CN101501200A - 病原体抗性改进的植物的产生 - Google Patents

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CN101501200A CNA2007800288712A CN200780028871A CN101501200A CN 101501200 A CN101501200 A CN 101501200A CN A2007800288712 A CNA2007800288712 A CN A2007800288712A CN 200780028871 A CN200780028871 A CN 200780028871A CN 101501200 A CN101501200 A CN 101501200A
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Abstract

本公开涉及由于NMR核酸的表达改变而显示出病原体抗性改变表现型(例如线虫抗性增加)的植物。本发明还涉及病原体抗性改变表现型的植物的产生方法。

Description

病原体抗性改进的植物的产生
与相关申请的交叉引用
本申请要求2006年6月13日提交的美国临时申请No.60/813,662的权益，该临时申请的全文在此引为参考。
背景
由植物病原体引起的感染可以抑制果实、种子、叶和花的产生，并导致收获作物的质量和产量降低，对这种感染的控制具有显著的经济重要性。病原体每年引起全世界作物的危害达到几十亿美元(Baker等1997，Science 276：726-733)。因此，越来越多的研究致力于开发控制植物疾病的新方法。这些研究集中于植物天生抵抗病原体侵袭的能力，以试图加强植物自身的防御力来对抗病原体的攻击(Staskawicz等1995，Science 268：661-667；Baker等，同上)。
尽管大多数作物用农业杀虫剂处理，例如抗真菌和抗细菌剂，但来自病原体感染的危害仍然常规性导致农业产业的收益损失。此外，许多用于控制这类感染或侵袭的药剂对植物和/或对环境造成了不利的副作用。对于病原体感染的抗性增强的植物，将减少或消除对应用化学杀虫剂、抗真菌和抗细菌剂的需要。在开发对宽范围的病原体显示出抗性增加的转基因植物上，已经有了了相当的兴趣(Atkinson等，2003，Annu.Rev.Phytopathol.41：615-639；Williamson和Gleason，2003，Curr.Opin.Plant Biol.，6：327-333；Stuiver和Custers，2001，Nature 411：865-8；Melchers和Stuiver，2000，Curr.Opin.Plant Biol.3：147-152；Rommens和Kishore，2000，Curr.Opin.Biotechnol.11：120-125；Williamson，1999，Curr.Opin.Plant Biol.2：327-331；Mourgues等1998，Trends Biotechnol.16：203-210)。
植物病原性线虫是以植物根为食的小无脊椎动物，造成植物损伤和作物产量降低。在植物的寄生线虫中，异皮科(Heteroderidae)线虫造成经济危害最大(Williamson，1999，Curr.Opin.Plant Biol.2：327-331)。该科的寄生线虫可以分成两类：根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne))和胞囊线虫(胞囊线虫属(Heterodera)和球胞囊线虫属(Globodera))。根结线虫对宿主植物的感染通常导致根瘿或“根结”的形成，并造成许多作物产量的严重损失。相反，胞囊线虫通常具有较窄的宿主范围。拟南芥(Arabidopsis thaliana)可以修改以用于分子遗传学实验，它是为植物-线虫的相互作用提供了解的重要模型，因为它是几种根结和胞囊线虫的宿主(Sijmons等，1991，Plant J.，1：245-254)。
在几个品种的作物中，已经鉴定到许多其异常表达与对线虫的抗性改变有关的基因。例如，番茄的Mi基因赋予了对几个根结线虫种类的抗性(Williamson，1998，Annu.Rev.Phytopathol.36：277-293)。Mi蛋白含有NBS(核苷酸结合位点)和LRR(富亮氨酸的重复)结构域(Kaloshian等，1998，Mol.Gen.Genet.，257：376-385；Milligan等，1998，Plant Cell 10：1307-1319)。甜菜的野生近缘种的Hs1pro-1基因赋予了对胞囊线虫甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)的抗性(Cai等，1997，Science，275：832-834)。Hs1pro-1蛋白含有预测的信号序列、预测的跨膜区和富亮氨酸区域。马铃薯的Gpa2基因赋予了对胞囊线虫马铃薯白线虫(Globodera pallida)的一些分离株的抗性(van der Voort等，1999，Mol.Plant-Microbe Int.，12：187-206；van der Vossen，2000，Plant J.，23：567-576)。番茄的Hero基因赋予了对马铃薯胞囊线虫例如马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫的抗性(Ernst等，2002，Plant J.，31：127-136)。Gpa2和Hero蛋白与Mi蛋白类似，也含有NBS和LRR结构域。最后，小麦的Cre1基因赋予了对大多数欧洲线虫和唯一的澳大利亚致病型的抗性；而小麦的Cre3基因赋予了对澳大利亚线虫的抗性(de Majnik J等，2003，Mol.Plant Microbe Interact.16：1129-1134)。Cre1和Cre3基因还没有被克隆。
由于植物对病原体抗性的重要性，产生的病原体抗性增加的植物的方法是合乎需要的。
发明简述
本公开提供了相对于对照植物来说，对病原体的抗性增加的转基因植物。转基因植物在其基因组中整合(例如稳定地整合)了DNA构建体，该构建体含有编码具有病原体抗性活性的蛋白的核苷酸序列。该核苷酸序列可以是在表3和4的第3列中鉴定的核苷酸序列，或其互补序列；与表3和4的第3列中鉴定的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列；编码的多肽含有表3和4的第4列中鉴定的氨基酸序列的核苷酸序列；或编码的多肽具有与表3和4的第4列中鉴定的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子可操作连接。在某些实施方案中，转基因植物选自油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、红花、油棕、椰子树、亚麻、蓖麻和花生、番茄、胡萝卜、莴苣、蚕豆、芦笋、花椰菜、胡椒、甜菜、卷心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、长黄瓜、甜瓜、豌豆、萝卜、砧木(rootstock)、短黄瓜(
Figure A200780028871D0007145334QIETU
)、倭瓜、西瓜、白皮洋葱、菊苣、黄洋葱、花茎甘蓝、抱子甘蓝、叶葱、芹菜、缬草(mache)、黄瓜、茴香、葫芦、南瓜、甜玉米和小胡瓜。
转基因植物可以如下产生：在植物或其细胞中导入至少一个植物转化载体，所述载体含有核苷酸序列或其变异体，所述核酸序列是表3和4的第4列中鉴定的NMR多肽的编码序列或其互补序列，并使转化的植物或细胞生长以产生转基因植物，其中所述转基因植物表现出对至少一种病原体的抗性增加。在一个实施方案中，NMR多肽与表3和4的第4列中提到的氨基酸序列具有至少大约70％的序列同一性。在其它实施方案中，NMR多肽与表3和4的第4列中提到的氨基酸序列具有至少大约80％或90％的序列同一性(或更高)或具有该氨基酸序列。
提供了产生病原体抗性增加、包括线虫抗性增加的植物的方法，包括鉴定NMR基因改变的植物以及产生该植物的后代，其中所述后代的病原体抗性增加，并且其中NMR基因是在表3和4的第4列中鉴定的基因。还提供了鉴定病原体抗性增加的植物的方法，包括分析来自植物的至少一个NMR基因并鉴定NMR基因改变的植物，其中所述植物的病原体抗性增加。本发明还提供了通过本文描述的方法获得的植物和植物的部分。
序列列表
在随附的序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列，使用37 C.F.R.1.822中定义的标准的核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母编码来显示。每个核酸序列只显示一条链，但是应该理解对于任何所显示的链的引用包含了互补链。在随附的序列列表中：
SEQ ID NO：1和2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATCHX10；单价阳离子：质子反向转运蛋白(ATCHX10)的mRNA(GI18407880|ref|NM_114362.1|)和蛋白(gi|15230551|ref|NP_190079.1)序列。
SEQ ID NO：3和4是拟南芥未知蛋白(AT3G44935)的mRNA(GI|22331603|ref|NM_148843.1|)和蛋白(gi|22331604|ref|NP_680096.1)序列。
SEQ ID NO：5和6是拟南芥未知蛋白(AT3G44940)的mRNA(GI|30692415|ref|NM_114363.2|)和蛋白(gi|30692416|ref|NP_190080.2)序列。
SEQ ID NO：7和8是拟南芥未知蛋白(AT3G44950)的mRNA(GI|18407884|ref|NM_114364.1|)和蛋白(gi|15230556|ref|NP_190081.1)序列。
SEQ ID NO：9和10是拟南芥未知蛋白(AT5G23340)的mRNA(GI|30688921|ref|NM_122240.2|)和蛋白(gi|15237286|ref|NP_197725.1)序列。
SEQ ID NO：11和12是拟南芥未知蛋白(AT5G23350)的mRNA(GI|22327006|ref|NM_122241.2|)和蛋白(gi|15237287|ref|NP_197726.1)序列。
SEQ ID NO：13和14是拟南芥未知蛋白(AT5G23360)的mRNA(GI|42568032|ref|NM_122242.3|)和蛋白(gi|15237288|ref|NP_197727.1)序列。
SEQ ID NO：15和16是拟南芥未知蛋白(AT5G23370)的mRNA(GI|22327007|ref|NM_122243.2|)和蛋白(gi|15237301|ref|NP_197728.1)序列。
SEQ ID NO：17和18是拟南芥未知蛋白(AT5G23380)的mRNA(GI|30688942|ref|NM_122244.2|)和蛋白(gi|15237306|ref|NP_197729.1)序列。
SEQ ID NO：19和20是拟南芥未知蛋白(AT5G23390)的mRNA(GI|30688951|ref|NM_122245.3|)和蛋白(gi|15237309|ref|NP_197730.1)序列。
SEQ ID NO：21和22是拟南芥未知蛋白(AT5G23395)的mRNA(GI|42570036|ref|NM_147906.3|)和蛋白(gi|22327010|ref|NP_680211.1)序列。
SEQ ID NO：23和24是拟南芥ATMKK7；激酶(ATMKK7)的mRNA(GI|18394598|ref|NM_101693.1|)和蛋白(gi|15221060|ref|NP_173271.1)序列。
SEQ ID NO：25和26是拟南芥的催化/水解酶(AT1G18360)的mRNA(GI|30685820|ref|NM_101694.3|)和蛋白(gi|22329651|ref|NP_173272.2)序列。
SEQ ID NO：27和28是拟南芥HIK(HINKEL)；ATP结合/微管发动蛋白(HIK)的mRNA(GI|30685823|ref|NM_101695.3|)和蛋白(gi|22329653|ref|NP_173273.2)序列。
SEQ ID NO：29和30是拟南芥未知蛋白(AT1G18380)的mRNA(GI|18394601|ref|NM_101696.1|)和蛋白(gi|15221762|ref|NP_173274.1)序列。
SEQ ID NO：31和32是拟南芥的ATP结合/激酶/蛋白激酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT1G18390)的mRNA(GI|18394602|ref|NM_101697.1|)和蛋白(gi|15221764|ref|NP_173275.1)序列。
SEQ ID NO：33和34是拟南芥转录因子(AT1G18400)的mRNA(GI|30685839|ref|NM_101698.2|)和蛋白(gi|30685840|ref|NP_173276.2)序列。
SEQ ID NO：35和36是拟南芥ATP结合/蛋白激酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT3G53590)的mRNA(GI|18409867|ref|NM_115219.1|)和蛋白(gi|15231843|ref|NP_190927.1)序列。
SEQ ID NO：37和38是拟南芥核酸结合/转录因子/锌离子结合(AT3G53600)的mRNA(GI|18409871|ref|NM_115220.1|)和蛋白(gi|15231845|ref|NP_190928.1)序列。
SEQ ID NO：39和40是拟南芥的ATRAB8，GTP结合(ATRAB8)的mRNA(GI|42570491|ref|NM_180365.2|)和蛋白(gi|30693873|ref|NP_850696.1)序列。
SEQ ID NO：41和42是拟南芥的ATRAB8，GTP结合(ATRAB8)的mRNA(GI|30693869|ref|NM_115221.2|)和蛋白(gi|15231847|ref|NP_190929.1)序列。
SEQ ID NO：43和44是拟南芥无机二磷酸酶/镁离子结合/焦磷酸酶(AT3G53620)的mRNA(GI|18409875|ref|NM_115222.1|)和蛋白(gi|15231849|ref|NP_190930.1)序列。
SEQ ID NO：45和46是拟南芥未知蛋白(AT3G53630)的mRNA(GI|42565899|ref|NM_115223.4|)和蛋白(gi|22331772|ref|NP_190931.2)序列。
