CN103981187A - 玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体，该缺失突变体命名为PZ7启动子，是玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS靠近开放读码框的467个核苷酸组成的连续序列。其中，所述P-ZmPIS启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PZ7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了所述启动子PZ7在植物抗逆性育种中的应用，实验证实PZ7启动子启动下游基因在转化细胞中具有NaCl和干旱胁迫诱导特性，在耐盐和抗旱有关的植物抗逆基因工程育种中具有重要应用价值。

Description

玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体PZ7及其应用。

背景技术

土壤干旱和盐渍化等严重影响植物生长发育，已成为影响农业生产的重要因素。近年来，分子生物学技术的快速发展以及拟南芥、水稻、玉米等模式植物的功能基因组学研究的深入，为培育抗旱、耐盐作物新品种提供了新的思路和方法。作物应对干旱和土壤盐渍化不良环境、促进产量的生物学过程受到包含多个关键基因在内的协同调控，发掘并克隆耐逆关键功能基因和启动子，采用转基因技术培育抗旱、耐盐作物新品种是解决上述问题的有效途径。

近年来，国内外用于农作物遗传改良的启动子主要是玉米泛素(Ubiquitin)基因启动子、水稻肌动蛋白(Actin)基因启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S等组成型启动子。使用组成型强启动子可以提高外源基因的表达强度，在一定程度上促进目的基因的表达，但这些启动子启动外源基因在受体植物细胞中非特异性高强度表达，造成大量目标蛋白在不需要时间和地点大量累积，不仅造成宿主体内资源的过度浪费，而且使细胞的代谢平衡受到破坏，往往造成植株形态和生理功能异常等。如Nakashima等在水稻中用玉米Ubiquitin启动子过表达OsNAC6基因，虽然提高了转基因水稻的抗逆性，但同时也造成了其植株生长期延长，产量降低。

植物的生长发育需要基因表达强度及其时空性调控等，而启动子在调控基因转录表达方面起着关键性作用，主要是通过启动子上的顺式作用元件与反式作用因子的相互作用来实现功能基因在特定的时间、位置表达所需量的基因产物。随着植物生物技术的迅速发展和转基因安全性要求的提高，转化的目标基因在植物宿主细胞中表达的组织或时空特异性等受到越来越多的关注，这就需要组织特异性或诱导性启动子的发掘与克隆。与组成型表达启动子相比，诱导性启动子或组织特异性启动子可调控目的基因在特定环境下或者在特定组织中特异性高强度表达，即根据实际需求实现目的基因的时空性表达，在植物抗逆基因工程中具有广阔的应用前景。如Nakashima等在水稻中用组成型启动子过表达OsNAC6基因，转基因水稻抗性提高，但伴随着植株生长延缓产量降低，而用其本身的诱导性启动子过表达OsNAC6基因，在转基因水稻抗性提高的同时未出现其它负面影响。虽然诱导性启动子与组成型启动子相比具有独特的优势，但目前应用较多的主要是RD29A等经典的诱导性启动子，主要原因是我国具有自主知识产权的胁迫诱导型启动子极少，远不能满足我国作物抗逆育种遗传改良的需求，启动子已成为采用遗传转化技术改良作物抗逆性的瓶颈之一。发掘克隆胁迫诱导型启动子，筛选鉴定其核心功能区段及特异性调控序列具有重要的理论意义和应用价值。

磷脂酰肌醇信号途径(PI pathway)在植物的生长、发育和感受外界刺激并对之应答的过程中发挥十分重要的作用。磷脂酰肌醇信号途径起始于磷脂酰肌醇合成酶基因编码的磷脂酰肌醇合成酶，它是磷脂酰肌醇代谢途径中的关键酶，通过与植物细胞中PLC、PLD、PLA2等酶协作参与多种信号过程，如胁迫诱导反应等。2005年Das等从欧洲油菜中克隆了磷脂酰肌醇合成酶基因BnPtdInsS1，该基因在盐和干旱胁迫下诱导上调表达，表明该基因参与了植物对逆境胁迫的响应。2005年申请人实验室翟淑梅等发现玉米ZmPIS基因的表达受到明显的盐和干旱胁迫诱导，从玉米中克隆出ZmPIS基因，分别导入烟草、棉花、玉米和高羊茅等均提高了其抗旱、耐盐及渗透胁迫耐受性，表明ZmPIS基因参与多种作物的干旱、高盐等非生物胁迫反应过程。基因的表达模式与启动子密切相关，因此克隆并进一步研究ZmPIS基因启动子的胁迫响应特性，了解启动子上核心功能区段及胁迫响应区段的功能基础具有重要意义。

