CN101748148A - 一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法。用蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP浓度分别为5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰的1/2 MS液体培养基洗脱YEB固体平板上的农杆菌；转化前当油菜的主枝和部分侧枝出现花蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只剩下花蕾；将花序在洗脱的转化菌液中浸泡30秒后立即包扎；同一花序连续浸染3次，间隔2-3天；转化后的7-10天，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。该方法操作简单，所需成本降低，转基因效率高，无基因型依赖性，在利用基因工程手段培育油菜新品种和油菜突变体库建立方面都具有很好的应用前景。

Description

一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法。

背景技术

多年来，许多育种工作者试图采用传统的育种手段来获得油菜良种，但进展十分缓慢。随着基因工程技术的发展，人们愈来愈倾向于通过基因工程的手段改良油菜的产量、品质及抗逆性。目前应用于油菜的转基因技术主要有：农杆菌介导的转化方法、基因枪方法、化学方法(如利用聚乙二醇)和物理方法(如利用电导入法)。其中农杆菌介导的转化方法因其简单、有效而得到广泛应用。采用该方法在油菜中已经建立了基于组织培养的转化体系，但该转化过程比较复杂，涉及无菌苗的培养、外植体的切取、浸染、愈伤诱导、分化、生根、移栽等，因而油菜再生频率受到外植体类型、基因型、激素、外植体生理状态等多种因素的影响，使得油菜遗传转化效率较低。

近年发展了一种农杆菌介导的floral-dip转化方法，该方法省去了组织培养的繁琐步骤，克服了植株再生的困难，可直接获得转化种子，因而具有不可替代的优势。但是油菜的不同发育时期、农杆菌转化液组成成分、浸染次数、浸染时间等都在不同程度上影响油菜的转化效率。因此，优化floral-dip转化方法的方案是进一步提高油菜遗传转化效率的关键。

徐光硕等(见参考文献)用in planta法处理5个甘蓝型油菜品种，获得了转基因油菜植株，平均转化效率为0.1％左右，且各甘蓝型油菜品种间的转化率无明显差异。其技术方案如下：

(1)农杆菌的培养

吸取甘油冷冻保存的含有目的基因的农杆菌100μL，接种于10mL新鲜的LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.0)培养基中，在28℃左右150r/min振荡培养过夜。吸取上述培养物10mL接种于1L含有合适浓度抗生素的5％蔗糖培养液中，在28℃左右150r/min振荡培养24h以上，直至OD₆₆₀＝1-1.5。

(2)农杆菌转化菌液配置

①将上述OD₆₆₀＝1-1.5的农杆菌悬浮液在8000×g下离心8min，沉淀后的农杆菌用1L新鲜的LB培养基重新悬浮。

②将培养好的农杆菌悬浮液离心后重新悬浮于浸染液(5％蔗糖，0.02％Silwet-77)中。

(3)农杆菌转化菌液浸染油菜花序

①转化时期及转化前预处理

在油菜大田中选择花上没有露水和泥土的植株，然后选择那些有花即将开放的分枝，剪去分枝上已经开放的花。

②浸染时间

将枝条弯曲，使整个花序浸泡在盛有菌液的烧杯中，上下摇动1min左右。

③浸染次数及间隔时间

整个过程自第一次浸染后每天或隔天进行一次，共10～15次。

④浸染后植株的管理

在确保所有花都已被浸染后，用硫酸钠纸袋将处理过的花序套住。于终花期将花序上的纸袋取下，管理好植株。待种子成熟时，将经过in planta处理过的分枝剪下单独收获种子，晒干后脱粒储藏。

(3)转基因植株的筛选

在经过in planta处理的种子中选择较饱满者，用0.1％的升汞浸泡12～15min，然后经无菌水清洗3次后，均匀播撒于含有卡那霉素(270mg.L^-1)的MS固体培养基上。将存活下来的幼苗移栽至营养钵，经DNA检测确信外源基因的存在后移至土壤中。