SEQ ID NO：47和48是拟南芥的ATP结合/激酶/蛋白激酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT3G53640)的mRNA(GI|18409886|ref|NM_115224.1|)和蛋白(gi|15231853|ref|NP_190932.1)序列。
SEQ ID NO：49和50是拟南芥的DNA结合(AT3G53650)的mRNA(GI|18409888|ref|NM_115225.1|)和蛋白(gi|15231854|ref|NP_190933.1)序列。
SEQ ID NO：51和52是拟南芥ATOPT2；寡肽转运蛋白(ATOPT2)的mRNA(GI|18391089|ref|NM_100867.1|)和蛋白(gi|15218331|ref|NP_172464.1)序列。
SEQ ID NO：53和54是拟南芥催化(AT1G09932)的mRNA(GI|30681449|ref|NM_179297.1|)和蛋白(gi|30681450|ref|NP_849628.1)序列。
SEQ ID NO：55和56是拟南芥催化(AT1G09935)的mRNA(GI|42570079|ref|NM_148453.2|)和蛋白(gi|42570080|ref|NP_683294.2)序列。
SEQ ID NO：57和58是拟南芥的HEMA2；谷氨酰tRNA还原酶(HEMA2)的mRNA(GI|30681461|ref|NM_100868.2|)和蛋白(gi|15218333|ref|NP_172465.1)序列。
SEQ ID NO：59和60是拟南芥未知蛋白(AT1G09950)的mRNA(GI|30681468|ref|NM_100869.2|)和蛋白(gi|15218335|ref|NP_172466.1)序列。
SEQ ID NO：61和62是拟南芥的SUT4(蔗糖转运蛋白4)；碳水化合物转运蛋白/蔗糖：氢同向转运蛋白/糖转运蛋白(SUT4)的mRNA(GI|30681472|ref|NM_100870.2|)和蛋白(gi|15218362|ref|NP_172467.1)序列。
SEQ ID NO：63和64是拟南芥转录因子(AT1G75250)的mRNA(GI|18410812|ref|NM_106181.1|)和蛋白(gi|15222161|ref|NP_177661.1)序列。
SEQ ID NO：65和66是拟南芥钙调蛋白结合/翻译延伸因子(AT1G07930)的mRNA(GI|30680419|ref|NM_100667.2|)和蛋白(gi|18390829|ref|NP_563800.1)序列。
SEQ ID NO：67和68是拟南芥转录因子(AT1G17880)的mRNA(GIi30685575iref|NM_101651.2|)和蛋白(gi|15220876|ref|NP_173230.1)序列。
SEQ ID NO：69和70是拟南芥未知蛋白(AT1G15270)的mRNA(GI|30684274|ref|NM_101396.2|)和蛋白(gi|18394220|ref|NP_563969.1)序列。
SEQ ID NO：71和72是拟南芥的RNA结合/核酸结合(AT2G37220)的mRNA(GI|30687074|ref|NM_129278.2|)和蛋白(gi|15228102|ref|NP_181259.1)序列。
SEQ ID NO：73和74是拟南芥CSD2(铜/锌超氧化物歧化酶2)；铜、锌超氧化物歧化酶(CSD2)的mRNA(GI|30683800|ref|NM_128379.2|)和蛋白(gi|18401659|ref|NP_565666.1)序列。
SEQ ID NO：75和76是拟南芥苹果酸脱氢酶/氧化还原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42573723|ref|NM_203229.1|)和蛋白(gi|42573724|ref|NP_974958.1)序列。
SEQ ID NO：77和78是拟南芥苹果酸脱氢酶/氧化还原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42568623|ref|NM_125218.3|)和蛋白(gi|30697051|ref|NP_568875.2)序列。
SEQ ID NO：79和80是拟南芥苹果酸脱氢酶/氧化还原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42570606|ref|NM_180883.2|)和蛋白(gi|30697049|ref|NP_851214.1)序列。
SEQ ID NO：81和82是拟南芥LHCB5(光系统II的捕光复合体5)；叶绿素结合(LHCB5)的mRNA(GI|42566395|ref|NM_117102.3|)和蛋白(gi|15235029|ref|NP_192772.1)序列。
SEQ ID NO：83和84是拟南芥HOG1(同源依赖性基因沉默1)；腺苷高半胱氨酸酶(HOG1)的mRNA(GI|30682653|ref|NM_117468.2|)和蛋白(gi|15236376|ref|NP_193130.1)序列。
SEQ ID NO：85和86是拟南芥的AHUS5；泛素结合酶/泛素样活化酶(AHUS5)的mRNA(GI|18410828|ref|NM_115649.1|)和蛋白(gi|15230881|ref|NP_191346.1)序列。
SEQ ID NO87和88是拟南芥DNA结合/转录因子(AT5G54680)的mRNA(GI|30696503|ref|NM_124849.2|)和蛋白(gi|15239706|ref|NP_200279.1)序列。
发明详述
定义
除非另有指明，所有本文使用的技术和科学术语都与本发明技术领域的专业人员所理解的具有同样的意义。对于本技术领域的定义和术语来说，从业者可以特别参考Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(第二版)(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(SecondEdition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)，以及Ausubel FM等，1993，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)。应该理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些是可以改变的。
本文使用的术语“载体”或“转化载体”是指被设计用于不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指有能力在外源细胞中整合并表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核载体，包括示例的表达载体，是可商购的。选择适合的载体属于本技术领域专业人员的知识范畴。
“异源”核酸构建体或序列具有至少一部分序列对于表达它的植物细胞来说不是天然的。对于控制序列来说，异源是指控制序列(例如启动子或增强子)在天然状态下对于调控目前它正调控的同样基因的表达不起作用。一般情况下，异源核酸序列对于它们所存在的细胞或部分天然基因组来说不是内源的，并通过感染、转染、微注射、电穿孔等被加入到细胞中。“异源”核酸构建体可以包含与天然植物中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
本文使用的术语“基因”是指参与生产多肽链的DNA片段，可以包含或可以不包含编码区之前和之后的区域，例如5′非翻译(5′UTR)或“前导”序列和3′UTR或“尾随”序列，以及个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)和不转录的调控序列。
本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。“互补”是指核苷酸序列与给定的核苷酸序列足够互补，使得它可以与该给定的核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。
本文使用的“重组”包括指称已经通过引入异源核酸序列进行修饰的细胞或载体，或从这样修饰的细胞衍生的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(未重组)形式的细胞中没有发现一致形式的基因，或者作为人类特意干预的结果，在表达天然基因时则是表达异常、低表达或完全不表达。
本文使用的术语“基因表达”是指基于基因的核苷酸序列生产多肽的过程。该过程包括转录和翻译，因此，“表达”可以指称多核苷酸或多肽序列，或者二者。有时多核苷酸序列的表达不导致蛋白的翻译。“过表达”是指多核苷酸和/或多肽序列相对于在其野生型(或其它参照物[例如非转基因])植物来说表达增加，并可能涉及天然存在的或非天然存在的序列。“异位表达”是指表达的时间、位置和/或增加的水平并非天然存在于未改变的或野生型植物中的表达。“低表达”是指核苷酸和/或多肽序列、通常是内源基因相对于其在野生型植物中的表达来说表达降低。术语“异常表达”和“改变的表达”包含过表达、低表达和异位表达。
术语“导入”在将核酸序列插入到细胞中的背景中，包括例如“转染”、或“转化”或“转导”，包括指核酸序列掺入到真核或原核细胞中，在细胞中核酸序列可以整合到细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变成自主复制子、或被瞬时表达(例如转染的mRNA)。
本文使用的“植物细胞”是指任何源自于植物的细胞，包括来自未分化组织(例如愈伤组织)以及植物种子、花粉、繁殖芽体和胚胎的细胞。
本文使用的术语“天然的”和“野生型”在涉及给定的植物性状或表现型时，是指同样品种的植物在自然界中发现的性状或表现型形式。
本文使用的术语“修饰的”对于植物性状来说，是指转基因植物相对于类似非转基因植物来说表现型的改变。“目标表现型(性状)”对于转基因植物来说，是指T1和/或随后世代的植物表现的可观察到或可测量的表现型，而该表现型在相应的非转基因植物(例如在类似的条件下栽培或分析的基因型相似的植物)中不表现。目标表现型可以代表植物的改进，或可以提供在其它植物中产生改进的手段。“改进”是通过给植物提供独特的和/或新的品质，可以增加植物物种或品种的用途的特征。
“病原体抗性改变表现型”或“病原体抗性改变”是指遗传修饰的植物与类似的但未修饰的植物相比，对病原性感染的应答的可检测变化。表现型可以在植物自身中看出(例如植物的生长、生存力或特定组织的形态中)，或可以在病原体在植物上增殖和/或感染植物的能力中看出。本文使用的“病原体抗性改进”是指对病原体的抗性增加。测量病原体抗性的方法在本领域是众所周知的。参见，例如，Epple等，Plant Cell，1997，9：509-520；Jach等，Plant J.，1995，8：97-109；Lorito等，Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95：7860-7865；McDowell等，Plant J.，2000，22：523-529.；McDowell等，Mol Plant Microbe Interact.，2005，18：1226-1234；Schweizer等，Plant Physiol.，1993，102：503-511；Simons等，Plant Cell，1998，10：1055-1068；Stein等，Plant Cell，2006，18：731-746，Epub 2006 Feb 2006；Thomma等，Curr Opin Immunol.，2001，13：63-68。因此，“病原体抗性活性”或“病原体抗性”是指在病原体感染过程中生长或存活的能力。
“线虫抗性表现型改变”或“线虫抗性改变”是指遗传修饰的植物与类似的但未修饰的植物相比，对线虫感染的应答的可检测变化。表现型可以在植物自身中看出(例如植物的生长、生存力或特定组织的形态中)，或可以在病原体在植物上增殖和/或感染植物的能力中看出，或这两者中。本文使用的“改进的线虫抗性”是指对线虫的抗性增加。测量线虫抗性的方法在本领域是众所周知的。参见，例如，Cai等，Science，1997，275：832-834；Kaloshian等，Mol Gen Genet.，1998，257：376-385；Milligan等，Plant Cell，1998，10：1307-1319。因此，“线虫抗性活性”或“线虫抗性”是指在线虫感染过程中生长或存活的能力。
本文使用的“突变型”多核苷酸序列或基因与相应的野生型多核苷酸或基因在序列或表达方面不同，其中所述不同促成了修饰的植物表现型或性状。相对于植物或植物种系，术语“突变型”是指具有修饰的植物表现型或性状的植物或植物种系，其中修饰的基因型或性状与野生型多核苷酸序列或基因的修饰的表达相关。
本文使用的术语“T1”是指来自T0植物的种子的植物世代。T1世代是通过使用选择剂例如抗生素或除草剂筛选的第一批转化植物，转基因植物含有针对所述选择剂的相应抗性基因。术语“T2”是指之前被筛选为转基因的T1植物的花通过自花受精产生的植物世代。
本文使用的术语“植物部分”包括任何植物器官或组织，包括但不限于种子、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物细胞可以从任何植物器官或组织以及从它们制备的培养物获得。可用于本公开方法的植物类别总的来说与适合转化技术的高等植物的门类同样广泛，包括单子叶和双子叶植物。
本文使用的“转基因植物”包括指称在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸能够稳定地整合到基因组中，或能够在染色体外。优选本公开的多核苷酸稳定地整合在基因组中，使得多核苷酸传递到后续的世代。其中导入了异源多核苷酸的植物细胞、组织、器官或植物被认为是“转化的”、“转染的”或“转基因的”。也含有异源多核苷酸的转化的植物或植物细胞的直接或间接后代，也被认为是转基因的。
“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白或其生物活性部分，当通过重组技术生产时基本上没有其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物质。优选“分离的”核酸在核酸所源自的生物体的基因组DNA中，没有天然位于核酸侧翼的序列(例如位于核酸的5′和3′末端的序列)(优选蛋白编码序列)。出于本公开的目的，“分离的”当用于指称核酸分子时，除外分离的染色体。例如，在各种不同的实施方案中，分离的NMR核酸分子可以含有少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、在核酸所源自的细胞的基因组DNA中天然位于核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上没有细胞物质的NMR蛋白包括含有的非NMR蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)少于大约30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制备物。
