢霉素和250微克/毫升潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板培养基上筛选转化子；将平板培养基在22-28℃下培养5-7天，将能够抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落转移到预先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到抗潮霉素的玉米弯孢菌菌落即为转化子；其中，所述IM固体培养基由每升IM液体培养基加15-18克琼脂构成。
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