发明内容

针对当前研究现状，本发明要解决的问题是提供一种玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体PZ7及其应用。

本发明所述的玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体，其特征是，所述缺失突变体命名为PZ7启动子，是玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS启动子靠近开放读码框的467个核苷酸组成的连续序列；其中，所述P-ZmPIS启动子的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述PZ7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS是从玉米干旱差减文库中克隆了ZmPIS基因的cDNA序列，将此cDNA序列在NCBI高通量基因组数据库中进行BLAST比对，获取的ZmPIS基因5’端上游的1833bp碱基序列片段。该启动子是盐和干旱胁迫诱导型启动子。

利用在线启动子分析软件PLACE以及PLANTCARE分析P-ZmPIS序列，发现该序列中存在37个可能起作用的顺式作用元件，包括厌氧诱导响应元件ARE，光响应诱导元件ACE、SP1和G-box，ABA响应元件ABRE，热诱导响应元件HSE，茉莉酸响应元件CGTCA motif等(见附图1)。参考上述分析结果，利用预测元件的间隔区设计引物，通过PCR扩增获得不同长度且两端带有酶切位点的启动子片段，将这些启动子片段分别连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中的多克隆位点处，可构建5’端系列缺失突变体载体(见附图2显示的PZ2～PZ8启动子片段与报告基因的连接示意图(ATG中的A为+1)。将构建的表达载体导入大肠杆菌感受态细胞，摇菌提取质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒分别命名为：玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体PZ2、PZ3、PZ4、PZ5、PZ6、PZ7或PZ8，其中PZ7的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述用于构建5’端系列缺失突变体的启动子可为全长启动子序列P-ZmPIS；也可以为该启动子片段序列，如PZ2～PZ8；也可为经过人工修饰改造后仍具有该启动子类似活性的核苷酸序列。

将上述PZ2～PZ8启动子转入农杆菌GV3101感受态细胞，鉴定正确的农杆菌菌株可用于后续烟草或玉米的遗传转化。

鉴于本领域科技人员很容易采用定向进化和点突变等方法对本发明所述的启动子及其片段的核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰具有与本发明提供的调控片段的核苷酸序列≧60％同源性且具有启动子活性的核苷酸序列均是衍生于本发明所述启动子的核苷酸序列，并且等同于本发明的序列，属于本专利保护范畴。

凡含有上述启动子及其片段的重组载体、转基因细胞系、重组菌及转基因植物也均属于本发明的保护范围之内。

本发明所述玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体在植物抗逆性育种中的应用。

其中：所述的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的抗旱性和耐盐性等特性及其组合，所述植物是双子叶植物烟草、小麦、大豆或棉花，单子叶植物玉米或水稻，所述应用是利用所述玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体驱动目的基因在植物体内表达实现。

本发明利用本实验室已克隆的玉米磷脂酰肌醇合成酶基因的cDNA序列在NCBI的玉米基因组高通量数据库中进行BLAST，获得该基因5’端上游的1833bp的核苷酸序列作为全长启动子序列，命名为P-ZmPIS，以此序列为模板通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段PZ2～PZ8，分别将其连入植物表达载体pCAMBIA1391Z多克隆位点处启动报告基因GUS的表达，转化烟草。

具体的，将P-ZmPIS序列及其不同长度的片段PZ2～PZ8分别构建植物表达载体，转入农杆菌GV3101，通过叶盘浸染法转化本生烟草。转化植株产生的种子在加有抗生素Kan的琼脂培养基平板上筛选，抗性小苗移栽到营养土中，成活后依次进行PCR和GUS染色检测，获得转基因阳性材料。转基因植株连续自交2代产生纯合系用于基因表达强度分析实验。

通过检测NaCl和干旱处理前后PZ1-PZ8转基因烟草的GUS活性，确定了P-ZmPIS及其缺失突变体PZ2～PZ7为干旱和盐胁迫诱导性启动子。其中PZ7序列短(467bp)、启动子活性最高(见附图3)，且启动下游基因在转化细胞中具有NaCl和干旱诱导特性(见附图4和5)。

将在转基因烟草中筛选获得的具有盐和干旱胁迫诱导活性的、高效启动下游基因表达的启动子片段PZ7通过农杆菌介导的遗传转化法导入玉米中启动GUS表达，利用PCR和GUS染色阳性植株连续自交结实获得纯合系用于基因表达强度分析。

