CN102787116B - 玉米愈伤组织特异性启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玉米愈伤组织特异性启动子，及其用于构建表达载体的用途。该启动子能在水稻愈伤组织中特异性表达。本发明是从玉米B73自交系中克隆出的一段长为1910bp启动子序列，序列如序列表中SEQIDNO:1。本发明的启动子只在愈伤组织中表达，使得目的基因的表达产物在一定空间积累，增加愈伤部位的表达量，在定向改良玉米品质上具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物启动子及其应用，特别涉及一种玉米愈伤组织特异性启动子的克隆、功能验证与分析及其在培育安全性转基因植物中的应用。
背景技术
不同类型的细胞内所含的遗传信息虽然是相同，但是它们表达的蛋白却千差万别，这是由于不同基因差异表达的结果，而控制这些基因在不同的时空中进行表达的最主要的元件就是启动子。所谓启动子，它是位于转录起始点5’端上游，能够正确指导RNA聚合酶II同模板结合的一段DNA序列。对启动子序列研究发现，它的基本结构特征：位于转录起点上游富含一段AT碱基的TATA-box，决定转录的正确起始，真核生物的TATA-box一般位于帽位点的上游-20~-30bp区域；位于帽位点-80~~bp220区域，称为启动子上游顺时作用元件，决定基因转录的效率，如CCAAT-box和GC-box，这些上游元件在启动子中有时同时存在，有时单独存在，有的是多拷贝，有的是单拷贝，这些差异性的存在，决定了基因的时空差异性表达。
启动子根据其基因表达方式的不同分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。外源基因在时间和空间上的表达是持续性的，基因工程中常使用高活性的组成型启动子驱使外源性启动子在植物中表达，因其具有RNA和蛋白质表达量恒定性，无时空特异性，不受外界环境因素的诱导等特点，但这种表达往往会导致细胞内代谢产物的积累，增加细胞负担和造成能量浪费。而组织特异性启动子它可以驱使外源基因在植物特定时间、特定组织表达，按照人们的意愿改进植物代谢途径，使目的基因的表达产物集中、并且增加表达量。
玉米作为世界上最大的粮食和饲料作物，种子中贮存着丰富的蛋白质、淀粉和脂肪，是人类和动物食用植物蛋白的来源；在基因工程中可用作生物反应器, 在医疗和工业领域中也具有重要研究价值。本发明通过分子生物学的方法，从玉米B73自交系中克隆一段启动子序列与GUS基因融合后，导入水稻“中华11”中验证该段启动子的功能，为玉米在基因工程中的研究提供重要的调控元件，不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种启动子在玉米愈伤组织特异性表达。本发明所提供的玉米愈伤组织特异性启动子片段，命名为LEG，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）B73自交系，该启动子片段大小为1910bp。
本发明所涉及的设计方案为一种玉米愈伤组织特异性启动子，具有序列表中SED ID NO:1项下的序列。通过玉米B73提取总DNA克隆获得的LEG基因启动子序列，经测序其长度为1910bp，同NCBI报道的序列比对完全一致；通过启动子软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。
本发明还提供了一种愈伤特异性表达的载体，其特征在于转入了前述的玉米愈伤特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米特异性启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCAM–pLEG。通过农杆菌介导法转化水稻，成功获得转基因植株。PCR和Souther杂交结果表明玉米特异性启动子整合到水稻基因组中；GUS组织化学染色鉴定证实LEG基因的启动子为愈伤特异性表达启动子，pCAM–pLEG为一种愈伤特异性表达的载体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种玉米愈伤组织特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
在另一个实施方案中，本发明提供了所述启动子用于在植物愈伤组织中特异性表达目的基因的用途。
在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米愈伤组织特异性启动子的植物表达载体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米愈伤组织特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物表达载体能调控目的基因在植物愈伤组织中特异性表达。
在其他实施方案中，本发明还提供了所述启动子用于构建在植物愈伤组织中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。
有益效果
本发明提供的一个玉米愈伤组织特异性启动子LEG在水稻的愈伤组织中特异表达，能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶段性强、灵敏度高的优点，而且由于筛选基因只会在愈伤阶段表达，在其他时期不会表达，它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营养的不必要浪费，在玉米生长发育前期的研究具有较大的实际应用价值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1: Southern DNA分子杂交结果。1:阴性对照；2：转基因株；3: Lamda DNA； 4：阳性对照。结果显示LEG启动子片段已整合到水稻基因组中。