鉴定具有改进的病原体抗性表现型的植物
植物中的激活标签(activation tagging)是指通过将含有调控序列(例如增强子)的异源核酸构建体插入到植物基因组中以产生随机突变的方法。调控序列可作用于增强一个或多个天然植物基因的转录；因此，激活标签法是产生功能获得型、通常是显性突变型的富有成效的方法(参见例如Hayashi等，Science，1992，258：1350-1353；Weigel等，Plant Physiology，2000，122：1003-1013)。插入的构建体为快速鉴定其异常表达产生了突变表现型的天然植物提供了分子标签。激活标签也可以产生功能丧失的表现型。插入可以导致天然植物基因的破坏，在这种情况下表现型一般是隐性的。
激活标签已经使用于各种不同的物种、包括烟草和拟南芥中，以鉴定了许多不同种类的突变表现型以及与这些表现型相关的基因(Wilson等，Plant Cell，1996，8：659-671；Schaffer等，Cell，1998，93：1219-1229；Fridborg等，Plant Cell，1999，11：1019-1032；Kardailsky等，Science，1999，286：1962-1965；Christensen等，2000，Cell 100：469-478)。在一个例子中，激活标签法被用于鉴定疾病抗性改变的突变型(Weigel等，同上)。
拟南芥激活标签(ACTTAG)突变型筛选被用于鉴定负责病原体抗性改变表现型(特别是线虫抗性表现型)的基因[在(下面的)表3和4的第1列中列出的指定NMR#]。
简单来说，正如在实施例中进一步描述的那样，使用pSKI015载体对大量拟南芥植物进行突变，该载体包含来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA、病毒增强子元件以及选择性标记基因(Weigel等，Plant Physiology，2000，122：1003-1013)。当T-DNA插入到转化植物的基因组中时，增强子元件可以导致邻近的、通常在插入位点的大约10千碱基(kb)内的基因上调。将T1植物暴露于选择性药剂中，以便特异性回收表达选择性标记物、因而蕴藏T-DNA插入片段的转化植物。使T1植物生长到成熟期、自体受精并产生种子。收获T2种子、标记并储存。在“正向遗传学”或“反向遗传学”筛选中鉴定显示出对线虫爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)抗性增加的ACTTAG种系。
通过在爪哇根结线虫感染后比较ACTTAG苗和野生型苗的表现型，鉴定显示出对爪哇根结线虫抗性增加的ACTTAG种系。通过分析鉴定的种系中T-DNA插入位点侧翼的基因组DNA序列，发现了NMR基因与病原体抗性表现型之间的关联。因此，NMR基因和/或多肽可用于开发具有修饰的病原体(例如线虫)抗性表现型(“NMR表现型”)的遗传修饰植物。NMR基因可以用于产生对爪哇根结线虫、其它的寄生性根结线虫和其它寄生性线虫(例如寄生性胞囊线虫)感染的抗性增加的作物和/或其它植物物种，并且也可用于产生对真菌、细菌和/或其它病原体的抗性增加的植物。因此，NMR基因的异常表达可能降低了对杀真菌剂和/或杀虫剂的需求。修饰的病原体抗性表现型还可以增强植物的整体健康。
NMR核酸和多肽
在“正向遗传学”激活标签筛选和“反向遗传学”激活标签筛选中发现的NMR基因分别列于表3和4的第1列中。第2列中提供了拟南芥信息源(Arabidopsis Information Resource(TAIR))识别编号。第3-4列分别提供核苷酸和多肽序列的GenBank标识符编号(GI#s)；每个引用的发表序列在此引为2006年6月13日为止的参考。第5列列出了生物化学功能和/或蛋白名称。第6列列出了保守的蛋白结构域。第7列提供了来自其它植物物种的直系同源基因的核酸和多肽序列的GI#s；每个引用的发表序列在此引为本申请提交日期为止的参考。
本文使用的术语“NMR多肽”是指表3和4的第1列中列出的全长NMR蛋白。其“功能活性的”片段、衍生物(变异体)或直系同源物，是指表现出与全长NMR多肽相关的一种或多种或功能活性的蛋白片段、衍生物或直系同源物，也可以用于本文公开的方法或组合物中。“片段”是指NMR蛋白或NMR蛋白的部分氨基酸序列的编码核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码NMR蛋白的生物活性部分、生物活性核酸(例如反义或小抑制性核酸)，或它可以是使用本领域已知的方法能够用作杂交探针或PCR引物的片段。根据目标用途，作为NMR核苷酸序列的片段的核酸分子，含有至少大约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1400、1500、2000、2500、3000个连续核苷酸，或者直至本文公开的全长NMR编码核苷酸序列中存在的核苷酸数量。“连续的”核苷酸或氨基酸是指彼此直接相邻的核苷酸或氨基酸残基。
在一个实施方案中，功能活性NMR多肽当在植物中异常表达时，产生了病原体抗性改变表现型。在另一个实施方案中，功能活性NMR多肽的异常表达导致了对爪哇根结线虫和/或其它寄生性线虫的抗性增加。在另一个实施方案中，功能活性NMR多肽当在植物或植物细胞中表达时，能够拯救内源NMR活性的缺陷(包括缺乏)；拯救多肽可以来自与具有活性缺陷的物种相同或不同的物种。在另一个实施方案中，全长NMR多肽(例如具有NMR多肽或其天然存在的直系同源物的序列的天然多肽)的功能活性片段，保留了与全长NMR多肽相关的一种或多种生物学性质，例如信号传导活性、结合活性、催化活性、或细胞或细胞外定位活性。
术语信号传导活性是指蛋白在诱导植物对病原体攻击的遗传学、生物化学或生理学应答的信号的介导过程中起作用的能力。参见，例如Apel & Hirt，Annu Rev Plant Biol.，2004，55：373-399；Beckers & Spoel，Plant Biol(Stuttg)2006，8：1-10；Chisholm等，Cell，2006，124：803-814；以及Shah，Annu Rev Phytopathol.，2005，43：229-260。
术语结合活性是指蛋白与另一种蛋白、DNA片段或某些其它分子结合的能力(例如Bogdanove，Plant Mol Biol.，2002，50：981-989；Inohara等，Annu Rev Biochem.，2005，74：355-383和Testerink & Munnik，TrendsPlant Sci.，2005，10：368-375)。
术语催化活性是指蛋白催化化学反应的能力。参见，例如：Bhatia等，Crit Rev Biotechnol.，2002，22：375-407；Pedley & Martin，Curr OpinPlant Biol.，2005，8：541-547；Rosahl，Z Naturforsch[C]，1996，51：123-138和Stone & Walker，Plant Physiol.，1995，108：451-457。
术语细胞或细胞外定位活性是指蛋白的部分与细胞的其它成分相互作用，以将蛋白定位到特定的亚细胞或细胞外位置(Crofts等，PlantPhysiol.，2004，136：3414-3419；Matsuoka & Bednarek，Curr Opin PlantBiol.，1998，1：463-469；Rusch & Kendall，Mol Membr Biol.，1995，12：295-307；Schnell & Hebert，Cell，2003，112：491-505)。
NMR片段特别优选包含NMR结构域，例如C-或N-末端或催化结构域，并且可以包含NMR蛋白的至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400或450个连续氨基酸，或者直至本文公开的全长NMR蛋白中存在的氨基酸总数量。NMR基因的代表性功能结构域列于表3和4的第6列中，并可以使用INTERPRO程序(Mulder等，2003Nucleic Acids Res.31，315-318；Mulder等，2005 Nucleic Acids Res.33：D201-D205)鉴定。全长NMR多肽或其片段的功能活性变异体包括具有氨基酸插入、缺失或取代且保留了与全长NMR多肽相关的一种或多种生物学活性的多肽。“保留生物学活性”是指变异体具有至少大约30％、优选至少大约50％、更优选至少大约70％、更加优选至少大约80％的天然蛋白生物学活性，例如抗线虫活性。在某些情况下，产生了NMR多肽的翻译后加工被改变的变异体。例如，与天然多肽相比，变异体可以具有改变的蛋白运输或蛋白定位特性，或改变的蛋白半衰期。
本文使用的术语“NMR核酸”涵盖了具有表3和4的第3列中引用的GenBank条目提供的序列的核酸。与表3和4的第3列中引用的GenBank条目互补的核酸序列，以及其功能活性片段、衍生物或其直系同源物，也可用于本文公开的方法和组合物中。本公开的NMR核酸可以是源自于基因组DNA或cDNA的DNA，或RNA。
在一个实施方案中，功能活性NMR核酸编码或互补于编码功能活性NMR多肽的核酸。在该定义中包括了用作初级RNA转录物(例如mRNA前体)的模板的基因组DNA，该初级RNA转录物在编码功能活性NMR多肽之前需要加工，例如剪接。NMR核酸可以包括其它非编码序列，它们可以转录或可以不转录；这样的序列特别包括5′和3′UTR、多聚腺苷化信号和控制基因表达的调控序列，这是本领域中已知的。某些多肽需要加工事件，例如蛋白水解切割、共价修饰等，以变得完全活化。因此，功能活性核酸可以编码成熟的或加工前的NMR多肽，或中间形式。NMR多肽也可以包含异源编码序列，例如包含编码标记物的序列以便于融合多肽的纯化，或者包含转化标记物。
在另一个实施方案中，功能活性NMR核酸能够用于通过例如反义抑制、共抑制等，产生功能失去病原体抗性表现型。
在本公开的方法中使用的NMR核酸可以包含的核酸序列编码的NMR多肽与表3和4的第4列中引用的GenBank条目的多肽序列具有大约60％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的序列同一性，或为所述核酸序列的互补序列。在另一个实施方案中，本公开的NMR多肽可以包含NMR多肽的保守蛋白结构域，例如在表3和4的第6列中列出的蛋白结构域。在另一个实施方案中，NMR多肽含有的多肽序列与表3和4的第4列中引用的GenBank条目的多肽的功能活性片段具有至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约85％、大约90％或大约95％或更高的序列同一性。在另一个实施方案中，NMR多肽含有的多肽序列在其全长范围内与表3和4的第4列中引用的GenBank条目的多肽序列具有至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％或大约90％同一性，并包含表3和4的第6列中列出的保守蛋白结构域。
在另一个实施方案中，在本公开的方法中使用的NMR核酸序列含有与表3和4的第3列中引用的GenBank条目的核苷酸序列具有至少大约60％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的序列同一性的核酸序列，或与这样的NMR序列或其功能活性片段互补的核酸序列。
本文使用的“序列同一性百分比(％)”对于特定的目标序列或其特定部分来说，定义为候选衍生序列中的核苷酸或氨基酸与目标序列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸一致的百分比，如果需要获得最大的百分序列同一性，则在将序列比对并引入间隙后进行，这通过程序WU-BLAST-2.0a19(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)、将搜索参数设定为缺省值产生。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序本身根据具体序列的组成和针对要搜索的目的序列的具体数据库的组成来建立。“％同一性值”通过用匹配的一致核苷酸或氨基酸的数量除以要报告百分同一性的序列长度来确定。“氨基酸序列相似性百分比(％)”通过进行与确定％氨基酸序列同一性相同的计算来确定，但是在计算中除了一致的氨基酸之外还包含了保守氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，带有β-分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
NMR编码核苷酸序列的“变异体”包括编码本文公开的NMR蛋白、但是由于遗传密码简并性而具有保守差别的序列，以及具有上面讨论的特定序列同一性的序列。例如，优选在一个或多个预测的、优选非必需的氨基酸残基上可以进行保守的氨基酸取代。“非必需”的氨基酸残基是可以从NMR蛋白的野生型序列中改变而不改变生物学活性的残基，而“必需的”氨基酸残基为生物学活性所需。可以在非保守区中进行氨基酸取代而仍保留功能。一般来说，不对保守的氨基酸残基或位于保守基序内的氨基酸残基进行这种取代，因为这些残基为蛋白活性所必需。
目标核酸分子的衍生的核酸分子包括与表3和4的第3列中引用的GenBank条目的核酸序列选择性杂交的序列。杂交的严紧性可以通过杂交和清洗过程中的温度、离子强度、pH和变性剂例如甲酰胺的存在来控制。常规使用条件是众所周知的(参见例如《分子生物学现代方法》，Current Protocol in Molecular Biology，Vol.1，Chap.2.10，JohnWiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，同上)。在某些实施方案中，本公开的核酸分子能够在严紧的杂交条件下与含有表3和4的第3列中引用的GenBank条目的核酸序列的核酸分子杂交，该严紧条件包括：将含有核酸的滤膜(filter)在含有6X单倍强度柠檬酸盐(SSC)(1X SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠；pH7.0)、5X Denhardt′s溶液、0.05％焦磷酸钠和100μg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中，65℃预杂交8小时到过夜；在含有6X SSC、1X Denhardt′s溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠的溶液中65℃杂交18-20小时；以及在含有0.2X SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中65℃清洗滤膜1小时。在其它实施方案中，使用了中度严紧的杂交条件，包括：将含有核酸的滤膜在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％菲可(Ficoll)、1％BSA和500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中，40℃预处理6小时；在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可、0.2％BSA、100μg/ml鲑鱼精子DNA和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖的溶液中，40℃杂交18-20小时；然后在含有2X SSC和0.1％SDS的溶液中55℃清洗1小时，共清洗两次。可选使用低严紧条件，包括：在含有20％甲酰胺、5 x SSC、50mM磷酸钠(pH7.6)、5XDenhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切过的鲑鱼精子DNA的溶液中，37℃温育8小时到过夜；在同样的缓冲液中杂交18到20小时；以及在1 x SSC中于大约37℃清洗滤膜1小时。
