JP5394259B2 - スナゴケ及び種子植物の生育促進方法及び生育促進菌 - Google Patents
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Description
2.上記1の細菌とスナゴケのプロトネマとを含んでなる,組成物。
3.該細菌と該プロトネマとを培地中に含んでなるものである,上記2の組成物。
4.スナゴケのプロトネマの生育促進方法であって,
FERM BP−11078,FERM BP−11079,FERM BP−11080,及びFERM BP−11071としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌の少なくとも何れかを準備するステップと,
スナゴケのプロトネマを,該準備した細菌と共に培養するステップと,
を含んでなるものである方法。
5.タバコ,オオムギ及びダイズよりなる群より選ばれる種子植物の生育促進方法であって,
受託番号FERM BP−11078として寄託されたメタノール資化性細菌Methylobacterium aquaticumを準備するステップと,
該選ばれた種子植物の種子に該細菌を接触させて該種子の培養を行うステップと
を含んでなるものである,方法。
6.該種子と該細菌との接触が,該種子を該細菌の培養液に曝露することによるものである,上記5の方法。
また,菌株名がMC−11Aのものは,2008年12月10日付けで同じくIPODに国際寄託され,受託番号FERM BP−11071が付与されたものである。
〔スナゴケの無菌化〕
天然のスナゴケ(Racomitrium canescens,山形県産)を入手した。胞子嚢を,十分量の水(胞子嚢1個当たり1mL以上)で2回洗浄し,70%エタノールで1分間処理した。胞子嚢を,更に1%の過塩素酸ナトリウム及び0.5%のTween20を含有する水溶液に20分間浸漬した後,滅菌水で5回洗浄した。滅菌水中で胞子嚢を壊し,流出した胞子をピペットで採取した。得られた無菌胞子を,寒天培地(ハイポネックスTM*を水で1000倍希釈した液+寒天0.8%)に蒔き,20℃にて蛍光灯下で培養した。培養開始後約2週間でプロトネマ(原糸体)の生育が肉眼で確認された。
・注:ハイポネックス〔(株)ハイポネックスジャパン製,窒素全量6%(うちアンモニア性窒素2.90%,硝酸性窒素1.05%),水溶性リン酸10.0%,水溶性カリ5.0%,水溶性苦土0.05%,水溶性マンガン0.001%,水溶性硼素0.005%を含有〕
上記天然のスナゴケ(無菌化前のもの)を滅菌水に懸濁させ,液体培地1L(ハイポネックスTM を水で1000倍希釈したもの)に加え,蛍光灯下(距離30cm,16時間/日)を当てつつ,約18℃にて7週間まで撹拌した。撹拌前,撹拌開始4週後,及び撹拌開始7週後の培養液サンプルを採取した。得られたサンプルの各々につき,1/3LB寒天培地(ポリペプトン3.3g/L,酵母エキス1.6g/L,塩化トリウム10g/L,寒天15g/L),及びハイポネックス1000倍希釈液を寒天(1.5%)で固めたもののプレートを用いて培養を行い,多数の様々なコロニーを単離し,各々について菌を同定して性質を調べたが,スナゴケの生育を促進するものは見出されなかった。
・注:プライマーR:ATTACCGCGGCTGCTG(配列番号2)
<温度条件>
(1)95℃,2分
(2)次の35サイクル
95℃,1分
55℃,30秒
72℃,30秒
(3)72℃,5分
<DGGE条件>
Dcodeユニバーサルミューテーション検出システム(Bio-Rad製)のマニュアルに従って,次の通りに行った。
ゲル:9%アクリルアミドゲル
変性剤グラジエント:40〜65%
電圧:60V
泳動時間:17時間
(1)MC−11A:Methylobacterium extorquens,16S rDNA配列:配列番号3
(2)MC−11B:Methylobacterium extorquens,16S rDNA配列:配列番号4
(3)21A:Spirosoma属細菌に近縁,16Sr DNA配列:配列番号5
(4)MC−21B:Methylobacterium extorquens,16S rDNA配列:配列番号6
(5)MC−21C:Methylobacterium extorquens,16S rDNA配列:配列番号7
(6)MA−22A:Methylobacterium aquaticum,16S rDNA配列:配列番号8
(7)41A:Mesorhizobium属細菌に近縁,16S rDNA配列:配列番号9
予めY培地(寒天0.8%含有)で生育させておいたプロトネマをピンセットで1つずつ摘み,新しいY培地(寒天0.8%含有)中の2点に移した。メタノール寒天培地に生育させておいた上記細菌のコロニー(直径約1mm)を,滅菌した白金耳で1つ掻き取り,300μLの滅菌水に懸濁させ,植えつけたプロトネマに10μL接種し,20℃にて蛍光灯下で培養した。比較として,カルチャーコレクションより入手したMethylobacterium extorquens AM1株(ATCC14718)細菌を同様にしてプロトネマに接種した。また,対照として,細菌を接種しないプロトネマを同様に培養。試験開始40日後の結果を図2に示す。同図に見られるように,対照に比して,MA−22A,MC−21B又はMC−21Cを接種したスナゴケに生育の明らかな促進が認められ,特にMA−22Aを接種したものにおいて顕著であった。これに対し,Methylobacterium extorquensのこれまで知られている菌株の1つであるAM1株を接種したプロトネマには,生育促進は見られなかった。更に,MC−11A,MC−11B,MC−21B,MC−21C及びMA−22Aを接種した各プロトネマ及び細菌を接種しないプロトネマ(対照)について,試験開始3,5及び9週間後の時点における,各プロトネマを囲む楕円の面積として生育の程度を数値化した(図3)(エラーバーは標準偏差を表す。他のグラフにおいても同じ。)。その結果,MA−22Aを接種したプロトネマの生育が特に際立って優れていることが再確認されると共に,他の細菌のうち,MC−21B及びMC−21Cはもとより,MC−11A及びMC−11Bにも,生育促進効果のあることが判明した。
