CN104232683A - 一种农杆菌介导的烟草转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的转基因方法，包括：农杆菌的活化、农杆菌感受态制备、感受态细胞的转化、烟草叶盘的制备和农杆菌对烟草的遗传转化步骤。本发明的农杆菌介导烟草转基因方法，发现LBA4404对烟草的转化效率比EHA105高；本方法不仅整体的操作过程较为简单，实施条件比较容易控制，转化效率更高，具备很好的实用性。

Description

一种农杆菌介导的烟草转基因方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的烟草转基因方方法。

背景技术

从自从1984年首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术日益得到广泛的应用，它对于分子遗传学研究和作物改良都具有特别重要的意义。截至目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面。一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段。烟草作为模式植物，具有生命周期短、组织培养技术成熟、子代数量多的特点，在植物转基因研究具有重要地位。尽管目前植物转基因技术比较成熟，但是植物转基因的转化效率不高是普遍的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的烟草转基因方法，具备转化效率高、操作简单的优点。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、农杆菌的活化；

步骤二、农杆菌感受态制备；

步骤三、感受态细胞的转化；

步骤四、烟草叶盘的制备；

步骤五、农杆菌对烟草的遗传转化。

步骤一、农杆菌的活化：于-70℃冰箱中取出保存的甘油菌LBA4404和EH1105两种农杆菌；用接种环划线于含有利福平（Rif，50mg/L）的LB平板上，于光照培养箱中（28℃）倒置培养48小时；挑单菌落接种于含有利福平（Rif，50mg/L）的LB液体培养基中，摇菌震荡培养（28℃，220转/分）20小时左右；

步骤二、农杆菌感受态制备：待菌液OD₆₀₀约达到0.5时，将菌液移入无菌的1.5mL的离心管中，4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管仲加入500uL 0.05M的冰预冷的氯化钙，将菌液悬浮混匀，静止冰浴30分钟；，4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管中加入0.05M的氯化钙100uL，4℃冰箱中存放备用；

步骤三、感受态细胞的转化：

取0.1ug左右的重组质粒加入100uL的农杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴10分钟；液氮速冻5分钟；立即转入28℃的水浴锅中，孵育5分钟后，立即冰浴3-5分钟；并在超净台中加入500uL含有利福平（Rif，50mg/L）的LB液体培养基；于摇床中震荡培养（28℃，220转/分）4-5小时；取出后涂在含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB平板上面，28℃ 倒置培养48小时左右至长出单菌落为止；挑单菌落接种于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB液体培养基中，震荡培养（28℃，220转/分）。经菌液PCR鉴定后进行后续实验；

步骤四、烟草叶盘的制备：

从烟草无菌幼苗上摘取完全展开的叶片，平铺于称量纸上，用手术刀将叶片的边缘以及主叶脉划掉，将叶片切成0.5平方厘米左右的叶盘，尽量创造更多的机械损伤；

步骤五、农杆菌对烟草的遗传转化，包括以下步骤：

1）含有重组表达载体的EHA105和LBA4404甘油菌菌株从-70℃取出，划线于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB平板上面，28℃倒置培养，挑单菌落接种于2mL LB液体培养基中，于28℃，220转/分，震荡培养过夜；

2）以1%的接种量接种于100mL LB液体培养基，震荡培养至对数生长中期；无菌状态下，4000rpm离心10min；沉淀用20mL MS液体培养基洗涤后，4000rpm离心10min，用20mL MS液体培养基悬浮；

3）将烟草叶盘放入菌液中，混合8-10min，使农杆菌与叶盘组织伤口部位充分接触。将叶盘从农杆菌悬浮液中取出，置于灭菌滤纸上吸干，然后置于MS固体培养基上，用封口膜封好后，在28℃的培养室里共培养2天；

4）把MS培养基上的烟草叶盘转接到分化培养基，在25℃光照周期14h培养2-3周，每隔5天换一次培养基；转接过程中注意要将叶盘的边缘侵入到培养基里，以便叶盘吸收营养；待愈伤组织分化成苗后用解剖刀切取整体的小植株转入装有分化培养基MS分的广口瓶中，继续培养；

5）植株长大后，切除多余的愈伤组织保留整株的植株转入生根培养基中MS根中，让其生根；待再生幼苗根系发达后，开盖加入经阳光暴晒的自来水，培养4-7天；强化植株后，取出植株，用无菌水洗掉幼苗根部的琼脂再移栽到灭菌土的盆钵中，放置于室温中培养炼苗7-10天；待植株有新芽长出现象后方可移至室外。

有益效果：与现有技术相比，本发明农杆菌介导的烟草转基因方法，通过研究EHA105和LBA4404两种农杆菌对烟草的遗传转化，发现LBA4404比EHA105对烟草的转化效率更高；本方法不仅整体的操作过程较为简单，实施起来较容易，而且能够快速大量高效地侵染植物组织，具备很好的实用性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种农杆菌介导的烟草转基因方法，由以下步骤来完成：