从上述技术方案来看，存在如下缺点：

(1)农杆菌的培养是采用液体培养，需要经过离心和重新悬浮菌体，操作麻烦。

(2)配置农杆菌转化菌液的转化液为LB液体培养基或者为含5％蔗糖和0.02％Silwet-77的溶液，因对花有损害而降低外源基因进入植物基因组中的频率。

(3)用转化菌液浸泡花序的时间为1分钟，时间太长，对花损伤重。

(4)浸染同一花序的次数太多，并且间隔时间短，对花损伤重。

(5)于终花期将花序上的纸袋取下，可能因套袋时间太长，使果荚因缺乏光照而生长不良，影响种子的质量。

总之，由于该方法存在上述缺点，导致转化效率低，仅为0.1％(见表1)。

表1 in planta转化方法在各油菜品种中的转化效率

Table1 The frequence of transfor mants in different cultivars of ra peseed by in planta method

付绍红等(见参考文献)用floral-dip法处理甘蓝型油菜，主要是研究表面活性剂Silwet-77对floral-dip转化甘蓝型油菜效果的影响，获得了抗性植株，认为0.05％的表面活性剂Silwet-77对floral-dip转化甘蓝型油菜最为有利。其技术方案如下：

(1)农杆菌培养

农杆菌培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L。溶质完全溶解后用NaOH调节pH至7.0，定容至1L(固体培养基含1.5％琼脂)，用接种环接触穿刺的培养基画线接种。放在28℃黑暗条件下培养3天。挖一块穿刺物的琼脂，接种于含合适浓度抗生素的YEP液体培养基上，于28振荡培养1-2天，再取25ml放入500ml YEB(含合适浓度抗生素)中，摇菌24小时以上(OD₆₀₀在1.8-2.0)。

(2)转化菌液配置

4000rmp离心15min(室温)，用2倍体积(1L)转化液(MS基本培养基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5％+0.05％Silwet-77；pH5.8)溶解，混匀后准备转化。

(3)农杆菌菌液浸染油菜花序

①转化时期及转化前预处理

选择初花期的甘蓝型油菜植株处理，前1天田间浇透水。去除主花序和每个分枝花序的顶端花蕾，同时除去已开放的花朵，只保留快要开放的花蕾。

②浸染次数及间隔时间

同一花序连续浸染3次，间隔时间为1天。

③浸染后植株的管理

浸染完后套上纸袋。最后一次浸染处理24小时后除去纸袋直至收获种子。

(4)转基因植株的筛选

对浸染处理后获得的T₁代种子经75％酒精表面消毒30秒，0.1％HgCl2消毒10分钟，铺在预先倒好的筛选培养基(预先确定好最佳浓度培养基)平板上，经7-15天筛选培养，将正常生长的绿色苗进行第2次抗性筛选(7-15天)，将第2次筛选后的抗性植株进行第3次抗性筛选(7-15天)，第2次，第3次筛选培养基为：Ms+Km(150mg/L)。

从上述技术方案来看，存在如下缺点：

(1)农杆菌的培养是采用液体培养，需要经过离心和重新悬浮菌体，操作麻烦。

(2)配置农杆菌转化菌液的转化液为MS基本培养基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5％+0.05％Silwet-77；pH5.8，没有添加促进外源基因进入植物基因组中的物质，因此在一定程度上影响转化效率。

(3)菌液浸泡花序的时间不明确，浸泡时间长短也会影响到转化效率。

(4)浸染同一花序的间隔时间太短，这对花有损害。

(5)最后一次浸染处理24小时后就除去纸袋，套袋时间太短，不利于保持农杆菌转化活性。

总之，由于该方法存在上述缺点，导致转化效率较低，仅为2.03％。

参考文献：

[1]徐光硕，饶勇强，陈雁，张椿雨，孟金陵.用in p lanta方法转化甘蓝型油菜.作物学报，2004，1：1-5.

[2]付绍红，牛应泽，杨洪全，韦献雅.表面活性剂silwetL-77对floral-dip转化甘蓝型油菜效果的影响.分子植物育种，2004，2(5)：661-666.