分析PZ7片段控制下的GUS表达模式，确定PZ7在玉米中也能高效启动基因表达，尤其在NaCl和干旱处理条件下，可明显提高GUS的表达量，是盐和渗透胁迫诱导型强启动子，表明该启动子片段在玉米等植物抗逆性育种中具有很好的应用价值。

综上，本发明公开了玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的序列，构建了系列缺失突变体PZ2-PZ8，通过检测它们分别启动GUS基因在烟草中的表达特性，初步确定了PZ7具有很高的启动子活性，且启动下游基因在转化细胞中具有明显的盐和干旱诱导特性。进而在转基因玉米中进行了验证，确定了PZ7启动子在转基因玉米中能正常行使功能，是盐和干旱胁迫诱导型强启动子。本发明的价值和有益效果体现在：

1)为植物抗旱、耐盐基因工程育种提供胁迫诱导型强启动子PZ7，目前在植物转基因抗逆育种中缺乏该类启动子。

2)PZ7启动子在正常条件下调控基因表达在一个相对较低的水平，而当植物遭受干旱或盐胁迫诱导环境时可明显提高目的抗逆基因的表达量，进而提高植物对逆境的适应能力，也就是说该类启动子的应用可在一定程度上实现目的基因在特定环境下的特异性高强度表达，既发挥了预期效果，又减少了宿主细胞能量的不必要浪费，最终促进产量的形成。

3)PZ7启动子不仅启动子活性高，具有很好的盐和干旱胁迫诱导活性，而且序列非常短，仅有467个核苷酸，便于基因重组和植物遗传转化。

4)在PZ7和PZ8间的110bp的核酸序列经鉴定含有未报道的盐和干旱胁迫响应元件，该片段的鉴定可为后续人工改造创制新的启动子提供调控序列。

附图说明

图1：P-ZmPIS启动子序列及其顺式元件分析。

图2：不同的P-ZmPIS启动子片段与报告基因的连接示意图(ATG中的A为+1)。

图3：PZ1～PZ8转基因烟草叶片的GUS荧光活性测定结果。

图4：200mM NaCl胁迫处理前后PZ7转基因烟草的GUS荧光活性测定结果。

图5：干旱胁迫处理前后PZ7转基因烟草的GUS荧光活性测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：启动子的克隆

1)实验室从玉米干旱差减文库中克隆了ZmPIS基因的cDNA序列，该序列已提交到GenBankdatabase(accession no.AY370763)。

2)利用该基因的cDNA序列从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的玉米高通量基因组数据库进行Nucleotide BLAST分析，获取ZmPIS基因的5’端起始密码子上游约2kb调控序列作为其候选启动子序列。

3)根据获得的候选启动子序列，利用PRIMER5.0软件设计引物，正向引物为5'-CCCGCTATGAGCCTAAAC-3'和反向引物为5'-TCCAGAGGCGTACCGATAA-3'。

4)以玉米基因组DNA(CTAB法提取，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》)为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：

25μL PCR反应体系中含有10mM Tris·Cl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌去离子水补足25μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

5)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用AXYGEN回收Kit回收PCR扩增产生的目的条带，具体操作见试剂盒说明书。利用购自全式金公司的基因克隆试剂盒将回收的目的条带连接到pEASY-B克隆载体上转化感受态大肠杆菌Trans-1(试剂盒自带的配套菌株)，具体操作按照试剂盒说明书进行。转化后的大肠杆菌加入800微升LB培养基37℃振荡培养1小时后，3500rpm离心4min收菌涂板，涂板所用培养基中含有50mg/L抗生素Kan(用于筛选阳性克隆),且每个平板表面均匀涂布有IPTG和X-gal，用于蓝白斑筛选。

6)随机挑取6个白斑克隆，在含有50mg/L Kan的LB培养基中过夜摇菌，提取质粒(参照《分子克隆实验指南Ⅲ》24—28页)，质粒利用Ferments的酶SacI和HindIII进行双酶切1小时，具体酶切程序按照说明书进行。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小，酶切出的片段大小约为1Kb和600bp左右。酶切正确的质粒送交北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果利用DNAMan软件进行序列比对，以进一步确认已正确克隆该启动子序列。

实施例2：全长启动子P-ZmPIS的植物表达载体构建及大肠杆菌和农杆菌的转化

1)依据上述克隆的核酸序列设计引物，同时引入酶切位点。上游引物为5'-cgcggatcccccgctatgagcctaaa-3'，引入BamH1酶切位点；下游引物为5'-ccggaattctttgccagagggcaattg-3'，引入EcoR1酶切位点。

