CN103421842A

CN103421842A - 一种获得具有不同表型花椰菜材料的方法及应用

Info

Publication number: CN103421842A
Application number: CN2013103973681A
Authority: CN
Inventors: 王春国; 李慧; 陈成彬; 宋文芹
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103421842B

Abstract

本发明公开了一种简单、高效大规模获得具有不同表型花椰菜材料的方法及应用。使用上述方法获得具有不同表型花椰菜材料包括：（1）花椰菜无菌苗的培养；（2）农杆菌GV3101的培养；（3）农杆菌的遗传转化；（4）Basta筛选；（5）阳性苗的炼苗与移栽；（6）不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：根据获得的不同花椰菜材料的性状表现判断其是否符合育种目标。采用该种方法可以短时间、大规模获得具有不同表型花椰菜材料，其对于获得符合不同育种目标花椰菜亲本材料具有重要应用价值。

Description

一种获得具有不同表型花椰菜材料的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术中利用T-DNA 插入技术获得具有不同表型特征花椰菜材料的方法及其在花椰菜优良亲本选育中的应用。

背景技术

花椰菜营养丰富、味道鲜美，且富含防癌、抗癌活性成分，是深受广大消费者喜爱的一种保健类蔬菜。目前我国已成为花椰菜种植面积最大，总产量最高的国家。但必需面对的一个问题是花椰菜原产地并不在我国，国内花椰菜种质资源十分稀少，且遗传背景狭窄，品种间遗传相似性高。并且花椰菜育种基础研究薄弱，优良种质创制缓慢，手段单一。而花椰菜新品种选育主要利用不同种质资源之间的杂交优势。因此，种质资源匮乏已成为严重制约我国花椰菜新品种选育的瓶颈。致使对一些优良品种的需求不得不高价从国外大量进口。为此，采用基因工程等高新技术手段大力提高花椰菜遗传背景的多态性，拓宽花椰菜新种质创制的途径，加速靶向性新种质创制的进程，对促进具有独立知识产权高产、优质、高抗花椰菜新品种的选育具有重要意义。

然而，采用大田自然筛选等常规育种手段获得符合育种目标的花椰菜优良亲本费时、费力且效率低下。随着分子生物学技术的发展，使采用T-DNA插入等基因工程手段获得具有不同表型特征的花椰菜材料成为可能。由于其操作简单且前期绝大部分工作可以在实验室内完成，能够实现短时间、大规模获得具有各种具有不同表型的花椰菜材料，并能在极大程度上节省人力和物力的通入。因此，采用T-DNA插入方法获得具有不同表型的花椰菜材料，对于在育种实践中筛选、获得符合不同育种目标的花椰菜亲本具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的是克服采用常规育种方法获得符合不同育种目标花椰菜优良亲本费时、费力且效率低下的方法，提供一种简单、高效大规模获得具有不同表型花椰菜材料的方法，及利用该方法获得符合不同育种目标花椰菜优良亲本的应用。为实现此目的，本发明公开了如下的技术方案：

采用T-DNA插入技术获得具有不同表型的花椰菜材料的方法，其特征在于它按如下的步骤进行：

一、花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种2h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上，培养条件为24±2℃，光照时间16h；所述的萌发培养基成分为：MS无机盐+0.5%（w/w）琼脂粉;

二、农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基，分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=0.8-1.0，备用；所述的YEB培养基成分为：Beef extract 5g/L，Yeast extract 1g/L，Peptone 5g/L，sucrose 5g/L，MgSO₄·7H₂O，pH 7.4；

三、农杆菌的遗传转化：

（1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第5-6天时，在无菌条件下将下胚轴切成3-4段，每段大约7-8mm，平铺放到预培养基上，进行预培养2d；所述的预培养基成分为：MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L；

（2）侵染：将预培养后的外植体转移到小烧杯中后，加入事先活化的上述菌液中，浸泡30s，结束后将菌液过滤掉，用滤纸把剩余的菌液吸干；

（3）共培养：侵染后的外植体依旧像预培养时一样转移到新的共培养培养基上，共培养时间为2d，且在黑暗条件下进行；所述的共培养培养基成分为：MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L；

（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3-4遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基上，一周后将Cef浓度减半；所述的抑菌培养基成分为： MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L；