植物との相互作用において重要と思われる性質について,分離菌を検討した。すなわち,分離菌について,窒素固定能,シデロフォア(Siderophore:鉄イオンキレート化物質)分泌,トリプトファン(Trp)からのインドール酢酸合成能,不溶性リン酸カルシウムの溶解能,β−グルカナーゼ分泌能,HCN(カビに対する生育抑制効果を有する)分泌能の有無,及びカビに対する生育阻害作用の有無につき,下記のとおり検討した。
<試験方法>
窒素源を含まない次の組成の寒天培地に菌を画線し,28℃,暗所にて生育を観察した。生育が認められれば窒素固定能があると判定した。
Anal. Biochem, 160, 47-56, 1987に準じて以下とおりに試験を行った。すなわち,まず次の溶液(A)〜(C)を準備した。
(A)60.5mgのCAS(クロムアズロールS:chrome azurol S)を50mLの水に溶解させ,10mM塩酸中の1mM FeCl3溶液10mLと混合した。これに72.9mgのHDTMA(臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム)を40mLの水に溶かしたものをゆっくり加えた。
(B)750mLの水,100mLの10×MM9塩類(KH2PO4:3g/L, NH4Cl:10g/L,NaCl:5g/L,MgSO4:2mM,CaCl2:1mM), 15gの寒天,30.24gのPIPES〔ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)〕を混ぜ,水酸化ナトリウム水溶液でpH 6.8とした。
(C)10%カザミノ酸水溶液30mL。
上記溶液(A)〜(C)を別々にオートクレーブ滅菌した後,約50℃に冷却し,混合した。これにメタノールを終濃度1%となるよう加え,シャーレにて固めた。得られたプレートは青色を呈した。これに試験菌を画線し生育を観察した(28℃,暗所)。この培地において,シデロフォア陽性の菌ではコロニーの形成が認められ,その周りに青色が抜け,ピンク色〜透明を呈する。シデロフォア陰性の菌はこの培地には生育しない。
Applied environmental microbiology, 1995, 61, 793-796に準じて次のとおりに試験を行った。すなわち,試験菌をKing's B液体培地(Difco proteose peptone No.3:20g/L, K2HPO4:1.15g/L,MgSO4:1.5g/L,メタノール:1%,トリプトファン:2.5mM)に植菌した。これを28℃,暗所にてしんとう培養し,生育が認められたら培養液を遠心分離し,上清をサンプルとした。サンプル1mLに,1mLの溶液R1(7.9MのH2SO4中FeCl3:12g/L)を加えた。室温にて30分間放置した後,530nmにおける吸光度を測定した。ブランクには菌を植えていない培地を用い,それに比べ呈色が起こればインドール酢酸合成能が陽性と判定した。
FEMS Microbiol, Lett, 170, 265, 1999に準じて次のとおりに試験を行った。すなわち,NBRIP 培地〔National Botanical Research Institute's phosphate growth medium:グルコース10g/L,Ca3(PO4)2:5g/L,MgCl2:5g/L,MgSO4:0.25g/L,KCl:0.2g/L,(NH4)2SO4:0.1g/L,pH7,寒天1.5%〕を用い,試験菌を寒天培地に画線し,生育を観察した。培地は白濁しており(リン酸カルシウム),菌にリン酸カルシウムの溶解能があれば生育と培地の色の抜けが認められる。
市販のR2A寒天培地に,アズリン染色架橋β−グルカン(Beta-glucan, azurin-dyed, cross-linked)を0.2%加え,オートクレーブ後固めた。培地は青色を呈するが基質は溶解しない。試験菌を画線し,コロニーの周りに溶解した基質の分散が認められれば陽性と判定した。
MPMI vol 16, 2003, 525-535に準じて次のとおりに試験を実施した。すなわち,試験菌をCastric's 培地(Can J. Microbiol. 21, 613-618, 1975,L−グルタミン酸:40mM,グリシン:10mM,L−メチオニン:10mM,MgSO4:2mM,NaH2PO4:5mM,K2HPO4:5mM,FeCl3:20μM,pH7.0)に植菌し,28℃,暗所にてしんとう培養した。試験管はキャップができるものを用いた。菌の生育が認められたら培養液を遠心分離し,上清を水で10倍希釈し,そのうち50μLを250μLの0.1MNaOHと混合した。これに,2−メトキシエタノール中の0.1M o−ジニトロベンゼン溶液0.5mLを加え,15秒後2−メトキシエタノール中の0.2M 4−ニトロベンズアルデヒド0.5mLを加え,更に30分後578nmにおける吸光度を測定した。同時に,1〜16μMのKCN溶液を同様に処理し,スタンダードとした。