2)以上述鉴定正确的质粒为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：

PCR反应体系：5×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)5μL，引物Ⅰ(10μM)1μL，引物Ⅱ(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)，2μL，高保真DNA polymerase(5U/μl)0.25μL，质粒1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序:95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟；56℃退火1分钟；72℃延伸1.5分钟；循环35次；72℃延伸5分钟。

3)PCR产物沉淀，具体程序如下：

3M NaAC Ph5.210μL,PCR产物100μL,无水乙醇220μL混匀后-20℃过夜沉淀；第二天12500rpm，4℃离心15min，倒掉上清；70％乙醇洗涤2遍后，去掉上清晾干；65℃30μL无菌水水浴溶解30min。

4)溶解后DNA和基础载体pCAMBIA1391Z同时进行BamH1和EcoR137℃双酶切1小时(酶切程序按照说明书进行)，酶切后产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段和质粒片段，片段回收采用AXYGEN凝胶回收Kit按照试剂盒说明书进行。

5)回收的目的DNA片段与载体DNA片段的连接

目的DNA与载体DNA的摩尔比控制在1：1～5：1范围，反应体系如下：10×Buffer2uL，载体50～100ng，DNA片段25～50ng，T₄DNA Ligase1uL，ddH₂O补至20uL，混匀后22℃温育15min。反应混合物直接用于大肠杆菌的转化。

6)大肠杆菌的转化

20uL上述连接产物加入50uL大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1Phage ResistantChemically Competent Cell(购自TransGen biotech)，置于冰上30min；42℃水浴热激90s，迅速置于冰上2min；加入800uL LB液体培养基轻轻混匀，37℃、160rpm复苏约50min；5000rpm离心2min收菌，悬浮后涂板，平板倒置于37℃培养箱中培养；挑单克隆，摇菌后提取质粒，进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒用于农杆菌的转化。

7)农杆菌的转化

利用氯化钙法制备农杆菌GV3101的感受态细胞(具体参照《分子克隆实验指南Ⅲ》)；无菌条件下20uL感受态细胞+1μg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；液氮速冻90S，37℃水浴3min，加1mL YEP液体培养基28℃180rpm复苏3h；5000rpm，离心3min收菌，悬浮后涂布于含50ug/mL利福平及kan抗生素的YEP平板上，28℃倒置暗培养2d左右；挑取单克隆，摇菌后以菌液为模板进行PCR扩增鉴定，鉴定正确的阳性菌株用于后续烟草的转化实验。

PCR反应体系：5×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)5μL，引物Ⅰ(10μM)1μL，引物Ⅱ(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)，2μL，高保真DNA polymerase(5U/μl)0.25μL，菌液1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序:95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟；56℃退火1分钟；72℃延伸1.5分钟；循环35次；72℃延伸5分钟。

实施例3：启动子P-ZmPIS5’端系列缺失突变体植物表达载体的构建及大肠杆菌和农杆菌的转化

1)利用在线生物学软件PLACE(Higo K,Ugawa Y,Iwamoto M,et al.(1998)PLACE:a database of plant cis-acting regulatory DNA elements.Nucleic Acids Res,26:358–359.)以及PLANTCARE(Lescot M,Déhais P,Thijs G,et al.(2002)PlantCARE,adatabase of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silicoanalysis of promoter sequences.Nucleic Acids Res,30:325–327.)分析P-ZmPIS启动子序列，共预测出37个可能起作用的顺式作用元件，利用已有元件间的间隔序列设计启动子缺失片段引物，上游引物分别为PZ2F5'-taaggatccgttctacttcttgaagg-3'；PZ3F5'-aaaggatccccactagggcaatgggaa-3'；PZ4F5'-acgggatccggcaatagaatgaaaaa-3'；PZ5F5'-ctaggatccgcgcaaccgaacacgccg-3'；PZ6F5'-aatggatcctatttggctatctgtat-3'；PZ7F5'-ccgggatccatgatgcaaaaactagg-3'PZ8F5'-aagggatccttgccacaattcagat-3'。下游引物为PZ-R5'-ccggaattctttgccagagggcaattg-3'。

2)分别利用上游引物PZ2F～PZ8F和下游引物PZ-R，以实例2中含全长启动子的质粒为模板进行PCR扩增，获得不同长度且两端带有酶切位点的启动子片段(见附图2)。具体PCR扩增条件同实例2中的2)所列条件。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后采用AXYGEN凝胶回收Kit回收目的DNA片段，具体按照试剂盒说明书进行。

