CN110129337B - 玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体，是位于玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因起始密码子ATG上游的295bp的连续核苷酸序列；同时还公开了该缺失突变体在作物磷高效或耐低磷抗逆育种中的应用；其中所述缺失突变体优选核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的缺失突变体M2P‑7。实验证实，本发明的M2P‑7启动子能够启动下游基因在转基因植物受体中高强度表达，且具有明显低磷胁迫诱导特性，在植物磷高效或耐低磷抗逆育种中具有很高的应用价值。

Description

玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体及其 应用

技术领域

本发明归属于植物基因工程和分子生物学技术领域，尤其涉及一种玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体及其在作物磷高效或耐低磷育种中的应用。

背景技术

土壤有效磷不足已成为限制我国农业生产的重要因素之一。充足的磷营养能加速细胞的增殖和生长，促进植物生长发育，增强植株抗逆性等；磷缺乏将严重制约植物的生长发育，影响作物的产量及品质。我国2/3的农田严重缺磷，为增加产量，我国每年施用约1100万吨磷，约占世界总用量的30％，而当季磷肥利用率仅为10-15％，大量磷素累积于土壤中，不仅造成生产成本的提高，而且造成环境的污染。磷矿是不可再生资源，趋于耗尽，土壤有效磷不足和磷矿资源匮乏已成为未来农业的潜在危机。作物应对低磷环境，促进产量的生物学过程是多基因协同调控的复杂过程。了解植物应对低磷胁迫的适应性调控机制，发掘并克隆磷胁迫响应关键基因和调控元件，采用转基因技术培育作物磷高效新品种是解决上述问题的有效途径，也是保证我国粮食高产、稳产的有效措施。

转基因被认为是现代农业中发展最快的生物技术，其核心之一是重要“功能基因和调控元件”的发掘，世界各国越来越认识到基因和启动子资源对未来农业发展的重要性。选择合适的启动子实现目的基因的有效表达是转基因成功的重要环节。目前我国已克隆了一批功能基因，与之相对的是可用于调控这些基因有效表达的启动子非常有限，目前作物遗传转化中我国具有自主知识产权的、可供选择的启动子严重匮乏，已成为转基因育种产业发展的主要瓶颈之一。克隆我国拥有自主产权的启动子，发掘其核心功能区段并明确其在作物转基因育种中的应用价值，是抢占作物生物技术产业制高点的迫切需求，具有重要意义。

启动子通常是指基因5，端上游区的一段特定的DNA序列，是RNA聚合酶以及转录因子的结合位点，决定基因转录的起始和表达特异性。启动子的结构影响它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响基因的表达水平。启动子区含有一系列特异的蛋白质结合序列，统称为顺式作用元件，不同启动子的顺式作用元件决定了基因具有不同的表达特性。真核生物基因在转录水平上的调控主要通过顺式作用元件与反式作用因子的相互作用实现，使生物能够在特定的时间、位置和环境下表达所需的基因产物。

启动子按其作用方式和功能大致可分为三种类型：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前国内外用于农作物遗传转化的启动子主要是玉米泛素(ubiquitin)基因启动子、水稻肌动蛋白(actin)基因启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子等组成型启动子。它们调控目标基因在所有组织中表达，且没有时空限制。用这些启动子调控目标基因表达时，由于大量目标蛋白在不需要的细胞或发育阶段出现，往往容易造成物种形态和生理功能异常。如Nakashima et al.利用玉米Ubiquitin启动子在水稻中过表达OsNAC6，转基因水稻抗逆性提高的同时也导致其植株的生长发育延缓，最终导致产量降低。