作为遗传密码简并的结果，可以产生许多编码NMR多肽的多核苷酸序列。例如，可以按照具体宿主生物体确定的最适密码子用法(参见例如Nakamura等，1999，Nucleic Acids Res.，27：292)选择密码子，以增加在该具体宿主物种中发生的多肽表达的速度。这样的序列变异体可用于本公开的方法中。
本公开的方法可以使用拟南芥NMR基因的直系同源物。每个拟南芥NMR基因的直系同源物的例子鉴定在表3和4的第7列中。在其它植物物种中鉴定直系同源物的方法在本领域中是已知的。通常，由于存在一个或多个蛋白基序和/或三维结构，不同物种中的直系同源物保留了同样的功能。在进化中，当在物种形成后发生基因复制事件时，一个物种例如拟南芥中的单个基因可以对应于另一个物种中的多个基因(旁系同源物)。本文使用的术语“直系同源物”涵盖了旁系同源物。当特定植物物种有可用的序列数据时，一般使用蛋白诱饵序列通过序列同源性分析例如BLAST分析来鉴定直系同源物。如果来自正向BLAST结果的最佳命中序列在反向BLAST中检索到了原始的查询序列，则序列被指定为潜在的直系同源物(MA和Bork P，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：5849-5856；Huynen MA等，Genome Research(2000)10：1204-1210)。用于多序列比对的程序例如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res.22：4673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守区域和/或残基，并产生系统发生树。在代表来自多样物种的多个同源序列(例如通过BLAST分析检索到的)的系统发生树中，来自两个物种的直系同源序列，对于来自这两个物种的所有其它序列来说，通常显得在树上最接近。蛋白折叠的结构穿引(structural threading)或其它分析(例如使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的软件)也可以识别潜在的直系同源物。核酸杂交方法也可用于发现直系同源基因，并且当没有序列数据可用时是优选的。简并PCR和cDNA或基因组DNA文库筛选是发现相关基因序列的常用方法，在本领域是众所周知的(参见，例如Sambrook，同上；Dieffenbach和Dveksler主编的《PCR引物：实验室手册》，PCR Primer：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，1989)。例如，从目标植物物种产生cDNA文库以及用部分同源的基因探针探测文库的方法，描述在Sambrook等，同上中。拟南芥NMR编码序列的高度保守部分可以用作探针。在高度、中度或低度严紧条件下，NMR直系同源核酸可以与表3和4的第3列中引用的GenBank条目的核酸杂交。在扩增或分离推定的直系同源物片段后，可以通过标准技术对该片段进行克隆和测序，并用作探针来分离完整的cDNA或基因组克隆。或者，可以启动EST工程，为目标植物物种产生序列信息的数据库。在另一种方法中，特异性结合已知NMR多肽的抗体被用于直系同源物分离。Western印迹分析可以确定特定植物物种的粗提取物中存在NMR直系同源物(例如直系同源蛋白)。当观察到反应性时，可以通过筛选代表特定植物物种的表达文库来分离编码候选直系同源物的序列。表达文库可以按照Sambrook等，同上中的描述，构建到各种不同的可商购载体中，包括λgt11。一旦通过这些方法的任何一种鉴定到候选直系同源物后，使用候选直系同源序列作为诱饵(“查询”)，用于针对拟南芥或其中已经鉴定到NMR核酸和/或多肽序列的其它物种的序列进行反向BLAST。
NMR核酸和多肽可以使用任何可用的方法来获得。例如，以前描述的通过筛选DNA文库或通过使用聚合酶链反应(PCR)来分离目标cDNA或基因组DNA序列的技术，在本领域是众所周知的。或者，可以合成核酸序列。任何已知的方法，例如位点定向诱变(Kunkel TA等，1991，Methods Enzymol.，204：125-39)或PCR介导的诱变，可用于在克隆的核酸中导入所需的改变。
总的来说，本公开的方法涉及将所需形式的NMR核酸引入用于转化植物细胞的植物表达载体中，以及在宿主植物中表达NMR多肽。
产生具有病原体抗性表现型的遗传修饰植物
NMR核酸和多肽可用于产生具有修饰的病原体抗性表现型的遗传修饰植物；一般来说，关注的是抗性改进的表现型。在一个实施方案中，NMR基因在植物中的表达改变被用于产生对根结线虫抗性增加的植物。在其它实施方案中，异常表达NMR的植物也可以表现出对寄生线虫病原体的抗性改变，这些寄生线虫病原体包括但不限于根结线虫(Meloidogyne spp.)、胞囊线虫(Heterodera spp.)、球胞囊线虫(Globodera spp.)、珍珠线虫(Nacobbus spp.)、刺线虫(Belonolaimusspp.)、轮线虫(Criconemoides spp.)、螺旋线虫(Helicotylenchus spp.)、剑线虫(Xiphinema spp.)、长针线虫(Longidorus spp.)、短体线虫(Pratylenchus spp.)、拟毛刺线虫(Paratrichodorus spp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus spp.)、茎线虫(Ditylenchus spp.)、纽带线虫(Hoplolaimus spp.)和肾状线虫(Rotylenchulus spp.)。还关注对真菌病原体的抗性增加。真菌病原体包括但不限于芸薹生链格孢(Alternariabrassicicola)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、二孢白粉菌(Erysiphecichoracearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、根肿菌(Plasmodiophora brassica)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、刺盘孢菌(Colletotrichum coccode)、核盘菌(Sclerotinia spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Penicillium spp.)、黑粉菌(Ustilago spp.)和腥黑菌(Tilletia spp.)。关注的细菌病原体包括但不限于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、黄瓜欧文氏菌(Erwinia tracheiphila)、玉米欧文氏菌(Erwinia stewartii)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonasphaseoli)、梨欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、丁香假单孢菌(Pseudomonas syringae)、天竺葵(Pelargonium spp.)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、草莓黄单胞菌(Xanthomonasfragariae)、李假单胞菌(Pseudomonasmorsprunorum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。病原性感染可以影响种子、果实、花、叶、茎、块茎、根等。因此，抗性可以在植物的任何部分中观察到。
本文描述的方法一般来说可用于所有植物，因为NMR基因(或其直系同源物、变异体或片段)可以在任何类型的植物中表达。在某些实施方案中，本公开针对作物，例如玉米、大豆、棉花、水稻、小麦、大麦、番茄、油菜(canola)、草坪草和亚麻。其它的作物包括苜蓿、烟草和其它饲料作物。本公开也特别涉及产水果或蔬菜的植物，包括番茄、胡萝卜、莴苣、蚕豆、芦笋、花椰菜、胡椒、甜菜、卷心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、长黄瓜、甜瓜、豌豆、萝卜、砧木、短黄瓜(
Figure A200780028871D0007145334QIETU
)、倭瓜、西瓜、白皮洋葱、菊苣和黄洋葱、叶葱、花茎甘蓝、抱子甘蓝、芹菜、缬草、黄瓜、茴香、南瓜、甜玉米和小胡瓜，在插花业中使用的植物、产谷物植物、产油植物以及产坚果植物等。
专业技术人员将会认识到，在本领域中存在广泛多样的转化技术，并且新的技术层出不穷。任何适合靶宿主植物的技术都可以在本公开的范围内运用。例如，构建体可以以各种形式导入，包括但不限于作为DNA链、在质粒中或在人工染色体中。将构建体导入靶植物细胞可以通过各种技术来完成，包括但不限于异源核酸的土壤杆菌介导的转化、电穿孔、微注射、微粒轰击、磷酸钙-DNA共沉淀、或脂质体介导的转化。植物的转化优选为永久性的，即将导入的表达构建体整合到宿主植物基因组中，使得导入的构建体传递到后续的植物世代。根据所计划的应用，含有NMR多核苷酸的异源核酸构建体可以编码完整的蛋白或其生物活性部分。
在一个实施方案中，基于Ti的二元载体系统可用于转移多核苷酸。标准的土壤杆菌二元载体对于本领域的专业人员来说是已知的，并有许多可以商购(例如pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。
用土壤杆菌载体转化植物的最适步骤将随着被转化的植物类型而变化。土壤杆菌介导的转化的示例性方法包括转化从无菌幼苗和/或小植株衍生的下胚轴的外植体、芽尖、茎或叶组织。这样转化的植物可以有性繁殖，或通过细胞或组织培养。以前已经描述了对大量不同类型植物的土壤杆菌转化，这种转化的方法可以在科学文献中找到。其中特别相关的是转化具有商业重要性的作物的方法，例如玉米(Fromm等，Biotechnology，1990，8：833-839；Ishida等，1996，NatureBiotechnology 14：745-750)、油菜籽(De Block等，1989，Plant Physiol.，91：694-701)、向日葵(Everett等，1987，Bio/Technology，5：1201)和大豆(Christou等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，86：7500-7504，1989；Kline等，1987，Nature，327：70)。
NMR基因的表达(包括转录和翻译)可以根据表达水平、发生表达的组织类型和/或表达的发展阶段来进行调控。许多异源调控序列(例如启动子和增强子)可用于控制NMR核酸的表达。它们包括组成型、诱导型和调控型启动子，以及以组织-或时间-特异性方式控制表达的启动子和增强子。示例的组成型启动子包括E4启动子(美国专利No.5,783,393和5,783,394)、35S CaMV(Jones JD等，1992，Transgenic Res.，1：285-297)、CsVMV启动子(Verdaguer B等，1998，Plant Mol.Biol.，37：1055-1067)和甜瓜肌动蛋白启动子(公布的PCT申请WO00/56863)。示例的组织特异性启动子包括番茄E4和E8启动子(美国专利No.5,859,330)和番茄2AII基因启动子(Van Haaren MJJ等，1993，Plant Mol.Biol.，21：625-640)。在一个实施方案中，NMR基因表达在病原体诱导型启动子的控制之下(Rushton等，2002，The Plant Cell，14：749-762)。在一个实施方案中，NMR基因的表达处于来自其表达与CsVMV启动子相关的基因的调控序列的控制之下。
另一方面，可能希望在宿主细胞中抑制内源NMR基因的表达。用于实践本公开的这个方面的示例性方法包括但不限于反义抑制(Smith，等，1988，Nature，334：724-726；van der Krol等，1988，Biotechniques，6：958-976)、共抑制(Napoli等，1990，Plant Cell，2：279-289)、核酶(PCT公布WO97/10328)以及正义和反义的组合(Waterhouse等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：13959-13964)。用于在宿主细胞中抑制内源序列的方法一般利用待抑制的序列的至少一部分的转录或转录和翻译。这样的序列可以与内源序列的编码区和非编码区同源。反义抑制可用于完整cDNA序列(Sheehy等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8805-8809)、包含5′编码序列(Cannon等，1990，Plant Mol.Biol.，15：39-47)或3′非编码序列(Ch′ng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：10006-10010)片段的部分cDNA序列。共抑制技术可用于完整cDNA序列(Napoli等，同上；van der Krol等，1990，The Plant Cell，2：291-299)或部分cDNA序列(Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics，224：477-481)。
可以进行标准的分子和遗传测试，以进一步分析基因和观察到的表现型之间的关联。示例的技术在下面描述。
1.DNA/RNA分析