3)基础载体pCAMBIA1391Z进行BamH1和EcoR137℃双酶切1小时(酶切程序按照说明书进行)，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳回收质粒片段，片段回收采用AXYGEN凝胶回收Kit按照试剂盒说明书进行。

4)将2)中回收的目的DNA片段与3)中回收的载体DNA片段进行连接，将上述启动子片段分别连入pCAMBIA1391Z的多克隆位点处。具体连接反应条件同实例2中的5)所列条件。

5)大肠杆菌和农杆菌的转化及鉴定

具体转化流程和技术方案同实例2中的6)和7)。

实施例4：烟草的遗传转化及转基因植株的获得

1)将含有全长启动子P-ZmPIS和启动子缺失片段质粒PZ2～PZ8的农杆菌GV3101菌株振荡培养至对数生长期(OD600＝0.6)，离心收菌后加入等体积A2液体培养基悬浮；

2)在超净工作台上将烟草无菌苗叶片切割成约0.5cm²大小的小块，浸入A2培养基悬浮的农杆菌菌液中，0.5MPa负压下浸染10分钟；

3)无菌虑纸吸干叶片表面的菌液，置于A2固体培养基上，26℃黑暗处共培养2天；

4)共培养后的叶片转移至A3选择培养基上(含有400mg/L头孢霉素和15mg/L潮霉素)培养，每7-9天更换一次培养基，连续筛选三代；

5)切下烟草叶盘边缘再生出的抗生素抗性小芽，转移至含有200mg/L头孢霉素和15mg/L潮霉素的A4培养基上壮苗；

6)小苗长至2-3cm时转至A5生根培养基上诱导生根，生根小苗经炼苗后移栽至营养土中继续生长；

7)植株移栽成活后，CTAB法小量提取烟草叶片DNA，根据基础载体pCAMBIA1391Z(公开的商业化载体，网上可直接搜索获得其序列组成)中的hpt基因序列设计PCR引物，引物序列为hpt-F：5'-cgtctgctgctccatacaa-3'，hpt-R：5'-tgtcctgcgggtaaatagc-3'。以提取的DNA为模板进行进行PCR扩增鉴定，PCR阳性材料进一步进行GUS染色鉴定，GUS染色阳性材料用于连续自交收获转基因烟草纯合系材料用于后续处理实验。

CTAB法小量提取烟草叶片DNA步骤：(1)取少许转化烟草小苗的叶片，放入1.5mL离心管中，液氮研磨；(2)加入65℃预热的1×CTAB溶液400μL，振荡混匀后65℃温育1h；(3)加入400μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，抽提10min，常温下12500rpm离心10分钟；(4)取250μL上清转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL无水乙醇，-20℃放置20分钟以上；(5)12500rpm离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀两次，第1次30min以上，第2次3h以上。(6)轻轻倒掉乙醇，待DNA晾干后，毎管加入约40μL(具体可根据DNA量调整)无菌水或1x TE65℃溶解40min。

PCR反应体系：PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL；引物Ⅰ(10μM)1μL；引物Ⅱ(10μM)1μL；dNTP(10mM)0.5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.125μL；DNA模板1μL；ddH₂O补足至25μL。

PCR程序:95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟；58℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；循环35次；72℃延伸5分钟。

转基因烟草的GUS组织化学染色程序：(1)用打孔器取适当叶片放入1.5mL离心管中，加入X-Gluc反应液(50mM pH7.0磷酸钠缓冲液、0.5mM K₄[Fe(CN)₆].3H₂O、0.5mM K₃[Fe(CN)₆]、0.1％TritonX-100、10mM EDTA、2mM X-gluc)浸没材料，0.05MPa抽真空约15min；(2)水浴锅中37℃染色18-24h；(3)70％乙醇脱色后观察拍照。

烟草转化用的培养基的组成：

A1培养基(无菌苗培养基)：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，1％蔗糖，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A2培养基(浸染培养基)：B5培养基成分，250mg/L NH4NO3，3％蔗糖，0.5g/L MES，0.7％琼脂(for plate)，pH5.8-6.0；

A3培养基(诱导丛生芽培养基)：B5培养基成分，250mg/L NH4NO3，2％蔗糖，0.5g/L MES，1mg/L6-BA，0.1mg/L IAA，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A4培养基(壮苗培养基)：A3培养基，去掉IAA，pH5.8-6.0；

A5培养基(生根培养基)：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，3％蔗糖，0.5g/LMES，0.7％琼脂，pH5.8-6.0。