诱导型启动子可在植物特定发育阶段或生长环境下启动基因表达，即根据植物的实际需求实现基因的按需表达，与组成型启动子相比在目的基因的精准表达方面体现出了明显的优势，受到越来越多的关注。诱导型启动子通常具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，其含有的感受外界信号的顺式作用元件具有保守性及专一性。逆境胁迫诱导型启动子是诱导型启动子中的一大类，主要在植物遭受环境胁迫时发挥功能，如低磷胁迫。Schünmann et al.(2004)克隆并鉴定了大麦HvPht1；1启动子，发现该启动子序列中含有3个与双子叶植物中PIBS-element(磷胁迫响应元件)类似的Motif，该启动子的活性受低磷胁迫诱导。Tittarelli et al.(2007)分离了小麦高亲和磷转运体TaPT2 579bp的启动子片段，低磷胁迫下该片段在小麦根中特异性启动GUS的表达。Araceli et al.(2017)克隆了拟南芥PLDZ2的启动子，发现该启动子也含有PIBS-element，其驱动基因表达也受低磷胁迫的诱导。目前，国内外虽有少量低磷胁迫诱导性启动子的报道，然而由于存在启动子活性低，广适性差等诸多缺点，导致可用于磷高效作物育种的低磷胁迫诱导性启动子极其匮乏。因此，克隆可用于作物磷高效育种的低磷胁迫诱导性强启动子具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

植物PHT1基因家族编码高亲和磷转运体蛋白，在植物应对低磷胁迫时发挥重要作用。玉米中存在13个推定的PHT1基因(ZmPHT1；1-13)，它们的表达明显地受到低磷胁迫的诱导，但是它们的表达强度和组织特异性等显著不同，基因的转录表达与启动子密切相关，这意味着它们的启动子存在明显的功能差异。其中，ZmPHT1；5编码玉米高亲和磷转运体5，申请人实验研究发现：低磷处理前后玉米芯片杂交结果显示在低磷胁迫6天和10天时与足磷培养条件下相比该基因的表达强度分别诱导上调9.5倍和11.2倍。不同供磷条件下的Real-timePCR结果也进一步证实了ZmPht1；5的表达受低磷胁迫诱导显著上调表达，且表达强度高，预示着ZmPHT1；5的启动子在作物磷高效育种中具有很高的应用潜质。目前，检索显示未见玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的相关研究和报道。

发明内容

针对当前研究现状，本发明要解决的问题是提供一种可用于作物磷高效育种的低磷胁迫诱导性的玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体及其在作物磷高效或耐低磷育种中的应用。

本发明所述的玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体是位于玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因起始密码子ATG上游的295bp的连续核苷酸序列，该缺失突变体命名为玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体M2P-7；其中所述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述缺失突变体M2P-7的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子序列是首先根据ZmPHT1；5基因的序列号GRMZM2G041595检索玉米MaizeGDB数据库，获取其核酸序列，然后利用ZmPHT1；5基因翻译起始密码子ATG上游约2.5kb的碱基序列和其CDS 5'端序列设计引物，以玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的ZmPHT1；5基因5'端翻译起始密码子ATG上游的1895bp的连续的核苷酸序列(图1)，命名为M2P-1(全长启动子)。

依据上述1895bp碱基序列，设计ZmPHT1；5启动子5′系列缺失突变体的引物，同时在上下游引物的5′端分别引入HindⅢ和BamHI酶切位点，利用PCR扩增获得不同长度的启动子缺失片段，利用两端的酶切位点将系列启动子缺失片段定向连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，构建ZmPHT1；5启动子的系列缺失植物表达载体(见图2中M2P-1～M2P-8启动子片段与GUS基因的连接示意图，ATG中的A为+1)。将上述构建好的植物表达载体分别导入大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定(图3)和测序确认，鉴定正确后将上述质粒分别命名为：M2P-1、M2P-2、M2P-3、M2P-4、M2P-5、M2P-6、M2P-7和M2P-8，其中M2P-1为ZmPHT1；5全长启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；缺失突变体M2P-7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述用于构建ZmPHT1；5启动子5’端系列缺失突变体的核酸序列可为全长启动子序列M2P-1；亦可为该启动子的片段序列M2P-2～M2P-8；也可为人工修饰改造后仍具有类似该启动子活性的碱基序列。