可以通过例如原位杂交来测定突变型对野生型种系中阶段和组织特异性基因的表达形式。可以进行基因、特别是侧翼调控区的甲基化状态分析。其它适合的技术包括过表达、异位表达、在其它植物物种中表达和基因敲除(反向遗传学，定向敲除，病毒诱导的基因沉默(VIGS)(参见Baulcombe，1999，Arch.Virol.Suppl.15：189-201))。
在代表性的应用中，通常通过微阵列分析进行的表达情况分析(express profiling)，被用于同时测量许多不同基因表达中的差异或被诱导的变化。用于微阵列分析的技术在本领域是众所周知的(参见，例如Schena等，1995，Science，270：467-470；Baldwin等，1999，Cur.Opin.Plant Biol.，2(2)：96-103；Dangond，2000，Physiol.Genomics，2：53-58；vanHal NL等，2000，J.Biotechnol.，78：271-280；Richmond和Somerville，2000，Cur.Opin.Plant Biol.，3：108-116)。可以进行个体被标签的种系的表达情况分析。这种分析可以鉴定作为目的基因过表达的结果而被协同调控的其它基因，这将有助于未知基因放置到特定途径中。
2.基因产物分析
基因产物分析可以包括重组蛋白表达、抗血清的生产、免疫定位、催化或其它活性的生物化学分析、磷酸化状态分析，以及通过酵母双杂交分析与其它蛋白的相互作用分析。
3.途径分析
途经分析可以包括根据基因的异常表达表现型或与相关基因的序列同源性，将基因或基因产物放置在特定生物化学、代谢或信号传导途径中。或者，分析还可以包括与野生型种系和其它突变型种系进行遗传杂交(产生双重突变型)，以将基因在途径中排序，或确定突变对途径中下游“报告”基因表达的影响。
产生具有病原体抗性表现型的突变植物
本公开还提供了病原体抗性增加的植物、特别是在赋予这些抗性的内源NMR基因中具有突变的植物的鉴定方法。该方法包括从植物种群中分析至少一个NMR基因，并鉴定具有改变的(例如突变的)NMR基因的植物。NMR基因可以具有赋予病原体抗性的突变，或者它与野生型植物相比可以具有表达改变。可以产生这些没有被遗传修饰的植物的病原体抗性后代。产生和鉴定具有赋予病原体抗性的突变的植物的方法在本领域中是已知的。在一种被称为“TILLING”(在基因组中靶定诱导的局部损伤(targeting induced locallesions in genomes))的方法中，例如使用EMS处理在目标植物的种子中诱导突变。使获得的植物生长并自体受精，将后代用于制备DNA样品。使用NMR基因的PCR扩增和测序来鉴定突变的植物是否在NMR基因中具有突变。然后可以测试具有NMR突变的植物的病原体抗性，或者可选地，可以测试植物的病原体抗性，然后使用NMR基因的PCR扩增和测序来确定病原体抗性增加的植物是否具有突变的NMR基因。TILLING能够鉴定可以改变特定基因的表达或这些基因编码的蛋白的活性的突变(参见Colbert等，2001，Plant Physiol.126：480-484；McCallum等，2000，NatureBiotechnology 18：455-457)。
在另一种方法中，可以在标记物辅助的育种程序中使用候选基因/数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)方法来鉴定NMR基因或NMR基因的直系同源物中可以赋予病原体抗性的突变(参见Foolad等，Theor.Appl.Genet.，2002，104(6-7)：945-958；Rothan等，2002，Theor.Appl.Genet.，105(1)：145-159；Dekkers和Hospital，2002，Nat.Rev.Genet.，3：22-32)。因此，在本公开的另一方面，NMR核酸被用于鉴定病原体抗性植物是否在内源NMR基因中具有突变，或具有引起病原体抗性表现型的特定等位基因。
尽管已经参考具体的方法和实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，在不背离本发明之下可以进行各种不同的修饰和改变。所有本文引用的出版物，出于描述和公开可以与本发明关联使用的组合物和方法的目的，在此明确地引为参考。所有引用的专利、专利申请以及参考的公共数据库中的序列信息(到本申请提交之日为止)，也引为参考。
实施例
实施例1
通过用激活标签构建体转化而产生具有病原体抗性表现型的植物
使用激活标签(ACTTAG)载体pSKI015(GI 6537289；Weigel D等，同上)产生突变体。使用标准方法产生拟南芥转基因植物，该方法基本上按照公布的申请PCT WO01/83697中的描述。简单来说，用带有pSKI015载体的土壤杆菌转化T0拟南芥(Col-0)植物，该载体含有源自土壤杆菌Ti质粒的T-DNA、除草剂抗性选择标记基因、以及4X CaMV 35S增强子元件。在T1代根据除草剂抗性筛选转基因植物。从T1植物收集T2种子，并储存为编目的收集物，一部分T2种子进行正向遗传筛选。将T3种子用于反向遗传筛选。将T2种子播种于土壤中，将植物暴露于除草剂以杀死缺少ACTTAG载体的植物。将T2植物生长至成熟期，使其自体受精和结籽。对于每个种系大量收获T3种子(来自T2植物)，对一部分T3种子进行反向遗传筛选(参见下文)。
使用T3种子通过反向PCR确定ACTTAG元件在每个种系的基因组中的位置。使用基本BLASTN搜索和/或搜索拟南芥信息源(TAIR)数据库(可以在arabidopsis.org网站上获得)，对PCR产物进行序列分析和基因组定位。在反向遗传筛选中考虑了38,090个具有回复的侧翼序列的种系。
实施例2
对线虫爪哇根结线虫具有抗性的种系的正向遗传筛选
正向遗传筛选作为初级和次级筛选进行。在初级筛选中，将大约8颗来自拟南芥ACTTAG收集物的种系的T2种子和2颗来自野生型Col-0的种子种植在土壤中。种子在4℃砂藏2天，然后在25℃和60-70％相对湿度的生长箱中，以10小时光照和14小时黑暗的短日照周期生长8天。在每棵秧苗周围的土壤中接种5000个线虫爪哇根结线虫的卵，使植物再生长20-25天。然后将每棵植物从土壤中取出并评估线虫引起的应激。任何不显示应激的植物种系被交付进一步分析。
在次级筛选中，将大约40颗T2种子与野生型Col-0种子一起种植。植物的生长与接种线虫卵与初级筛选中相同。在接种后20-25天对植物进行应激评估。令至少有一棵植物没有显示应激的所有种系再生长5周。这之后，将植物从土壤中取出，清洗根系，对植物在根系上发现的根结进行评估。如果在植物在其根系上的结少于20个，则被评定为有抗性。
作为这些分析的结果，48个ACTTAG种系被鉴定为对线虫爪哇根结线虫具有抗性。
实施例3
显示出线虫抗性表现型的植物中T-DNA插入片段的表征： ACTTAG基因座数目测定和ACTTAG拷贝数测定
因为ACTTAG种系可能在超过一个遗传基因座具有插入片段，因此在实施例2鉴定的每个种系中评估了含有ACTTAG插入片段的遗传基因座数目。在T1植物中，ACTTAG插入片段以半合子状态存在(也就是说，它们以插入到二倍体植物基因组两个拷贝中的一个的形式存在)。由于遗传分离，在T2植物中每个含有ACTTAG插入片段的遗传基因座的存在比率为3:1；75％的T2植物在该基因座具有ACTTAG插入片段，25％没有。如果T1植物在独立分离性基因座含有两个ACTTAG元件，则含有任何ACTTAG元件的T2植物的数量将是87.5％，12.5％的植物将不含有插入片段。因为每个ACTTAG元件含有赋予对除草剂BASTA抗性的基因，因此可以通过测定对BASTA具有抗性的T2植物的百分率来估算含有ACTTAG元件的遗传基因座的数量。
为了确定每个种系中带有ACTTAG插入片段的遗传基因座的数量、对选择性药剂具有抗性的T2植物的比率，将50-100颗T2种子播种在土壤中，使其发芽，并记录萌发的T2秧苗的数量。在2周时间内对T2秧苗6次喷洒60mg/L除草剂BASTA，以杀死缺少ACTTAG插入片段的植物。测定BASTA抗性T2秧苗的数量，并计算BASTA抗性植物的百分率。有60-80％的BSATA抗性T2秧苗的种系估计其在单一遗传基因座上带有ACTTAG插入片段。有超过80％的BASTA抗性T2秧苗的种系估计其在超过一个遗传基因座上带有ACTTAG插入片段。
因为每个遗传基因座可以含有一个以上插入片段，因此估算了实施例2鉴定的每个种系中ACTTAG元件的数量。为了确定每个种系中存在的ACTTAG插入片段的数量，使用了基于TaqMan
Figure A200780028871D0036150100QIETU
聚合酶链反应(PCR)方法，使用TaqMan
Figure A200780028871D0036150100QIETU
 Universal PCR master Mix(AppliedBiosystems)和ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)。简单来说，从至少18株T2秧苗的并集中分离基因组DNA。使用ACTTAG种系的DNA作为模板，在反应混合物中同时进行两个PCR反应。一个PCR反应使用特异性针对BAR基因的PCR引物，检测了BAR基因的存在，该基因赋予了对除草剂草铵膦的抗性。另一个PCR反应使用特异性针对ELF3基因的PCR引物，检测了拟南芥ELF3基因的存在。在反应过程中积累的两个PCR产物的相对量被用于确定ACTTAG拷贝数。
根据这些分析，选择了5个ACTTAG种系进行进一步分析(参见实施例4)。对这些种系的ACTTAG基因座数估算值和ACTTAG拷贝数估算值显示在下面的表1中。
表1.5个线虫抗性种系的ACTTAG基因座数估算值和ACTTAG拷贝数估算值。
Figure A200780028871D00361
实施例4
显示出线虫抗性表现型的植物中T-DNA插入片段的表征：确定 ACTTAG在拟南芥基因组中的插入位点
质粒拯救(Weigel等，同上)和/或反向PCR(iPCR；Triglia等，1988，Nucleic Acid Res.，16：8186)被用于回收在正向遗传筛选中鉴定的种系的T-DNA插入片段侧翼的拟南芥基因组DNA。通过DNA测序对这些分析的产物进行了分析，并将序列对Exelixis数据库或拟南芥信息源(TAIR)数据库(可以在arabidopsis.org网站获得)中的拟南芥基因组进行基本BLASTN搜索。NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5中ACTTAG的位置描述如下。
NMR1：ACTTAG插入片段的右边界刚好位于拟南芥DNA染色体3，BAC克隆F14D17(>gi|7671394|emb|AL353992.1|ATF14D17)的～5042位核苷酸的上游。该插入片段的另一侧被确定为左边界，刚好位于拟南芥DNA染色体3，BAC克隆F14D17(>gi|7671394|)的～5042位核苷酸的下游。
NMR2：ACTTAG插入片段的左边界刚好位于拟南芥基因组DNA，染色体5，BAC克隆：T32G24(>gi|4589451|dbj|AB025642.1|AB025642)的～931位核苷酸的上游。
NMR3：ACTTAG插入片段的左边界刚好位于拟南芥基因组DNA，染色体1，BAC克隆：F15H18(>gi|6684172)的～51143位核苷酸的下游。另一侧是左边界，刚好位于拟南芥DNA染色体1，BAC克隆：F15H18(>gi|6684172)的～51333位核苷酸的上游。
NMR4：ACTTAG插入片段的左边界刚好位于拟南芥基因组DNA染色体3，BAC克隆：F4P12(>gi|6434215)的～120310位核苷酸的上游。另一侧是左边界，刚好位于拟南芥DNA染色体3，BAC克隆：F4P12(>gi|6434215)的～120307位核苷酸的下游。
NMR5：ACTTAG插入片段的右边界刚好位于拟南芥基因组DNA，染色体1，BAC克隆：F21M12(>gi|2160155)的～126494位核苷酸的上游。另一侧是右边界，刚好位于拟南芥基因组DNA染色体1，BAC克隆：F21M12(>gi|2160155)的～126507位核苷酸的下游。
实施例5
候选基因在表现出病原体抗性改变表现型的ACTTAG植物中的 鉴定和表达分析
线虫抗性种系中，翻译起始密码子位于ACTTAG插入片段的大约10kbp内的基因，被认为位于“激活空间”内。由于ACTTAG插入片段中的4X CaMV 35S增强子元件，这些候选基因的表达在线虫抗性种系中可能被上调。ACTTAG种系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候选基因列于表2的第2列中。
在conviron箱中10小时光照14小时黑暗周期下生长的30日龄BASTA抗性T2植物的叶片中，分析这些候选基因的表达改变。在同样平台中、因而在同样环境条件下生长的野生型植物用作对照，进行SYBR绿色染料实时定量RT-PCR分析。具体来说，从来自表现出病原体抗性表现型的植物和野生型COL-0植物的组织中提取RNA。使用特异性针对具有表2第3列中显示的序列ID的基因和针对组成型表达的肌动蛋白基因(ACT2，阳性对照)的引物，进行了SYBR绿色染料实时定量RT-PCR。ACTTAG种系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候选基因的表达分析结果显示在表2的第5列中。
表2.ACTTAG种系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候选基因的表达分析
 
1.别名 2.TAIRID 3.核酸序列GI# 4.生物化学功能/蛋白名称 5.在ACTTAG种系中与Col-0相比的表达分析
NMR1 A At3g44930 gi|18407880 阳离子/氢交换蛋白 不可检测
NMR1 B At3g44935 gi|22331603 假设的蛋白 不可检测
NMR1 C At3g44940 gi|30692415 表达蛋白预测的蛋白 无变化
NMR1 D At3g44950 gi|18407884 富含甘氨酸的蛋白 不可检测
NMR2 A At5g23340 gi|30688921 与葡萄糖调控阻遏蛋白类似的表达蛋白 无变化
NMR2 B At5g23350 gi|22327006 ABA响应蛋白 无变化
NMR2 C At5g23360 gi|42568032 ABA响应蛋白 无变化
NMR2 D At5g23370 gi|22327007 ABA响应蛋白 无变化
NMR2 E At5g23380 gi|30688942 表达的蛋白 无变化
NMR2 F At5g23390 gi|30688951 表达的蛋白 无变化
NMR2 G At5g23395 gi|42570036 表达的蛋白 无变化
NMR3 A At1g18350 gi|18394598 有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶(MAPKK) 无变化
NMR3 B At1g18360 gi|30685820 水解酶 无变化
NMR3 C At1g18370 gi|30685823 驱动蛋白重链同构体 无变化
NMR3 D At1g18380 gi|18394601 假设的蛋白 无变化