图2: GUS基因的组织化学染色结果。1为愈伤组织；2为叶；3为茎；4为叶芽鞘；5为根；6为颖壳；7为花；8为种子；CK(-)：未转基因株；CK(+)：转35S基因株； LEG：转LEG基因株。结果显示：转35S启动子植株，各部位均染上颜色；未转基因植株各部位均未染上颜色；而转LEG启动子植株只有愈伤中染上颜色，其它部位均未染上，说明LEG启动子GUS基因只在愈伤中表达，其它部位均不表达。
具体实施方式
所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；pTEAY-T1、Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶HindⅢ和EcoI, T4连接酶购自TaKaRa 公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分析纯。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1. 玉米愈伤组织特异性启动子LEG的克隆
根据NCBI网站上公布的LEG启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物，上游加HindIII（AAGCTT）酶切位点，下游加NcoI（CCATGG）酶切位点
引物序列如下：
引物1（上游引物）：5’-CCCAAGCTTAACTGCTGGGAGATGGAACT-3’
引物2（下游引物）：5’-CATGCCATGGCTTTGCTTTGCCGTGATAGG-3’
以提取玉米B73基因组DNA（全式金公司植物基因组试剂盒提取）为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR反应体系为：
| 10×PCR buffer | 5 μL |
| dNTP(10mM) | 4 μL |
| 引物1 | 2 μL |
| 引物2 | 2 μL |
| DNA模板 | 1 μL |
| Taq酶 | 0.2 μL |
| ddH2O | 至50 μL |
PCR反应条件为：预变性：94℃ 6min；变性：94℃ 45s；退火：58℃ 45s；延伸：72℃ 2min，34个循环；总延伸：72℃ 10min。
反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，回收并纯化1910bp的目的片段；将回收片段与pEASY T1 Cloning Vector（全式金生物技术有限公司）连接，转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞(全式金生物技术有限公司)中；PCR和酶切检测筛选阳性克隆；对检测结果初步判断正确的连接片段，送去进行测序（上海生工公司），测序结果如:序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列所示，由1910bp个碱基组成，将其与NCBI上报道的序列比对，结果完全一致。
实施例2.LEG基因启动子表达载体的建立
将已连接到pEASY T1 Cloning Vector上的LEG片段（小片段）与农杆菌双元载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子（大片段）用HindIII和NcoI酶进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h，酶切30μL体系如下：
| 大（小）片段 | 22μL |
| BSA | 3μL |
| 10×buffer K | 3μL |
| HindIII | 1μL |
| NcoI | 1 μL |
| 总体积 | 30 μL |
将上述大小片段用T4DNA连接酶连接，25℃连接2~12h ，连接体系如下：
| 大片段 | 1 μL |
| 小片段 | 7 μL |
| 10×ligase buffer | 1 μL |
| T4DNA ligase | 1 μL |
取3~5 μL的构建好的载体pCAM–pLEG质粒轻轻打入到200μL EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5 min，液氮速冻1min， 37℃水浴5 min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220 rpm预表达4~5h；10000 rpm离心30s，弃上清，加入100μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24~48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24~48h；待菌液浑浊（橙黄色），提取质粒 ；分别用PCR和双酶切验证。
实施例3. 农杆菌介导水稻转化
通过根癌农杆菌(Agrobacterum一mediated)农杆菌介导法将含pCAM–pLEG表达载体的农杆菌导入水稻中。
3.1 水稻成熟胚愈伤组织的获得
在实验前，对实验所用的成熟种子在强太阳光下晒3~4h后对其去壳处理。先用灭菌水洗，水至清，再用75%乙醇浸泡5min，然后用灭菌水、次氯酸和吐温配制的杀菌水（具体比例：灭菌水：次氯酸=1：1，总体积：吐温=1mL:1ul）浸泡30min，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗，直至水变澄清，再将成熟种子放在灭菌滤纸上吸干水分后，取其于愈伤诱导培养基上，26±1℃培养；10~15d后，将诱导出的乳黄色愈伤组织转入继代培养基上继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后挑选继代培养5~7d，将色泽淡黄的愈伤组织用于共培养。
3.2 用于转化水稻的农杆菌菌液的准备