鉴于从事本专业相关研究的专业人员很容易通过定向突变等方法对本发明中所述的启动子及其缺失突变体的核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰但具有与本发明中提供的启动子片段核酸序列同源性≧60％且仍具有启动子活性的核苷酸序列均视为本发明所述启动子碱基序列的衍生物，等同于本发明所述核酸序列，属于本专利的保护范畴。

含有上述启动子及其缺失片段的重组载体、转基因细胞系、重组菌和转基因植株均属于本专利保护范围之内。

本发明所述的玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体在作物磷高效或耐低磷育种中的应用。

其中，所述的磷高效或耐低磷育种是通过利用玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体在植物体内启动磷高效或耐低磷相关基因的表达实现；所述磷高效或耐低磷是指植株在器官、组织、细胞或整株水平上表现出的磷利用效率的提高或低磷耐受性提高或其组合；所述作物是指双子叶植物或单子叶植物，其中双子叶植物是指小麦、棉花、大豆或烟草；单子叶植物是指玉米、高粱或水稻，优选是指烟草或玉米。所述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体优选玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体M2P-7。

上述应用优选是玉米高亲和磷转运体ZmPHT1；5基因启动子的缺失突变体M2P-7在玉米磷高效或耐低磷育种中的应用。

本发明是依据玉米高亲和磷转运体基因(ZmPHT1；5)的cDNA序列与MaizeGDB数据库中的玉米高通量基因组数据进行BLAST，最终获得该基因5′端上游1895bp的碱基序列作为全长启动子M2P-1，以此核苷酸序列为模板设计5′端系列缺失引物，PCR扩增得到不同长度的启动子缺失片段M2P-2～M2P-8，将其分别连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，通过农杆菌介导的遗传转化法转化本生烟草。

具体的，是将玉米高亲和磷转运体基因(ZmPHT1；5)的全长启动子M2P-1及不同长度的缺失片段M2P-2～M2P-8分别构建植物表达载体，利用农杆菌介导法转化本生烟草，转化叶盘在含有潮霉素的培养基上诱导和筛选抗性细胞并分化小苗。分化的小苗进一步经PCR检测鉴定(图4)，阳性植株收获后代种子进行繁代，后代进行遗传学分析，根据其分离比筛选出T2/T3代单拷贝纯合株系用于后续实验。

选取M2P-1～M2P-8纯合单拷贝株系，分成两组，一组在含400uM KH₂PO₄的1/2MS培养基上培养(+P)；一组在去掉磷元素的1/2MS培养基上培养(-P)。与+P培养的烟草相比，在低磷处理至第7天时，植株表现出明显的生长抑制，处理至12天时生物量差异进一步加大(图5)。测定低磷处理至第7天和12天时植株体内有效磷浓度，发现与+P培养的对照相比-P培养的烟草的地上部分和根系有效磷浓度均显著下降，且随着时间的延长有效磷浓度下降幅度显著增加(图6)。测定低磷处理7天和12天转基因烟草的GUS酶活性，发现M2P-1～M2P-8的表达均显著受到低磷胁迫的诱导表达，且M2P-7具有显著更高的启动子活性，远高于目前双子叶植物转基因中最常用的35S启动子(图7)。

综上，通过对M2P-1～M2P-8转基因烟草进行低磷胁迫处理实验，明确了M2P-1及其缺失突变体M2P-2～M2P-8为低磷胁迫诱导性启动子。其中M2P-7序列仅295bp，在M2P-1～M2P-8中启动子活性最高，并且能够赋予目的基因在转化的细胞中具有明显的低磷胁迫诱导特性，为高强度启动基因表达的低磷胁迫诱导性启动子。

将筛选获得的M2P-7启动子片段转入玉米中，潮霉素筛选、PCR检测和GUS组织化学染色筛选出阳性植株，连续自交结实获得纯合系种子用于后续的基因表达分析。检测M2P-7启动子调控下的GUS表达模式，明确M2P-7在玉米中也能够高效驱动目的基因的表达。对M2P-7转基因玉米进行低磷胁迫处理，可显著提高GUS基因的表达水平，表明M2P-7启动子片段是低磷胁迫诱导型强表达启动子，在玉米抗逆育种中具有很好的应用前景。