NMR3 E At1g18390 gi|18394602 蛋白激酶 无变化
NMR3 F At1g18400 gi|30685839 螺旋-环-螺旋蛋白同系物 无变化
NMR4 A At3g53590 gi|18409867 富含亮氨酸重复的跨膜蛋白激酶，推定的CLV1受体 无变化
NMR4 B At3g53600 gi|18409871 锌指样蛋白Zat11锌指蛋白 无变化
NMR4 C At3g53610 gi|42570491 Ras相关的GTP结合蛋白 无变化
NMR4 D At3g53620 gi|18409875 无机焦磷酸酶相关蛋白无机焦磷酸酶 无变化
NMR4 E At3g53630 gi|42565899 表达蛋白预测的蛋白 无变化
NMR4 F At3g53640 gi|18409886 蛋白激酶 不可检测
NMR4 G At3g53650 gi|18409888 组蛋白H2B，推测类似于番茄(Lycopersiconesculentum)的组蛋白H2B 无变化
NMR5 A At1g09930 gi|18391089 类似于粟酒裂殖酵母(S.pombe)ISP4(gb|D83992)的假设蛋白 在NMR5ACTTAG种系中上调3倍
NMR5 B At1g09932 gi|30681449 表达的蛋白 在NMR5ACTTAG种系中上调2倍
NMR5 C At1g09935 gi|42570079 ZW10相关蛋白 在NMR5ACTTAG种系中上调2倍
NMR5 D At1g09940 gi|30681461 谷氨酰-tRNA还原酶2(GluTR)(HEMA2) 在NMR5ACTTAG种系中上调10倍
NMR5 E At1g09950 gi|30681468 与Nicotiana肿瘤相关蛋白(gb|26453)相似的表达蛋白 在NMR5ACTTAG种系中上调81倍
NMR5F At1g09960 gi|30681472 蔗糖转运蛋白SUT4(蔗糖-质子同向转运蛋白) 无变化
实施例6
拟南芥NMR序列的分析
使用BLAST(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)、PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res.27：260-262)和/或INTERPRO(Mulder等，2003 Nucleic Acids Res.31，315-318；Mulder等，2005Nucleic Acids Res.33：D201-D205)进行NMR序列分析。这些分析的结果列于表3中。
表3.在正向遗传筛选中鉴定的拟南芥NMR序列的分析
Figure A200780028871D00411
Figure A200780028871D00421
Figure A200780028871D00431
Figure A200780028871D00451
Figure A200780028871D00461
Figure A200780028871D00471
实施例7
使用“反向遗传学”筛选鉴定拟南芥线虫抗性基因
使用“反向遗传学”筛选来鉴定拟南芥线虫抗性(NMR)基因。在该方法中，拟南芥基因被当作候选线虫抗性基因。为了确定这些基因的异常表达是否引起线虫抗性表现型，从实施例1中描述的放置了FST的38,090个ACTTAG种系中，鉴定了在这些基因的翻译起始密码子的9kbp内(“激活空间”)具有预测的CaMV 35S增强子元件的ACTTAG种系。按照实施例2中的描述对在候选基因附近具有插入片段的ACTTAG种系进行了线虫(爪哇根结线虫)抗性表现型评估。在11个候选基因的“激活空间”内含有ACTTAG插入片段的ACTTAG种系被确定对线虫有抗性。这些基因列于表4中。
PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res.27：260-262)和/或INTERPRO(Mulder等，2003 Nucleic Acids Res.31，315-318；Mulder等，200 5Nucleic Acids Res.33：D201-D205)分析的结果显示在表4中。
表4.在反向遗传筛选中鉴定的拟南芥NMR序列的分析
Figure A200780028871D00491
Figure A200780028871D00501
Figure A200780028871D00511
Figure A200780028871D00521
实施例8
线虫抗性表现型的再现
对正向和反向遗传筛选中鉴定的基因进行测试，以鉴定直接的过表达是否可以赋予对线虫的抗性。为此，将表3和4的第2列中列出的基因克隆到植物转化载体中组成型CsVMV启动子的后面，并使用花浸泡方法转化到拟南芥植物中。植物转化载体含有RE4启动子发动的选择性标记物的编码基因，以提供对细胞毒性药剂的抗性，并用作选择性标记物。将来自转化植
物的种子放在含有细胞毒性药剂的琼脂培养基上。10天后，转基因植物被鉴定为健康的绿色植物，并移植到土壤中。非转基因的对照植物在琼脂培养基上发芽，使其生长10天，然后移植到土壤中。从含有每种构建体的20个初级转化子收集T2种子。
在重复实验中测试T2植物对线虫的抗性。在每个实验中，将来自转基因事件的大约13个T2种子种植在10行盘的土壤中。每个盘中8行种有8个转基因种系(每行一个事件)，2行种有野生型Col-0种子；对含有Col-0的1行进行接种并用作阴性对照，另一行不接种而用作阳性对照。种子在4℃砂藏2天，然后在25℃和60-70％相对湿度的生长箱中，以10小时光照和14小时黑暗的短日照周期生长8天。在每棵转基因秧苗和用作阴性对照的Col-0植物周围的土壤中接种5000个线虫爪哇根结线虫的卵，使植物再生长40-50天。这时将植物从土壤中取出，清洗根系并记录每棵植物的根结数量。建立评分系统来比较每棵植物上根结的数量。有0到5个根结的植物给分为1，6到10个根结的植物给分为2，11到15个根结的植物给分为3，16到20个根结的植物给分为4，超过20个根结的植物给分为5。一般来说，如果植物的根结少于20个，它被评定为有抗性。每个抗性植物(根结少于20个)根据其根系上根结的数量打分。表5中的基因显示了阳性再现结果。
表5
 
TAIR ID 别名 克隆名称
At1g18350 NMR3-A pNT-4581
At3g53620 NMR4-D pNT-4590
At1g09960 NMR5-F pNT-4599
At1g07930 NMR1002 pNT-4942
At1g15270 NMR1004 pNT-4944
At2g37220 NMR1005 pNT-4945
At4g10340 NMR1008 pNT-4948
At4g13940 NMR1009 pNT-4949
实施例9
At1g18350过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At1g18350表达，测试了At1g18350(NMR3-A)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于5个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表6显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表6
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR3-A 4581-04 0.000 4.33 4.89
NMR3-A 4581-13 0.007 4.70 4.98
NMR3-A 4581-14 0.017 4.78 4.98
NMR3-A 4581-15 0.005 4.66 5.00
NMR3-A 4581-17 0.000 4.55 4.98
实施例10
At3g53620过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At3g53620表达，测试了At3g53620(NMR4-D)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于7个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表7显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表7
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR4-D 4590-1 0.0183 4.90 5.00
NMR4-D 4590-12 0.0001 4.68 5.00
NMR4-D 4590-20 0.0127 4.84 5.00
NMR4-D 4590-22 0.0256 4.79 5.00
NMR4-D 4590-23 0.0128 4.79 5.00
NMR4-D 4590-8 0.0234 4.93 5.00
NMR4-D 4590-9 0.0419 4.94 5.00
实施例11
At1g09960过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At1g09960表达，测试了At1g09960(NMR5-F)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于11个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表8显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表8
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR5-F 4599-07 <.0001 3.85 5.00
NMR5-F 4599-08 <.0001 3.67 4.99
NMR5-F 4599-09 <.0001 3.79 4.99
NMR5-F 4599-10 <.0001 3.70 5.00
NMR5-F 4599-11 <.0001 3.96 5.00
NMR5-F 4599-12 <.0001 3.22 5.00
NMR5-F 4599-15 0.001 3.74 4.50
NMR5-F 4599-16 0.001 3.60 4.50
NMR5-F 4599-17 0.001 3.73 4.50
NMR5-F 4599-18 <.0001 3.13 4.49
NMR5-F 4599-20 0.005 3.83 4.50
实施例12
At1g07930过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中At1g07930表达，测试了At1g07930(NMR1002)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于6个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表9显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表9
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR1002 4942-05 0.034 4.68 5.00
NMR1002 4942-06 0.000 4.37 4.99
NMR1002 4942-07 0.008 4.60 5.00
NMR1002 4942-09 0.002 4.30 4.96
NMR1002 4942-10 0.005 4.59 4.99
NMR1002 4942-12 0.034 4.77 5.00
实施例13
At1g15270过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At1g15270表达，测试At1g15270(NMR1004)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于10个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表10显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表10
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR1004 4944-03 0.020 4.58 4.99
NMR1004 4944-04 0.002 4.42 4.95
NMR1004 4944-13 0.001 4.33 5.00
NMR1004 4944-14 0.000 4.16 5.00
NMR1004 4944-15 <.0001 4.03 4.99
NMR1004 4944-16 0.004 4.49 5.00
NMR1004 4944-17 <.0001 4.13 5.02
NMR1004 4944-18 <.0001 4.33 5.01
NMR1004 4944-19 0.000 4.37 5.01
NMR1004 4944-20 <.0001 4.27 5.01
实施例14
At2g37220讨表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At2g37220表达，测试了At2g37220(NMR1005)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于6个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表11显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表11
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR1005 4945-01 0.002 4.63 5.00
NMR1005 4945-02 0.001 4.56 5.00
NMR1005 4945-05 0.003 4.68 5.00
NMR1005 4945-06 <.0001 4.46 5.00
NMR1005 4945-07 0.007 4.70 5.00
NMR1005 4945-08 0.000 4.46 5.00
实施例15
At4g10340过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At4g10340表达，测试了At4g10340(NMR1008)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于5个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表12显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表12
 
基因 事件 种系 ANOVA p值 样品 对照