将含有pCAM–pLEG 表达载体的农杆菌接种于YEP液体培养基（含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL 利福平）中，28℃振荡培养至OD600=0.6~1.0；室温下5000 rpm离心5min收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至OD600=0.4，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
3.3 农杆菌侵染水稻愈伤组织
挑选色泽鲜嫩、呈乳黄的愈伤组织，集中放入100 mL无菌三角瓶中，加入上述制备好的农杆菌悬浮液（悬浮液以淹没愈伤为好）；28℃，220 rpm摇床上培养20~30min；倒掉菌液，将侵染后的愈伤组织置于含无菌滤纸的培养皿上吸去多余菌液，随即转移到固体共培养基上，22℃暗培养2~3d。
3.4 选择培养
将共培的愈伤组织，先用灭菌水清洗直至水变澄清，弃去清洗液，转入含有羧苄青霉素（100mg/ml）的溶液中振荡清洗30min以上，用无菌滤纸吸干，置于含无菌滤纸的培养皿中干燥处理；再将愈伤挑选到含有羧苄青霉素（500mg/ml）和潮霉素（50mg/L）筛选培养基上，28℃光照培养30d左右，直至长出新的抗性愈伤。
3.5 抗性愈伤组织的分化
从筛选培养基上挑选长势较好呈乳黄色的新愈伤（暂定为潮霉素抗性愈伤）于含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先28℃暗培养3d，然后转移到30℃条件下进行全光照培养， 15~30d，有绿点出现；30~40d后会分化出幼苗。
3.6 生根、壮苗和移栽
待分化出的幼苗h≥3cm时，可转移至生根培养基上，培养2~3w；选择h≥15cm、根系发达的幼苗，加水室温下炼苗2~3d后，用温水洗去培养基，移入含水稻培养土的水桶中栽培。待苗生长健壮后移入水田中生长。
实施例4. 转基因水稻的的鉴定
4.1转基因水稻的PCR分子检测
为了检测转基因水稻，一般以提取的转基因水稻总DNA为模板，用目的基因LEG启动子片段和表达载体上所含的潮霉素基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用以初步鉴定转基因植株。
用目的基因检测的引物序列如下：
引物1（上游引物）：5’-CCCAAGCTTAACTGCTGGGAGATGGAACT-3’
引物2（下游引物）：5’-CATGCCATGGCTTTGCTTTGCCGTGATAGG-3’
PCR反应体系和反应条件如上（2.玉米愈伤组织特异性启动子LEG的克隆）
用于检测潮霉素抗性基因的引物序列如下：
引物3（上游引物）：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’
引物4（下游引物）：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’
PCR反应体系参照LEG的克隆，反应条件如下：PCR反应条件为：预变性：94℃ 6min；变性：94℃ 45s；退火：55℃ 45s；延伸：72℃ 2min，34个循环；总延伸：72℃ 10min。
4.2 Southern DNA分子杂交检测
为说明该片段是否整合到基因组，进一步做了Southern杂交。本实验采用Roche公司地高辛探针标记法。具体操作步骤如下：
4.2.1 水稻基因组的提取：全式金植物基因组试剂盒提取。
4.2.2 酶切及电泳：酶切反应体系配制：
| 基因组 | 100~150 ug |
| 10×限制酶缓冲液 | 50ul |
| 限制性内切酶HindIII | 300 U |
| ddH2O | 至500 ul |
混匀体系，37℃过夜酶切。酶切产物的电泳：将酶切产物沉淀下来，并用50ul水溶解沉淀。再加5ml 10×loading buffer ，以消化酶切产物，使用0.8%琼脂糖凝胶，上样，45V电泳过夜。
4.2.3 转膜：将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，置于0.25M HCl中浸泡10min；用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性，15min 2次共30min，其间轻摇数次；用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M Tris·Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和15min 2次共30min，其间轻摇数次；洗净转膜仪，选窗口大小合适的封闭膜，剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于20×SSC中至少5min，剪去一角与凝胶块对应铺于底部，后将封闭膜压好，然后将凝胶铺在窗口的尼龙膜上，赶除气泡；真空转移，10×SSC中性转移缓冲液真空转移1.5h，压力5 inch Hg。
4.2.4 固定DNA：用UV交联仪（UPVL1000）将DNA固定在膜上。
4.2.5 探针的标记：探针可以提前制备好，冻存。根据Roce公司的DIG标记试剂盒进行如下操作：
引物5（上游引物）：5’- CCCAAGCTTGTAACAATACTCACACTTTCACATA-3’
引物2（下游引物）：5’-CATGCCATGGCTTTGCTTTGCCGTGATAGG-3’
| 10×PCR buffer（MBI） | 2.5μl |
| 10×PCR DIG DNA labeling Mix（Roce） | 2.5μl |
| 引物5 | 25pmol |
| 引物2 | 25pmol |
| Taq（MBI） | 0.5μl |
| 模板DNA | 50pg |
| ddH2O | 至25μl |
同时用未标记DIG的dNTP(MBI )作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20℃冷冻保存。