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺点，提供一种操作简便，转化效率高的适用于构建油菜突变体库的转基因方法。

本发明主要是从农杆菌培养、农杆菌转化菌液配置、重复浸染间隔时间、浸染时间、及浸染后植株的管理入手，通过优化农杆菌介导的floral-dip转化方法方案，提出一种高效的适用于油菜突变体库构建的油菜大田转基因方法。具体技术方案如下：

(1)农杆菌培养

将含有pSKI015质粒和pMP90RK辅助质粒或者含有pEGAD质粒的GV3101菌株进行活化和抗生素筛选培养。

对阳性克隆的农杆菌菌液，按1∶100的比例稀释，取200μl稀释菌液涂布新鲜的含抗生素的YEB固体平板上(100×20mm)，28℃下培养2-3天。

(2)农杆菌转化液配置

首先配置1/2MS液体培养基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其终浓度分别为5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰，然后用NaOH调节pH值为5.7-5.8。农杆菌转化液组成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因整合到植物基因组中。因此，在农杆菌转化液中配置一定浓度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遗传转化效率。

(3)农杆菌转化菌液配置

用转化液将培养在固体平板上的农杆菌洗脱下来，每个固体平板上(100×20mm)的农杆菌大概需要150ml转化液洗脱，洗脱下来的农杆菌需要充分悬浮，然后用分光光度计测定转化菌液的OD值，并用转化液将转化菌液OD₆₀₀的值调至0.6-0.8。

(4)农杆菌转化菌液浸染油菜花序

①最佳转化时期及转化前预处理

将油菜播种在大田，当油菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只剩下花蕾。处于最佳转化时期的油菜见图3。

②浸染时间

将转化菌液(400-500ml)装入塑料袋(35×25cm)中，并将去掉已开放花的油菜花序抓成一束，轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒，浸泡后的花序立即用羊皮纸袋(40×18cm)包扎(图4)。400-500ml的转化菌液可浸染6-8株油菜。

③浸染次数及间隔时间

同一花序连续浸染3次，间隔时间为2-3天。花序顶端出现新的快开放花蕾的时间大约为2-3天，因而间隔2-3天时重复浸染可使受浸染的花蕾数增加。

④浸染后植株的管理

浸染完后套上羊皮纸袋(图4)。在完成最后一次转化的7-10天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾(图4)。待种子成熟后，收获晒干，即得T1代种子。

(5)转基因植株的筛选

将获得的T1代种子播种于大田，在幼苗期按1∶800(V/V)喷施除草剂Basta，每隔2-3天喷施一次，连续喷4-5次，在完成最后一次喷施的10-15天后统计转化率(图5)。本发明的油菜转化效率达2.5％-3.8％。

本发明的优点：

(1)本发明农杆菌的培养采用固体平板培养，简化了农杆菌菌体收集过程，因此也避免了液体培养的农杆菌因离心、悬浮等操作过程而降低农杆菌转化活力。

(2)与液体培养相比，农杆菌采用固体平板培养可以节约成本，尤其在大规模转化时更加体现了该方法的优越性。例如：配置500ml的转化菌液，如果农杆菌采用液体培养，至少需要500ml液体培养基；如果采用固体培养，只需要液体培养基80ml和琼脂1.2g，用于准备4个固体平板。由此可见，配置相同体积的转化菌液，采用固体平板培养农杆菌所需的成本可降低约4倍。

(3)本发明在农杆菌转化液组成成分中加入乙酰丁香酮，并找到了加入的合适浓度，通过促进外源基因整合到植物基因组中，而提高油菜遗传转化效率。

(4)本发明在完成最后一次转化后，需套纸袋7-10天保湿，有利于保持农杆菌的转化活力和浸染后花的复苏。

(5)本发明在完成最后一次转化的7-10天后，摘除花序上的羊皮纸袋有利于油菜果荚的生长，提高种子质量。

(6)在完成最后一次转化的7-10天后，摘除花序顶端的花及花蕾，可以减少筛选时的工作量，并进一步提高油菜转化效率。这主要是由于油菜的花序为无限花序，7-10天后新长出的花蕾是没有被转化的，因此需要去除。