步骤一，农杆菌的活化：于-70℃冰箱中取出保存的甘油菌LBA4404和EH1105两种农杆菌；用接种环划线于含有利福平（Rif，50mg/L）的LB平板上，于光照培养箱中（28℃）倒置培养48小时；挑单菌落接种于含有利福平（Rif，50mg/L）的LB液体培养基中，摇菌震荡培养（28℃，220转/分）20小时左右。

步骤二，农杆菌感受态制备：将步骤一所获得的菌液OD₆₀₀约达到0.5时，将菌液移入无菌的1.5mL的离心管中，4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管仲加入500uL 0.05M的冰预冷的氯化钙，将菌液悬浮混匀，静止冰浴30分钟；4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管中加入0.05M的氯化钙100uL，4℃冰箱中存放备用。

步骤三，感受态细胞的转化：取0.1ug左右的重组质粒（含有待转化的目的基因）加入100uL的农杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴10分钟；液氮速冻5分钟；立即转入28℃的水浴锅中，孵育5分钟后，立即冰浴3-5分钟；并在超净台中加入500uL含有利福平（Rif，50mg/L）的LB液体培养基；于摇床中震荡培养（28℃，220转/分）4-5小时；取出后涂在含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB平板上面，28℃ 倒置培养48小时左右至长出单菌落为止；挑单菌落接种于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB液体培养基中，震荡培养（28℃，220转/分）。经菌液PCR鉴定后进行后续实验。

步骤四，烟草叶盘的制备：从烟草无菌幼苗上摘取完全展开的叶片，平铺于称量纸上，用手术刀将叶片的边缘以及主叶脉划掉，将叶片切成0.5平方厘米左右的叶盘，尽量创造更多的机械损伤。

步骤五，农杆菌对烟草的遗传转化，需要分别进行如下工作：

 含有目的基因（棉花ACC氧化酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示）的EHA105和LBA4404菌液培养至对数生长中期（OD₆₀₀=0.5）；

 将步骤四中的叶盘放入含有目的基因的菌液中充分接触，间断性摇晃几次。

将叶盘从农杆菌悬浮液中取出，置于灭菌滤纸上吸干，然后置于MS固体培养基上（叶片的光滑面朝上），用封口膜封好后，在28℃的培养室里共培养2天。

叶盘转接到分化培养基（MS+6-BA 1mg/L+Km 100mg/L+Cp 500mg/L），在25℃光照周期14h（2000lux）培养2-3周，每隔5天换一次培养基，即每隔4天转接一次，根据愈伤的生长状况调整卡霉素的浓度。转接过程中注意要将叶盘的边缘侵入到培养基里，以便叶盘吸收营养，而且转接当中要一直按照开始时转接的方式把叶片的光滑面朝上。

待愈伤组织分化成苗后用解剖刀切取整体的小植株转入装有分化培养基MS分的广口瓶中，继续培养。

植株长大后，切除多余的愈伤组织保留整株的植株转入生根培养基中MS根（1/2 MS+Kan 100mg/L+NAA 0.2mg/L）中，让其生根。再生幼苗根系发达后，开盖加入经阳光暴晒的自来水，培养4-7天。强化植株后，取出植株，用无菌水洗掉幼苗根部的琼脂再移栽到灭菌土的盆钵中，放置于室温中培养炼苗7-10天。待植株有新芽长出现象后方可移至室外。注意观察整个过程转基因烟草的生长状况，注意浇水，开关灯等。

实施例2

实施例1的转基因烟草的PCR鉴定，由以下步骤来完成：

步骤一，转基因烟草DNA的提取，需要分别进行如下工作：

（1）将2mL CTAB分离缓冲液加入10mL离心管中，置于65℃水浴中预热。

（2）称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。 

(3）取0.2g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

（4）样品于65℃保温30分钟。 

（5）加等体积（2mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。

（6）室温下10000rpm离心10分钟，移上清至另一新管中。

（7）加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置10min，12000rpm离心10   回收DNA沉淀。 

（8）用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中或溶于1~1.5mL TE中，分装后-20℃保存备用。

步骤二，转基因烟草的PCR鉴定：

上游引物：5’-ATGGCTACTTTCCCAGTGAT-3’，

下游引物：5’-TTAAGCTGTTGCAATGGGAG-3’，

PCR体系为：1μL 烟草DNA，上下游引物各1μL，Taq酶0.2μL（5U/μL），10xTaq酶buffer 2μL，10mM dNTP 2μL, ddH₂O 12.5μL，总体系为20μL。

PCR程序为：94℃，3min；94℃，30s；54℃，45s；72℃，50s；30个循环， 最后72℃延伸10min。

PCR结果显示，LBA4404转化的83株烟草苗中有65株含有目的基因，转化效率为78.3%；EHA105转化的98株烟草苗中有47株含有目的基因，转化效率为48.0%；因此，LBA4404比EHA105对烟草的转化效率高。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏农林职业技术学院

 

<120>  一种农杆菌介导的烟草转基因方法

 

<130>  100

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  954

<212>  DNA

<213>  棉花ACC氧化酶基因

 