4.2.6 杂交与检测（NBT/BCIP显色）：将固定好的尼龙膜放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，在杂交炉（Fisher分子杂交箱）中65℃保温4h；弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针（2μl DIG探针/1ml杂交液），65℃杂交16h；倒出杂交液，杂交液中含有未杂交的探针，放到-20℃备用；用2×SSC，0.1% SDS溶液洗膜2×5min；用0.1×SSC，0.1% SDS溶液洗膜2×15min；在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1~5min。20~30ml 封闭液孵育 30min； 取anti-DIG-AP（Roce），按1:5000稀释于封闭液中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温孵育30min；用20~30ml洗涤液洗涤2×15min；15ml 检测液中平衡2~5min；显色：现配20ml 显色底物（NBT/BCIP）暗处静置显色；50ml ddH2O或TE洗膜5min终止显色，拍照保存，将膜封存于装有塑料袋中，可长期保存。
图1 Southern杂交结果表明，该启动子片段已整合到水稻基因组中。
4.3 GUS基因的组织化学染色
分子检测结果，初步鉴定为转基因株后，分别对转入35S启动子的植株（阳性对照CK+）、未转基因株(阴性对照)、转LEG启动子植株进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：
(1)取转基因水稻不同的组织：愈伤、叶、茎、叶芽鞘、根、花、颖壳和种子，将各部位移入试管中，加入适量的GUS固定液，室温下温和摇动30~60min, 用50nmol/L的磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗10~15min，重复几次，以除去组织中残留的固定液；(2) 对染色液进行1min中真空抽滤，将各组织置于GUS染色液中保温4~12h；结束后，将染色组织先置于75%乙醇漂洗脱色，再用50%和20%乙醇各侵泡20min以上，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为GUS表达部位。
如图2所示（1为愈伤；2为叶；3为茎；4为叶芽鞘；5为根；6为颖壳；7为花；8为种子）。结果显示：转35S启动子植株，各部位均染上颜色；未转基因植株各部位均未染上颜色；而转LEG启动子植株只有愈伤中染上颜色，其它部位均未染上，说明LEG启动子GUS基因只在愈伤中表达，其它部位均不表达，从而证明LEG在水稻愈伤组织中特异性表达。
4.4 GUS活性荧光定量分析
由于外源基因整合到基因组中的拷贝数不同，导致外源基因的表达上有很大的差异，所以仅仅通过GUS组织化学染色，只能定性的说明GUS基因的基本表达部位，染色的深浅并不能说明其表达强弱，为了进一步了解其表达的程度，我们还对其做了荧光定量分析。
4.4.1 蛋白的提取：分别取0.1g愈伤组织（T1代）用液氮研磨成粉末，加入3倍体积的GUS酶提取缓冲液，再研磨2min,移入到2ml的离心管中，摇动5min后，12,000rpm，4℃离心10min，吸取上清于4℃保存；
1) 蛋白标准曲线的制取，配制1mg/ml BSA标准蛋白母液，制作梯度浓度液，反应2min, 在A595nm紫外光下测量，建立蛋白标准曲线。
2) 样品的测量：取3ul提前好的蛋白溶液移至7ml试管中，用缓冲液PBS稀释至终体积100ul，加1ml Bradford工作液，并震荡混匀，2min后测量A595nm值，测量应在1h内完成。对未转基因株CK(-)、转35S启动子CK(+)和LEG阳性植株的测定，分别重复3次，取平均值。
4.4.2 GUS荧光检测
1）制取4-MU标准曲线：先配制浓度为20mM的母液，再稀释到1mM浓度的工作液(-20℃保存)。 4-MU（4-甲基伞形酮）梯度浓度液（由反应终止液配制）分别为：10umol/L、2.5 umol/L、1 umol/L、500 nmol/L、100 umol/L、10 umol/L。用MU标准液校正荧光分光广度计，在激发光365nm,发射光455nm,狭缝5nm条件下，测各样品的吸光值，分别重复3次，取平均值。
2）酶反应测量: 先取450ul的检测液（2mmo;/L MUG：4-甲基伞形酮-β-葡萄糖醛酸苷）在37℃预热，再将50ul含GUS的上清加入预热的检测液中，迅速混匀后，立即从中取出50ul加入到950ul反应终止液中（0.2mol/L NaCO3）, 将该管作为酶促反应的起始点，并开始计时。分别在5min、10 min、20 min、30 min、45 min、和60 min时取出50ul的反应液，转入到950ul的反应终止液中。未转基因株CK(-)、转35S启动子CK(+)和LEG阳性植株分别测3次，结束后，用荧光分光光度计测量不同时间点的荧光值。
Claims (5)
1.一种玉米愈伤组织特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的启动子用于在水稻愈伤组织中特异性表达目的基因的用途。
3.包含如权利要求1所述玉米愈伤组织特异性启动子的植物表达载体。
4.权利要求3的植物表达载体，其特征在于所述载体是用所述玉米愈伤组织特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。
5.权利要求1所述的启动子用于构建在水稻愈伤组织中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。
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