实施例5：PZ1～PZ8转基因烟草的GUS荧光活性分析

为明确不同启动子片段在正常条件下启动目的基因表达的能力，筛选该启动子核心功能区段，我们对PZ1～PZ8转基因烟草纯合株系(每个转化结构挑选了3个株系)的植株叶片进行了GUS荧光活性测定。

GUS荧光活性测定流程：(1)取8周龄转基因烟草叶片约0.1g左右，置于小研钵中加入约1mL4℃预冷的酶提取缓冲液。(2)12500rpm4℃离心10min，取100uL上清液加入到1mL37℃预热的检测液(含1mmol/L MUG)中，迅速混匀，并立刻取出80uL加入到720uL反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)，将该管作为酶促反应的0点。剩余上清液，用于蛋白含量用；(3)然后分别反应10min、20min、30min、40min、60min时取出80uL反应液加入到720uL反应终止液中混匀；(4)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10S，狭缝宽度5nm，电压550V条件下测定荧光值；(5)制作标准曲线：配制4-MU梯度浓度液(10nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4uM)，在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10S，狭缝宽度5nm，电压550V条件下测定各浓度的荧光值，绘制标准曲线；(6)蛋白含量测定：取叶片提取液30μl，采用Bradford法测定蛋白含量(Bradford MM,A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding.Ann.Biochem.,1976，72:248–254.)。(7)计算各样品的酶活力(单位：nM4-MU/min.mg protein)：以酶反应时间对4-MU含量作图，直线部分的斜率即为酶反应速率。

酶提取液(反应缓冲液)的配制：0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)25mL；10％十二烷基肌氨酸钠0.5mL；0.5M EDTA(pH8.0)1mL；10％Triton 100 50uL；B-巯基乙醇50uL；水补至50mL。

10mM 4-MUG母液的配制：5mg 4-MUG加入1.42mL反应缓冲液。

1mM 4-MUG检测液的配制：900uL反应缓冲液+100uL 10mM4-MUG母液

酶活性测定结果表明，PZ1-PZ8在叶片中启动GUS表达的能力差异很大。总体而言PZ1-PZ6启动报告基因的表达能力相对较弱，而PZ7和PZ8表现出了相对高的启动目的基因表达的能力，且PZ7启动表达的能力高于PZ8。其中PZ7中GUS基因的表达强度达到PZ6的4倍左右，PZ8的1.1倍左右，在PZ1-PZ8系列突变体材料中表现出了明显高的启动目的基因表达能力。上述结果表明该启动子的-467bp片段(PZ7)在烟草叶片中具有较高的启动报告基因表达能力，达到PZ1(全长启动子)启动表达能力的20倍之多，表明该-467bp片段为P-ZmPIS启动子的核心功能区段(见附图3)。

实施例6：PZ1～PZ8转基因烟草的盐胁迫响应活性分析

1)选取培养60天且生长状态一致的转基因T3代纯合株系植株浇灌含200mM NaCl的1/2MS营养液进行盐胁迫处理，对照组浇等量1/2MS营养液，然后分别在处理后3h、6h、12h、16h、24h、48h、72h时选取实验组和对照组烟草植株相同部位的叶片取材进行GUS染色及酶活测定；

2)分别收取处理组和实验组植株相同部位的叶片，每个时间点取6份材料，3份用于GUS组织化学染色，3份用于GUS荧光活性测定；

3)对GUS组织化学染色的叶盘脱色后进行观察、拍照，对GUS荧光活测定结果进行统计学分析，并计算出最终的酶活速率。转基因烟草的GUS组织化学染色按照实例4中的程序进行；GUS荧光活性测定按照实例5中的程序进行。

实验结果表明在一定胁迫强度范围内，随着盐胁迫时间的延长PZ1-PZ7转基因烟草植株中的GUS染色水平均受到明显诱导，而PZ8转基因烟草中的GUS显色强度在盐胁迫前后无显著差异。GUS酶活结果表明，盐胁迫处理至24h时PZ1-PZ7转基因烟草中的GUS酶活性达到最高，均达到处理前的2倍以上，且在盐处理48h和72h时一致保持较高的盐诱导水平，而PZ8转基因烟草中的GUS酶活性在盐胁迫处理前后一直保持在一个相对稳定的水平。上述结果说明PZ7-PZ8间的110bp(-466～-357)碱基中存在盐胁迫响应顺式作用元件，而生物信息学分析表明该区段内无已知的盐胁迫响应元件的报道，意味着该区段内存在未被发掘的盐胁迫响应元件。其中PZ7相比其它启动子片段在盐胁迫前后均具有最高启动活性。盐胁迫前后均可达到PZ1(全长启动子)的20倍以上。正常条件下PZ7的启动表达活性为PZ8的1.1倍左右，而盐胁迫后可达到PZ8的2.3倍以上。上述结果说明了PZ7(467bp片段)为P-ZmPIS启动子高效启动基因表达的碱基序列区段，并且具有很高的盐胁迫响应活性，为盐胁迫诱导性强启动子，在作物耐盐基因工程育种中具有很好的应用价值。