(7)本发明的转化效率达2.5％-3.8％，适用于建立油菜突变体库。

附图说明

图1为激活标记质粒pSKI015图谱

质粒T-DNA上带有除草剂抗性标记基因BASTA和4个35S增强子(4×35Se)；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。

图2为pEGAD质粒T-DNA表达框

35S：CaMV 35S启动子；

AtGA2ox8：目的基因AtGA2ox8；

BastaR：除草剂抗性标记基因；

EGFP：一种产生较强荧光的突变性绿色荧光蛋白。

图3为处于最佳转化时期的油菜植株照片。

图4为转化菌液浸染油菜花序过程；

A：开花后5天的油菜花序；

B：用转化菌液浸泡花序；

C：浸染后将花序用羊皮纸袋套上保湿；

D：7-10天后取掉纸袋。

图5为转基因植株的筛选

A：没有喷施除草剂Basta的T₁代幼苗；

B：喷施除草剂Basta后存活的T₁代幼苗(抗Basta的转基因植株)。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

(1)油菜种植

油菜品种1244W6为半冬性中熟甘蓝型油菜(B.napus，染色体组AACC，2n＝38)。其主要特点是：分枝性强，枝叶繁茂，细根较发达；耐寒、耐湿、耐肥，抗霜霉病、菌核病和病毒病能力强；花瓣大，花黄色，角果较长，结荚多，籽粒饱满；种子含油量较高，一般为35％～50％。生长期约227天，产量约340-350斤/亩。

将油菜种子于9月15日播种于苗床育苗，苗床的土壤应肥沃且湿润。大约一个月以后，幼苗长出3-4片真叶，此时将幼苗移植到大田。大田的厢宽2米，行距0.4米，株距0.3米，厢与厢之间的沟距0.3米，沟深0.2米。种植5000株油菜，占地面积大约为200平方米。油菜肥水管理按常规方法进行，次年春天(3月上旬)开花。此时，选择最佳时期进行油菜农杆菌转化。图3为处于最佳转化时期的油菜植株。

(2)农杆菌培养

pSKI015质粒图谱见图1，该质粒带有除草剂抗性标记基因BASTA和4个35S增强子(4×35Se)。本发明用该质粒的目的有两个：一是解决目前限制油菜突变体库建立的转基因技术瓶颈问题；二是利用本发明建立油菜激活标记突变体库。

将保存于-80℃的含有pSKI015质粒的GV3101(含pMP90RK辅助质粒)菌株进行活化，划线培养在含抗生素利福平、卡那霉素、羧苄青霉素和庆大霉素的YEB固体平板上(100×20mm)，抗生素终浓度分别为50mg.L^-1、50mg.L^-1、50mg.L^-1和25mg.L^-1，28℃下培养2-3d，然后挑取单菌落于含抗生素的YEB液体培养基中培养，提取质粒，进行PCR检测。这主要是由于含有pSKI015质粒的农杆菌如果于-80℃储存太久，会影响pSKI015质粒中的CaMV 35S增强子重复序列的稳定性，因此在转化前需检测该重复序列是否存在于农杆菌中。检测引物为T7，5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’或M13(-20)，5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’与IK007，5’-CCCGCCAATATATCCTG-3’。

对阳性克隆的农杆菌菌液，按1∶100的比例稀释，取200μl稀释菌液涂布新鲜的含抗生素的YEB固体平板(100×20mm)上，28℃下培养2-3d。

YEB固体培养基的组成成分为：酵母提取物1g.L^-1，蛋白胨5g.L^-1，蔗糖5g.L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.5g.L^-1，琼脂粉1.5％，pH 7.2。

YEB液体培养基的组成成分为：酵母提取物1g.L^-1，蛋白胨5g.L^-1，蔗糖5g.L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.5g.L^-1，pH 7.2。