四、Basta 筛选：pSKI015T-DNA载体上带有Basta抗性基因，因此可用Basta进行抗性筛选，将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基进行筛选，待不定芽长至2-3 cm时，切下绿色不定芽，转移至生根培养基继续筛选并诱导生根；所述的筛选分化培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L；所述的生根培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L；

五、阳性苗的炼苗与移栽：待阳性苗主根生长粗壮时，敞开瓶口炼苗3d，之后移栽到花盆，转移到光照培养箱，用保鲜膜覆盖以保持较高的相对湿度，待幼苗长出新叶之后，移栽到温室培养；

六、具有不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：在T-DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录性状的变化特征。

本发明更加详细的步骤进行：

二、农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基，分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=0.8-1.0，备用；所述的YEB培养基成分为：Beef extract（牛肉膏） 5g/L，Yeast extract（酵母提取物） 1g/L，Peptone（蛋白胨） 5g/L，sucrose（蔗糖） 5g/L，MgSO₄·7H₂O，pH 7.4；

三、农杆菌的遗传转化：

（1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第5-6天时，在无菌条件下将下胚轴切成3-4段，每段大约7-8mm，平铺放到预培养基上，进行预培养2d；所述的预培养基成分为：MS（各种无机盐的混合物，见《分子克隆实验指南》，科学出版社出版）+ NAA（萘乙酸）0.1 mg/L+6-BA（6苄基嘌呤）1 mg/L；

（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3-4遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基上，一周后将Cef（头孢霉素）浓度减半；所述的抑菌培养基成分为： MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L；

四、Basta 筛选：pSKI015 T-DNA载体上带有Basta抗性基因，因此可用Basta进行抗性筛选，将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基进行筛选，待不定芽长至2-3 cm时，抗性芽颜色为正常的绿色芽，非转化芽则发白变紫，切下绿色不定芽，转移至生根培养基继续筛选并诱导生根；所述的筛选分化培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L；所述的生根培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L；

本发明优选的创制方法如下：

花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种子2h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上（MS无机盐+0.5%琼脂粉），培养条件为24±2℃，光照时间16h；

农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基（Beef extract 5g/L，Yeast extract 1g/L，Peptone 5g/L，sucrose 5g/L，MgSO₄·7H₂O，pH 7.4），分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=0.8-1.0，备用；

农杆菌的遗传转化：（1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第5-6天左右时，在无菌条件下将下胚轴切成3-4段，每段大约7-8mm，平铺放到预培养培养基（MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L）上，进行预培养2d；（2）侵染：将预培养后的外植体转移到小烧杯中后，加入事先活化的上述菌液中，浸泡30s，期间最好不断的摇晃，让每一个外植体都充分的与菌液接触，结束后将菌液过滤掉，用滤纸把剩余的菌液吸干；（3）共培养：侵染后的外植体依旧像预培养时一样转移到新的共培养培养基上（成分与预培养相同），共培养时间为2d，且在黑暗条件下进行；（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3-4遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基（MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L）上，一周后将Cef浓度减半；

Basta 筛选：pSKI015 T-DNA载体上带有Basta抗性基因，因此可用Basta进行抗性筛选。将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基（含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L）进行筛选，待不定芽长至2-3 cm时，抗性芽颜色为正常的绿色芽，非转化芽则发白变紫。切下绿色不定芽，转移至生根培养基（含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L）继续筛选并诱导生根；

阳性苗的炼苗与移栽：待阳性苗主根生长粗壮时，敞开瓶口炼苗3d，之后移栽到花盆，转移到光照培养箱，用保鲜膜覆盖以保持较高的相对湿度，待幼苗长出新叶之后，移栽到温室培养；

具有不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：在T-DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录性状的变化特征，实验的结果发现：

（1）通过该方法可以获得叶片增大、茎分叉增多、根系发达等营养器官表型发生改变的花椰菜材料；

（2）通过该方法可以获得早开花、花球颜色改变、花球大小改变、雄花不育等生殖器官表型发生改变的花椰菜材料。

（3）通过该方法可以获得抗黑腐病、抗根肿病、耐盐、耐寒等抗性性状发生改变的花椰菜材料。

本发明重点解决了遗传育种和基础研究中花椰菜表型单一，遗传背景狭窄的问题，在很大程度上提高了花椰菜遗传背景的多态性，为花椰菜杂交育种及器官发育机制等基础研究提供了良好素材。

本发明公开的获得不同表型花椰菜材料的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）操作简单，操作不受材料影响，即可在纯化的花椰菜材料中开展，也可用于杂种材料；