<400>  1

atggctactt tcccagtgat caacttagag aagcttaatg gtgatgagag atcaagaatc     60

 

atggagcaaa tcaaggatgc ctgtgaaaac tggggatttt ttgaggtgat gaaccatggg    120

 

attccacatg attttatgga cactgttgag agattaacga aagaacatta taagaaatgt    180

 

atggaacaaa ggtttaaaga actggtagca agcaaggctc ttgaaggact tgaggctgaa    240

 

gttacggata tggattggga aagtacattt cacttgtgcc atctccctga atcaaacatg    300

 

gctgaaatcc cagatctcag tgatgaatat aggaaagtga tgaaggaatt tgcagtgaaa    360

 

ttggagaaac tagcagagga gttgttggat ttgttttgtg agaatattgg attagagaaa    420

 

gggtatttga aaaaggcgtt ttatggggca aaaggtccaa cctttggcac caaagttagc    480

 

aactatccac catgtccgac cccagacaaa atcaagggac tcagagccca tactgatgca    540

 

ggtggcatca tcttgctgtt ccaagacccc gtcgtcggcg gccttcagct tcttaaagac    600

 

ggcgagtggg tcgatgttcc accgctccgc cactccatcg tcatcaacct cggtgatcag    660

 

ctcgaggtga tcaccaatgg caagtacaaa agtgtggagc accgagtcat agcccaaacc    720

 

gatggaactc ggatgtcttt agcttcattc tacaaccccg gcagcgacgc tgtcatctat    780

 

ccggcgccgg cgttggtgga gaaagaagct gaggaaaaga acaaacaggt ttaccccaaa    840

 

tttgtgtttg aagagtacat gaaactgtat gcaggactga aattccaggc caaggaacca    900

 

aggtttgaag ccatgaaagc gatggaagct actgctccca ttgcaacagc ttaa          954

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  上游引物

 

<400>  2

atggctactt tcccagtgat                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  下游引物

 

<400>  3

ttaagctgtt gcaatgggag                                                 20

 

 

Claims (6)

1.一种农杆菌介导的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、农杆菌的活化；

步骤二、农杆菌感受态制备；

步骤三、感受态细胞的转化；

步骤四、烟草叶盘的制备；

步骤五、农杆菌对烟草的遗传转化。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于：步骤一中，于-70℃冰箱中取出保存的甘油菌农杆菌；用接种环划线于含有利福平的LB平板上，于光照培养箱中倒置培养48小时；挑单菌落接种于含有利福平的LB液体培养基中，摇菌震荡培养20小时。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于：步骤二中，待菌液OD₆₀₀到0.5时，将菌液移入无菌的1.5mL的离心管中，4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管仲加入500uL 0.05M的冰预冷的氯化钙，将菌液悬浮混匀，静止冰浴30分钟；4℃，4000转/分，离心10分钟，弃上清；于离心管中加入0.05M的氯化钙100uL，备用。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于：步骤三中，取0.1ug的重组质粒加入100uL的农杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴10分钟；液氮速冻5分钟；立即转入28℃的水浴锅中，孵育5分钟后，立即冰浴3-5分钟；并在超净台中加入500uL含有利福平的LB液体培养基；于摇床中震荡培养4-5小时；取出后涂在含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB平板上面，28℃ 倒置培养48小时左右至长出单菌落为止；挑单菌落接种于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB液体培养基中，震荡培养，经菌液PCR鉴定后进行后续实验。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于：步骤四中，烟草无菌幼苗上摘取完全展开的叶片，平铺于称量纸上，用手术刀将叶片的边缘以及主叶脉划掉，将叶片切成0.5平方厘米的叶盘。

6.据权利要求1所述的农杆菌介导的转基因方法，其特征在于：步骤五中，包括以下步骤：

1）含有重组表达载体的EHA105和LBA4404甘油菌菌株从-70℃取出，划线于含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif 的LB平板上面，28℃倒置培养，挑单菌落接种于2mL LB液体培养基中，于28℃，220转/分，震荡培养过夜；

2）以1%的接种量接种于100mL LB液体培养基，震荡培养至对数生长中期；无菌状态下，4000rpm离心10min；沉淀用20mL MS液体培养基洗涤后，4000rpm离心10min，用20mL MS液体培养基悬浮；

3）将叶盘放入菌液中，混合8-10min，使农杆菌与叶盘组织伤口部位充分接触；将叶盘从农杆菌悬浮液中取出，置于灭菌滤纸上吸干，然后置于MS固体培养基上，用封口膜封好后，在28℃的培养室里共培养2天；

4）把MS培养基上的叶盘转接到分化培养基，在25℃光照周期14h培养2-3周，每隔5天换一次培养基；转接过程中注意要将叶盘的边缘侵入到培养基里，以便叶盘吸收营养；待愈伤组织分化成苗后用解剖刀切取整体的小植株转入装有分化培养基MS分的广口瓶中，继续培养；

5）植株长大后，切除多余的愈伤组织保留整株的植株转入生根培养基中MS根中，让其生根；待再生幼苗根系发达后，开盖加入经阳光暴晒的自来水，培养4-7天；强化植株后，取出植株，用无菌水洗掉幼苗根部的琼脂再移栽到灭菌土的盆钵中，放置于室温中培养炼苗7-10天；待植株有新芽长出现象后方可移至室外。