NMR1008 4948-01 4948-01 0.046 4.55 4.88
NMR1008 4948-02 4948-02 0.033 4.32 4.82
NMR1008 4948-05 4948-05 <.0001 3.80 4.85
NMR1008 4948-07 4948-07 0.217 4.59 4.82
NMR1008 4948-08 4948-08 0.002 4.14 4.85
实施例16
At4g13940过表达赋予线虫抗性
通过培育含有CsVMV启动子的T2植物，该启动子驱动20个上述独立转化事件中的At4g13940表达，测试了At4g13940(NMR1009)过表达对线虫抗性的影响。每种构建体在4份重复实验中测试，对每棵植物的根结计数。按照上面的描述对每棵植物的根结数量进行打分。对于7个转化事件来说，转基因植物的得分与接种的野生型对照植物有显著差别，双因素ANOVA检验确定它们具有的根结明显少于转基因植物(p≤0.05)，并表明它们对线虫感染具有抗性。表13显示了事件号码、ANOVA p值、转基因植物(样品)的平均得分和对照植物的平均得分。
表13
 
基因 事件 ANOVA p值 样品 对照
NMR1009 4949-09 0.020 4.79 5.00
NMR1009 4949-12 0.027 4.79 4.99
NMR1009 4949-13 0.029 4.84 5.00
NMR1009 4949-14 0.002 4.65 5.00
NMR1009 4949-15 0.001 4.64 5.00
NMR1009 4949-16 0.001 4.66 5.00
NMR1009 4949-18 0.000 4.57 5.00
序列表
<110>农业经济有限责任公司
<120>病原体抗性改进的植物的产生
<130>SCT085482-00
<150>US 60/813,662
<151>2006-06-13
<160>88
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2196
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
Figure A200780028871D00621
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Figure A200780028871D00641
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
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Figure A200780028871D00651
Figure A200780028871D00661
Figure A200780028871D00671
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
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Figure A200780028871D00691
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
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Figure A200780028871D00692
Figure A200780028871D00701
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<211>250
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>6
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<213>Arabidopsis thaliana
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<213>Arabidopsis thaliana
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<213>Arabidopsis thaliana
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Figure A200780028871D00741
Figure A200780028871D00751
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<213>Arabidopsis thaliana
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Figure A200780028871D00752
Figure A200780028871D00761
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<213>Arabidopsis thaliana
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<213>Arabjdopsis thaliana
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Figure A200780028871D00911
Figure A200780028871D00921
Figure A200780028871D00931
Figure A200780028871D00941
<210>21
<211>960
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>21
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<211>162
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>22
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<211>924
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>23
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>24
Figure A200780028871D00972
Figure A200780028871D00981
Figure A200780028871D00991
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<211>1673
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>25
Figure A200780028871D00992
Figure A200780028871D01001
Figure A200780028871D01011
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<211>382
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>26
Figure A200780028871D01012
Figure A200780028871D01021
Figure A200780028871D01031
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<211>3007
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>27
Figure A200780028871D01032
Figure A200780028871D01041
Figure A200780028871D01051
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<211>974
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>28
Figure A200780028871D01061
Figure A200780028871D01071
Figure A200780028871D01081
Figure A200780028871D01091
Figure A200780028871D01101
Figure A200780028871D01111
<210>29
<211>753
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>29
Figure A200780028871D01112
Figure A200780028871D01121
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<211>250
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>30
Figure A200780028871D01122
Figure A200780028871D01131
<210>31
<211>1818
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>31
Figure A200780028871D01142
<210>32
<211>605
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>32
Figure A200780028871D01152
Figure A200780028871D01161
Figure A200780028871D01171
Figure A200780028871D01181
<210>33
<211>1016
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>33
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Figure A200780028871D01201
<210>34
<211>260
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>34
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<211>2352
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>35
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<211>783
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>36
Figure A200780028871D01241
Figure A200780028871D01261
Figure A200780028871D01271
Figure A200780028871D01281
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<211>528
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>37
Figure A200780028871D01291
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>38
Figure A200780028871D01292
Figure A200780028871D01301
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<211>1019
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>39
Figure A200780028871D01302
Figure A200780028871D01311
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>40
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>41
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>42
Figure A200780028871D01332
Figure A200780028871D01341
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<211>1294
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>43
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Figure A200780028871D01361
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<211>216
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>44
Figure A200780028871D01362
Figure A200780028871D01371
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>45
Figure A200780028871D01372
Figure A200780028871D01381
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>46
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Figure A200780028871D01391
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>47
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>48
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Figure A200780028871D01421
Figure A200780028871D01431
Figure A200780028871D01441