(3)农杆菌转化液配置

首先配置1/2MS液体培养基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其终浓度分别为5％、0.05％、0.4％和0.002‰，然后用NaOH调节pH值为5.8。农杆菌转化液组成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因整合到植物基因组中。因此，在农杆菌转化液中配置一定浓度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遗传转化效率。

(4)农杆菌转化菌液配置

用农杆菌转化液将培养在固体平板上的农杆菌洗脱下来，每个固体平板上(100×20mm)的农杆菌大概需要150ml转化液洗脱，洗脱下来的农杆菌需要充分悬浮，然后用分光光度计测定转化菌液的OD值，并用转化液将转化菌液OD₆₀₀的值调至0.8。

(5)农杆菌转化菌液浸染油菜花序

①最佳转化时期的选择及转化前预处理

次年春天(3月上旬)，油菜进入初花期。此时，选择主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放的油菜植株，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，剩下快开放的花蕾和花序顶端花蕾。图3为处于最佳转化时期的油菜植株。

②确定浸染时间

于上午8时开始进行浸染，避免在中午紫外线较强时进行浸染。浸染时，将转化菌液(400-500ml)装入塑料袋(35×25cm)中，并将去掉已开放花的油菜花序抓成一束，轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒，浸泡后的花序立即用羊皮纸袋(40×18cm)包扎(图4)。400-500ml的转化菌液可浸染6-8株油菜。

③浸染次数及间隔时间

同一花序连续浸染3次，间隔时间为2-3天。花序顶端出现新的快开放花蕾的时间大约为2-3天，因而间隔2-3天时重复浸染可使受浸染的花蕾数增加。

④浸染后植株的管理

浸染完后套上羊皮纸袋(图4)。在完成最后一次转化的7天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾(图4)。待种子成熟后，收获晒干，即得T₁代种子。

(6)转基因植株的筛选

将获得的T₁代种子播种于大田，在幼苗期按1∶800(V/V)喷施除草剂Basta，每隔2-3天喷施一次，连续喷4-5次，在完成最后喷施的10-15天后统计转化率(图5)。本发明的油菜转化效率达3.8％。

实施例2：

(1)油菜种植

油菜品种N529为半冬性中熟甘蓝型油菜(B.napus，染色体组AACC，2n＝38)。

将油菜种子于9月15日播种于苗床育苗，苗床的土壤应肥沃且湿润。大约一个月以后，幼苗长出3-4片真叶，此时将幼苗移植到大田。大田的厢宽2米，行距0.4米，株距0.3米，厢与厢之间的沟距0.3米，沟深0.2米。种植5000株油菜，占地面积大约为200平方米。油菜肥水管理按常规方法进行，次年春天(3月上旬)开花。此时，选择最佳时期进行油菜农杆菌转化。

(2)农杆菌培养

pEGAD质粒的T-DNA图谱见图2。该T-DNA序列中带有目的基因、除草剂抗性标记基因BASTA和突变性绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，这些基因都由CaMV 35S启动子(35S)驱动表达。

将保存于-80℃的含有pEGAD质粒的GV3101菌株进行活化，划线培养在含抗生素利福平、卡那霉素和庆大霉素的YEB固体平板上(100×20mm)，抗生素终浓度分别为50mg.L^-1、50mg.L^-1和25mg.L^-1，28℃下培养2-3d，然后挑取单菌落于含抗生素的YEB液体培养基中培养24小时。将农杆菌菌液按1∶100的比例稀释，取200μl稀释菌液涂布新鲜的含抗生素的YEB固体平板(100×20mm)上，28℃下培养2-3d。

YEB固体培养基的组成成分为：酵母提取物1g.L^-1，蛋白胨5g.L^-1，蔗糖5g.L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.5g.L^-1，琼脂粉1.5％，pH 7.2。

YEB液体培养基的组成成分为：酵母提取物1g.L^-1，蛋白胨5g.L^-1，蔗糖5g.L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.5g.L^-1，pH 7.2。