（2）效率高，可以实现短时间内获得大量具有不同表型的花椰菜材料；

（3）节省人力、物力，前期大部分工作可以在实验室内完成。

附图说明：

图1显示获得具有不同表型花椰菜材料的创制流程；

图2 显示利用上述获得具有不同表型花椰菜材料方法获得的部分具有不同表型的花椰菜材料。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所有生化试剂、抗生素、Basta等均可在各个生化试剂公司购买；本发明所生化试剂来源见下表：

Figure 2013103973681100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例1

花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种子2h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上（MS无机盐+0.5%琼脂粉），培养条件为24℃，光照时间16h；

农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基（Beef extract 5g/L，Yeast extract 1g/L，Peptone 5g/L，sucrose 5g/L，MgSO₄·7H₂O，pH 7.4），分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=0.8，备用；

农杆菌的遗传转化：

1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第6天时，在无菌条件下将下胚轴切成3-4段，每段大约7mm，平铺放到预培养培养基（MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L）上，进行预培养2d；

（2）侵染：将预培养后的外植体转移到小烧杯中后，加入事先活化的上述菌液中，浸泡30s，期间最好不断的摇晃，让每一个外植体都充分的与菌液接触，结束后将菌液过滤掉，用滤纸把剩余的菌液吸干；

（3）共培养：侵染后的外植体依旧像预培养时一样转移到新的共培养培养基上（成分与预培养相同），共培养时间为2d，且在黑暗条件下进行；

（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基（MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L）上，一周后将Cef浓度减半；

Basta 筛选：将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基（含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L）进行筛选，待不定芽长至2cm时，抗性芽颜色为正常的绿色芽，非转化芽则发白变紫。切下绿色不定芽，转移至生根培养基（含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L）继续筛选并诱导生根；图1显示上述从花椰菜种子萌发至经Basta 抗性筛选的各个阶段。

具不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：在T-DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录性状变化特征。图2显示移栽成活的具有不同表型花椰菜材料的性状变化。其变化的情况如下：

1）与同期正常花椰菜材料相比，叶片数目增多；

2）与同期正常花椰菜材料相比，茎弯曲，匍匐生长；

3）。与同期花椰菜材料相比，茎分支增多，叶片数目增多并呈现锯齿状。

实施例2

一、花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种3h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上，培养条件为26℃，光照时间16h；所述的萌发培养基成分为：MS无机盐+0.5%（w/w）琼脂粉;

二、农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基，分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=1.0，备用；所述的YEB培养基成分为：Beef extract（牛肉膏） 5g/L，Yeast extract（酵母提取物） 1g/L，Peptone（蛋白胨） 5g/L，sucrose（蔗糖） 5g/L，MgSO₄·7H₂O，pH 7.4；

三、农杆菌的遗传转化：

（1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第5天时，在无菌条件下将下胚轴切成4段，每段大约7mm，平铺放到预培养基上，进行预培养2d；所述的预培养基成分为：MS（是各种无机盐的混合物，见《分子克隆实验指南》，科学出版社出版，）+ NAA（萘乙酸）0.1 mg/L+6-BA（6苄基嘌呤）1 mg/L；

（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基上，一周后将Cef（头孢霉素）浓度减半；所述的抑菌培养基成分为： MS+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L

四、Basta 筛选：pSKI015 T-DNA载体上带有Basta抗性基因，因此可用Basta进行抗性筛选，将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基进行筛选，待不定芽长至2cm时，抗性芽颜色为正常的绿色芽，非转化芽则发白变紫，切下绿色不定芽，转移至生根培养基继续筛选并诱导生根；所述的筛选分化培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L；所述的生根培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L；

六、具不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：在T-DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录性状变化特征，其变化的情况如下：

1）与同期正常花椰菜材料相比，茎顶点分生能力更强，形成丛生叶；

2）与同期正常花椰菜材料相比，根系特别是侧根更加发达；

3）与同期正常花椰菜材料相比，花期雄花败育，花期提前。

Claims

1. 采用T-DNA插入技术获得具有不同表型的花椰菜材料的方法，其特征在于它按如下的步骤进行：

一、花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种2h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上，培养条件为24±2℃，光照时间16h；所述的萌发培养基成分为：MS无机盐+0.5%（w/w）琼脂粉；

三、农杆菌的遗传转化：

六、获得花椰菜新材料的生物学性状观察：在T-DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录表型变化特征。