Figure A200780028871D01451
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>49
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<213>Arabidopsis thaliana
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>52
Figure A200780028871D01482
Figure A200780028871D01491
Figure A200780028871D01511
Figure A200780028871D01521
Figure A200780028871D01531
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<211>1127
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>53
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Figure A200780028871D01541
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>54
Figure A200780028871D01542
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>55
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Figure A200780028871D01561
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>56
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>57
Figure A200780028871D01581
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>58
Figure A200780028871D01592
Figure A200780028871D01601
Figure A200780028871D01611
Figure A200780028871D01621
Figure A200780028871D01631
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>59
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<211>230
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>61
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Figure A200780028871D01671
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<211>510
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>62
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Figure A200780028871D01681
Figure A200780028871D01691
Figure A200780028871D01701
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<211>381
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>63
Figure A200780028871D01702
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>64
Figure A200780028871D01703
<210>65
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>65
Figure A200780028871D01712
Figure A200780028871D01721
Figure A200780028871D01731
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>66
Figure A200780028871D01732
Figure A200780028871D01741
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<213>Arabidopsis thaliana
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>68
Figure A200780028871D01762
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<211>452
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>69
Figure A200780028871D01772
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<211>64
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<213>Arabidopsis thaliana
<400>70
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<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>71
Figure A200780028871D01791
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<211>289
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>72
Figure A200780028871D01801
<210>73
<211>937
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>73
Figure A200780028871D01821
<210>74
<211>216
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>74
Figure A200780028871D01822
Figure A200780028871D01831
Figure A200780028871D01841
<210>75
<211>2150
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>75
Figure A200780028871D01842
Figure A200780028871D01851
<210>76
<211>334
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>76
Figure A200780028871D01861
Figure A200780028871D01871
<210>77
<211>2175
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>77
Figure A200780028871D01882
Figure A200780028871D01891
<210>78
<211>442
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>78
Figure A200780028871D01901
Figure A200780028871D01911
Figure A200780028871D01921
<210>79
<211>2235
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>79
Figure A200780028871D01922
Figure A200780028871D01931
Figure A200780028871D01941
<210>80
<211>443
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>80
Figure A200780028871D01942
Figure A200780028871D01951
Figure A200780028871D01961
Figure A200780028871D01971
<210>81
<211>1208
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>81
Figure A200780028871D01972
Figure A200780028871D01981
<210>82
<211>280
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>82
Figure A200780028871D01982
Figure A200780028871D01991
Figure A200780028871D02001
<210>83
<211>1990
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>83
Figure A200780028871D02002
<210>84
<211>485
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>84
Figure A200780028871D02021
Figure A200780028871D02031
Figure A200780028871D02041
<210>85
<211>735
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>85
Figure A200780028871D02042
Figure A200780028871D02051
<210>86
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<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>86
Figure A200780028871D02052
Figure A200780028871D02061
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<211>1526
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>87
Figure A200780028871D02062
Figure A200780028871D02071
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<211>234
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>88
Figure A200780028871D02081

Claims (20)

1.在其基因组中稳定整合DNA构建体的转基因植物，所述构建体含有的核苷酸序列编码具有病原体抗性活性的蛋白，其中所述核苷酸序列选自：
a)在表3和4的第3列中鉴定的核苷酸序列，或其互补序列；
b)与表3和4的第3列中鉴定的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列；
c)编码的多肽含有表3和4的第4列中鉴定的氨基酸序列的核苷酸序列；以及
d)编码的多肽与表3和4的第4列中鉴定的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；
其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子可操作连接。
2.权利要求1的植物，其中所述植物对至少一种线虫的抗性增加。
3.权利要求1的植物，其中所述植物对至少一种细菌的抗性增加。
4.权利要求1的植物，其中所述启动子是组成型启动子。
5.权利要求1的植物，其中所述植物选自油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、红花、油棕、椰子树、亚麻、蓖麻和花生、番茄、胡萝卜、莴苣、蚕豆、芦笋、花椰菜、胡椒、甜菜、卷心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、长黄瓜、甜瓜、豌豆、萝卜、砧木、短黄瓜(
Figure A200780028871C0002091530QIETU
α)、倭瓜、西瓜、白皮洋葱、菊苣、黄洋葱、花茎甘蓝、抱子甘蓝、叶葱、芹菜、缬草、黄瓜、茴香、葫芦、南瓜、甜玉米和小胡瓜。
6.产生病原体抗性增加的植物的方法，所述方法包括：
a)在植物或其细胞中导入至少一种植物转化载体，所述载体含有核苷酸序列或其变异体，所述核酸序列是表3和4的第4列中鉴定的NMR多肽的编码序列或其互补序列，以及
b)培育转化的植物或细胞以产生转基因植物，其中所述转基因植物表现出对至少一种病原体的抗性增加。
7.权利要求6的方法获得的植物。
8.从权利要求7的植物获得的植物部分。
9.权利要求7的植物的转化种子。
10.产生病原体抗性增加的植物的方法，包括鉴定NMR基因改变的植物以及产生该植物的后代，其中所述后代的病原体抗性增加，并且其中NMR基因是在表3和4的第4列中鉴定的基因。
11.权利要求10的方法，其中所述植物的线虫抗性增加。
12.权利要求10的方法，其中NMR基因的表达被改变。
13.权利要求10的方法，其中NMR基因具有突变。
14.权利要求10的方法，其中所述植物使用候选基因/QTL方法学来鉴定。
15.权利要求10的方法，其中所述植物使用TILLING方法学来鉴定。
16.鉴定病原体抗性增加的植物的方法，包括分析植物的至少一个NMR基因，并鉴定NMR基因改变的植物，其中该植物的病原体抗性增加。
17.权利要求16的方法，其中所述植物的线虫抗性增加。
18.权利要求16的方法，其中NMR基因的表达被改变。
19.权利要求16的方法，其中NMR基因具有突变。
20.权利要求16的方法，其中所述植物使用候选基因/QTL方法来鉴定。
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