(3)农杆菌转化液配置

首先配置1/2MS液体培养基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其终浓度分别为5％、0.05％、0.4％和0.002‰，然后用NaOH调节pH值为5.8。农杆菌转化液组成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因整合到植物基因组中。因此，在农杆菌转化液中配置一定浓度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遗传转化效率。

(4)农杆菌转化菌液配置

用农杆菌转化液将培养在固体平板上的农杆菌洗脱下来，每个固体平板上(100×20mm)的农杆菌大概需要150ml转化液洗脱，洗脱下来的农杆菌需要充分悬浮，然后用分光光度计测定转化菌液的OD值，并用转化液将转化菌液OD₆₀₀的值调至0.8。

(5)农杆菌转化菌液浸染油菜花序

①最佳转化时期的选择及转化前预处理

次年春天(3月上旬)，油菜进入初花期。此时，选择主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放的油菜植株，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，剩下快开放的花蕾和花序顶端花蕾。

②确定浸染时间

于上午8时开始进行浸染，避免在中午紫外线较强时进行浸染。浸染时，将转化菌液(400-500ml)装入塑料袋(35×25cm)中，并将去掉已开放花的油菜花序抓成一束，轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒，浸泡后的花序立即用羊皮纸袋(40×18cm)包扎。400-500ml的转化菌液可浸染6-8株油菜。

③浸染次数及间隔时间

同一花序连续浸染3次，间隔时间为2-3天。花序顶端出现新的快开放花蕾的时间大约为2-3天，因而间隔2-3天时重复浸染可使受浸染的花蕾数增加。

④浸染后植株的管理

浸染完后套上羊皮纸袋。在完成最后一次浸染的10天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。待种子成熟后，收获晒干，即得T₁代种子。

(6)转基因植株的筛选

将获得的T₁代种子播种于大田，在幼苗期按1∶800(V/V)喷施除草剂Basta，每隔2-3天喷施一次，连续喷4-5次，在完成最后喷施的10-15天后统计转化率。本发明的油菜转化效率达2.5％。

Claims (7)

1.一种农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)农杆菌转化菌液配置

将活化的阳性克隆农杆菌菌液，稀释涂布在YEB固体平板上培养；在1/2MS液体培养基中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其质量终浓度分别为5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰，最后用NaOH调节pH值为5.7-5.8；配置成转化液；用配置的转化液将固体平板上的农杆菌洗脱下来，并继续用转化液将洗脱的转化菌液OD₅₀₀的值调至0.6-0.8；

(2)农杆菌转化菌液浸染油菜花序

①转化前预处理

当油菜的主枝和部分侧枝出现花蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只剩下花蕾；

②浸染

将①步中经过预处理的油菜花序抓成一束，轻轻伸入转化菌液中充分浸泡花序，时间为30秒，浸泡后的花序立即用羊皮纸袋包扎；400-500ml的转化菌液浸染6-8株油菜；同一花序连续浸染3次，间隔时间为2-3天；

(3)浸染后植株的管理

在完成最后一次转化的7-10天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾；待种子成熟后，收获晒干，即得T1代种子；

(4)转基因植株的筛选

将获得的T1代种子播种，通过喷施除草剂抗性选择标记筛选。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述的农杆菌菌株是含有pSKI015质粒和pMP90RK辅助质粒或含有pEGAD质粒的GV3101菌株。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述的YEB固体平板培养是将阳性克隆的农杆菌菌液按1∶100的比例稀释，取200μl稀释菌液涂布含抗生素的100×20mm YEB固体平板上，28℃下培养23天。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述的洗脱过程中每个100×20mm固体平板上的农杆菌用150ml转化液洗脱，洗脱下来的农杆菌充分悬浮。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(2)中浸染时，转化菌液装在规格为35×25cm塑料袋中。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(3)中羊皮纸袋规格为40×18cm。

7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的油菜大田转基因方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗性筛选具体是在幼苗期按1∶800(V/V)喷施除草剂Basta，每隔23天喷施一次，连续喷4-5次。

Images