結果を以下の表に示す。
スナゴケの表面に白い糸状のカビが生えたものを分離し,常法により18S rRNA遺伝子の配列を読むことにより,Fusarium oxysporumと同定した。このカビをR2A寒天培地(Beckton-Dickinson社)プレートの中程に植え,その周りに分離菌MA−22A,MC−21B及びMC−21Cをそれぞれ画線し,28℃で5日程度培養した。カビの菌糸が寒天培地上を広がるのを,MA−22A菌が強く阻害していることが判明した。この様子を図4に示す。
タバコ(Nicotiana tabacum 及びNicotiana benthamiana:日本たばこ産業(株)葉タバコ研究所より供与。)の種子を70%エタノールで1分処理した後,2%次亜塩素酸溶液(Tween20を約1%含有)で20分処理した。種子を滅菌水で4〜5回洗浄した。プラントボックス(プラスチック製,5.5cm四方,高さ9cm)に5.5cm四方に切り取った濾紙を4枚敷き,オートクレーブ滅菌した後,これに滅菌した1/2 Murashige-skoog培地(寒天0.8%を含有する1/2 MS培地)を5mLずつ加えた。Murashige-skoog液体培地は表10〜14に示した組成で構成されるものであり,1/2 MS培地はこれを1/2希釈したものである。
オオムギの種子(Hordeum vulgare, subsp. vulgare cultivar Akashinriki:岡山大学資源生物科学研究所大麦・野生植物資源研究センターより提供を受けた)を70%エタノールで1分処理した後,2%次亜塩素酸溶液(Tween20を約1%含有)で30分処理し,次いで滅菌水で4〜5回洗浄した。滅菌したプラントボックスに別途滅菌した40mLの0.8%寒天を流し込んで固めておいたものに,上記の種子を20個ずつ並べた(各群につき種子40個)。上記の方法で培養したMC−21C,MA−22Aの培養液を,対応する群の各種子に5μLずつ落とし,対照群の種子には,水又はメタノール培地のみを滴下した。種子を25℃,蛍光灯下,1日12時間を明,12時間を暗として,8日間培養した後,根の長さ,地上部(葉)の長さ,苗の重量を計測した。
滅菌したプラントボックスに0.8%寒天,1/2MS培地を50mLずつ加えて固めた。ダイズ(Glycine max,エンレイ種)の種子を下記の方法で滅菌し,これを上記の固めた培地に植えた(7粒/ボックス)。1サンプルに2ポットを用いた。各ボックスに,MA−22A又はMC−21C菌懸濁液(何れも,メタノール液体培地5mLで28℃,5日間,振とう培養したものを13000rpm,5分間遠心し,滅菌水で2回洗い,最終的に5mLの滅菌水に懸濁させたもの)をダイズ1粒につき20μL接種した。対照として,菌懸濁液の代わりに水のみをかけた2ボックスを用意した。これらの種子を4℃で2日間静置して種子に吸水させた。次いで,植物栽培用インキュベーター中で種子を25℃にて培養し,13日後に植物体(苗)の根と葉の長さ,及び重量を測定した。
<ダイズの種子の滅菌方法>
50mLのチューブに種子を入れ,水でよく洗浄した後,70%エタノールで3分処理した。次いで,エタノールを除き,3%次亜塩素酸ナトリウムを含有する0.1% Tween 20水溶液に種子を30分間浸した後,クリーンベンチ内にて滅菌水で4回洗浄した。
下記のKnop+B5ビタミン培地にショ糖10g/Lを加え,pHを5.8に調整し,寒天1.0w/v%を加えてスナゴケ用培地を調製した。
Claims (6)
- 受託番号FERM BP−11078,FERM BP−11079,FERM BP−11080,及びFERM BP−11071としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌より選ばれるものである,細菌。
- 請求項1の細菌とスナゴケのプロトネマとを含んでなる,組成物。
- 該細菌と該プロトネマとを培地中に含んでなるものである,請求項2の組成物。
- スナゴケのプロトネマの生育促進方法であって,
FERM BP−11078,FERM BP−11079,FERM BP−11080,及びFERM BP−11071としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌の少なくとも何れかを準備するステップと,
スナゴケのプロトネマを,該準備した細菌と共に培養するステップと,
を含んでなるものである方法。 - タバコ,オオムギ及びダイズよりなる群より選ばれる種子植物の生育促進方法であって,
受託番号FERM BP−11078として寄託されたメタノール資化性細菌Methylobacterium aquaticumを準備するステップと,
該選ばれた種子植物の種子に該細菌を接触させて該種子の培養を行うステップと
を含んでなるものである,方法。 - 該種子と該細菌との接触が,該種子を該細菌の培養液に曝露することによるものである,請求項5の方法。
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Cited By (1)
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