实施例7：PZ1～PZ8转基因烟草的干旱胁迫响应活性分析

1)选取培养60天且生长状态一致的转基因T3代纯合株系植株进行干旱胁迫处理，实验组控水，对照组根据具体情况每天浇适量水，然后分别在控水处理3h、6h、12h、16h、24h、48h、72h时选取实验组和对照组烟草植株相同部位的叶片取材进行GUS染色及荧光活性测定。

2)分别收取处理组和实验组植株相同部位的叶片，每个时间点取6份材料，3份用于GUS组织化学染色，3份用于GUS荧光活性测定；

3)对GUS组织化学染色的叶盘脱色后进行观察、拍照，对GUS荧光活测定结果进行统计学分析，并计算出最终的酶活速率。转基因烟草的GUS组织化学染色按照实例4中的程序进行；GUS荧光活性测定按照实例5中的程序进行。

实验结果表明在一定干旱胁迫处理时间内，随着时间的延长PZ1-PZ7转基因烟草植株中的GUS染色水平均受到明显的诱导，而PZ8转基因烟草中的GUS显色强度在干旱胁迫处理前后无显著差异。GUS酶活测定结果表明，在干旱胁迫处理至24h时PZ1-PZ7转基因烟草中的GUS活性达到最高强度，为处理前的2.2倍左右，而PZ8转基因烟草中的GUS酶活性在干旱胁迫处理前后无显著差异。上述结果表明PZ7-PZ8之间的110bp(-466～-357bp)碱基中存在干旱胁迫响应元件，而到目前为止在P-ZmPIS启动子的该序列区段内未见已知的干旱胁迫响应相关元件的报道。另外，GUS荧光活性测定结果表明干旱胁迫前后PZ7的启动子活性均可达到PZ1(全长启动子)的20倍以上，PZ6的3倍以上。正常条件下PZ7的启动表达活性为PZ8的1.1倍左右，而干旱胁迫24h后可达到PZ8的2倍以上。上述结果意味着该467bp(PZ7)片段具有高的启动基因表达活性，并且具有很好的干旱胁迫响应特性，在作物抗旱遗传改良中具有明显的应用前景。

实施例8：PZ7转基因玉米的获得及其在玉米抗逆遗传改良中的应用价值初步评估

1)以玉米骨干自交系Qi319和郑58为受体材料，取自交系种子灭菌，离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基为：

种子萌发培养基：KNO₃1900mg/l，NH4NO₃1650mg/l，FeSO₄·7H₂O27.8mg/l，CaCl₂·2H₂O440mg/l，MgSO₄·7H₂O370mg/l，ZnSO₄·7H₂O10mg/l，KH₂PO₄·H₂O170mg/l，MnSO₄·4H₂O22.3mg/l，KI0.83mg/l，H₃BO₃10mg/l，CuSO₄·5H₂O0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O0.025mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O0.5mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，烟酸1.0mg/l，肌醇100.0mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,生物素0.05mg/l，蔗糖30g/l,琼脂粉7g/l，pH5.8-6.0，用于种子萌发。液体培养基不加琼脂粉。

A培养基：种子萌发培养基添加2,4—D1.0-3.0μmol/l和6-BA4.5-9.0μmol/l，用于离体培养芽尖诱导产生丛生芽组织块以及丛生芽组织块的继代培养。

B培养基：种子萌发培养基基础上添加6-BA4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块诱导分化小苗。

成苗培养基：种子萌发培养基基础上附加6-BA2.25μmol/l和IBA3.6μmol/l，用于丛生芽发育苗。

生根培养基：种子萌发培养基基础上添加IBA2.8-3.6μmol/l，用于无根小苗的生根。

基本培养基及植物生长调节物经热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤除菌，加入灭菌后的培养基中。

2)种子的灭菌与萌发：玉米种子经70％乙醇灭菌8分钟，0.1％氯化汞浸泡10min，无菌水洗涤4-6遍。灭菌后将种子放在培养瓶中萌发，瓶内放入少量无菌水，封口后置暗处28℃下2天。萌动露白的种子转到基本培养基上28℃黑暗条件下继续萌发。

3)茎尖的离体培养和丛生芽组织块的诱导、继代和分化：种子萌发至胚芽长度为3-5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取5毫米左右的上胚轴及茎尖接种于A培养基上暗处26℃培养，并及时切除伸长的下胚轴及幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，膨大的分生组织处出现瘤状或指状突起。20天后，突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般4周继代1次。在继代培养过程中，若丛生芽组织块上丛生小芽偏多，2,4-D浓度调整为3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较为严重，虽有大量分生细胞团产生，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降至1.0μmol/l，继续培养至产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数材料会有不定根的产生，与幼叶的存在一样，不定根的出现也会影响组织块的膨大生长及胚状体或丛生小芽的产生，要及时切除。丛生芽组织块转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐地变黄，质地较为柔韧，5-6天后表面出现微小的突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速地发育，在表面形成丛生小芽。

4)以丛生芽组织块为受体进行遗传转化及植株的再生

将带有PZ7质粒的农杆菌GV3101在含有Kan抗生素的LB培养基中28℃振荡培养，振荡速率为200rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期，3500rpm,离心10min，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，且去掉琼脂粉)洗涤，离心收菌，菌体用含有乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μM/L的1/2浓度的丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5-20倍后用于转化。

取继代培养12-18天的丛生芽组织块进行农杆菌介导的转化，转化后置于暗处恢复培养。农杆菌感染的丛生芽或组织块在含250mg/L头孢霉素(Cefotaxime)的培养基上暗培养7-11天抑菌。抑菌培养后的丛生芽或组织块在含有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞或小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死掉。存活的组织块转至无选择剂且不含2,4-D的A培养基上恢复培养以产生小芽。

将小芽转至成苗培养基上置于光下培养，光强约2000-3000lx，光照14-16h/d。小苗长到3-4叶期时转入生根培养基中诱导生根。培养约15天后约40％的小苗会产生新根。未生根小苗切伤基部，转至新的生根培养基中继续培养，10天后多数小苗将产生根系。洗去生根苗根系上粘附的培养基后，移栽于蛭石中生长。植株在自然光下生长，白天温度22-28℃，夜间温度16-21℃，隔天用1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分浇灌，2周后移植苗产生大量根系，将其定植于田间生长。

5)转基因植株的筛选检测

取移栽成活植株的叶片进行PCR检测，PCR阳性植株的叶片进行GUS染色，两者均显阳性的植株用于后代繁殖收获种子。玉米少量叶片DNA的提取同实例4中烟草叶片的提取程序；PCR反应体系及程序和转基因玉米的GUS组织化学染色程序同实例4中的7)所述。

6)以PZ7T3代纯合系转基因玉米植株为材料，开展干旱和盐胁迫处理实验

盐胁迫处理实验：取种子播种于砂盆中，三叶期开始一半用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌，一半浇等量水作为对照，在处理至1、3、7、10天时分别取材进行GUS酶活测定分析。结果表明PZ7在玉米中也能高效启动基因表达，尤其在NaCl处理条件下可明显提高GUS的表达量，是盐胁迫诱导型强启动子。

干旱胁迫处理实验：取种子播种于土盆中，五叶期开始一半开始控水，一半每天浇适量水作为对照，在控水处理至1、3、5、7天时分别取材进行GUS酶活测定分析。结果表明PZ7在干旱处理条件下可明显提高GUS的表达量，是干旱胁迫诱导性强启动子。

综合上述结果表明PZ7在玉米中也能高效启动基因表达，且启动目的基因在玉米植株细胞中的表达具有明显的干旱和盐胁迫诱导特性，是盐和干旱胁迫诱导型强启动子，在耐盐和抗旱相关植物抗逆基因工程育种中具有重要应用价值。

Claims (3)

1.一种玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体，其特征是：所述缺失突变体命名为PZ7启动子，是玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS靠近开放读码框的467个核苷酸组成的连续序列；其中，所述P-ZmPIS启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PZ7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体在植物抗逆性育种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的抗旱性和耐盐性等特性及其组合，所述植物是双子叶植物烟草、小麦、大豆或棉花，单子叶植物玉米或水稻，所述应用是利用所述玉米磷脂酰肌醇合成酶基因启动子P-ZmPIS的缺失突变体PZ7驱动目的基因在植物体内表达实现。