本发明通过玉米高亲和磷转运体基因(ZmPHT1；5)的全长启动子M2P-1的核苷酸序列构建了5′端系列缺失植物表达载体M2P-2～M2P-8，检测M2P-1～M2P-8在转基因烟草中启动GUS表达的特性，明确了M2P-7具有高的启动子活性，且具有明显的低磷胁迫诱导性。进一步在转基因玉米中检验M2P-7的启动子特性，发现M2P-7在玉米中也能够高强度启动基因表达，是低磷胁迫诱导性强启动子。本发明体现的主要价值和有益效果是：

1)本发明为植物磷高效或耐低磷育种提供了胁迫诱导性强启动子M2P-7，该类启动子正是作物磷高效或耐低磷育种中所急需的。

2)本发明提供的M2P-7启动子在植物受到低磷胁迫时可大幅度提高抗逆基因的表达，达到正常条件下的2倍以上，实现了提高植物的低磷耐受性或磷利用效率。因此该M2P-7启动子可在一定程度上实现抗逆基因的“适时”表达，在提高植株抵抗外界不良环境的能力的同时减少宿主细胞不必要的能量浪费和对植株正常生长的影响，有利于促进低磷环境下作物产量的形成。

3)本发明提供的M2P-7启动子不仅具有低磷胁迫诱导特性和强的启动基因表达能力，而且其序列仅有295bp，便于基因的重组和植物的遗传转化，在农作物抗逆育种中具有很好的应用前景。

附图说明

图1：玉米高亲和磷转运体基因(ZmPHT1；5)的全长启动子M2P-1的克隆。

其中M：分子量marker DL2000；M2P-1：ZmPHT1；5全长启动子的PCR扩增产物的电泳检测结果。

图2：不同长度的ZmPHT1；5启动子片段与GUS报告基因的连接示意图(ATG中的A为+1)。

图3：M2P-1～M2P-8植物表达载体的酶切鉴定示图。

其中M：分子量marker DL2000+；M2P-1～M2P-8为系列植物表达载体。

图4：M2P-1～M2P-8转基因本生烟草的PCR鉴定结果。

其中M：分子量marker DL2000；WT：非转基因对照植株(阴性对照)；+：质粒(阳性对照)；1-7：转基因烟草阳性植株。

图5：M2P-1～M2P-8转基因本生烟草低磷处理至第7天和12天时的地上部分和根系生物量差异。

图6：M2P-1～M2P-8转基因本生烟草低磷处理至第7天和12天时的地上部分和根系有效磷浓度变化。

图7：M2P-1～M2P-8转基因本生烟草低磷处理至第7天和12天时根、茎和叶片的GUS酶活检测。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。涉及的试剂、载体、菌株若无特殊说明，则均为公知的销售渠道获得。

实施例1：ZmPHT1；5启动子的克隆

1)根据ZmPHT1；5基因的序列号GRMZM2G041595检索玉米MaizeGDB数据库，获得ZmPHT1；5基因起始密码子ATG上游约2.5kb的核酸序列和CDS 5'端序列用于引物设计。

2)依据上述碱基序列，利用PRIMER5.0设计引物。

上游引物为5'ATAGCCTGAGTAGCAATCCA 3'；

下游引物为5'GGTTGCCATAAAGTGGTAGA 3'。

3)CTAB法提取玉米基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，体系如下：

PCR反应体系：10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌水补足25μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸5min。

4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收目的片段，具体步骤参照说明书。利用基因克隆试剂盒(全式金公司)将目的片段连到pEASY-B克隆载体上，转化Trans-1感受态大肠杆菌，具体按照试剂盒说明书进行。向转化的大肠杆菌管中加入约0.8ml LB培养基，37℃ 200rpm振荡培养1h，4000rpm离心5分钟，收菌后涂板。涂板培养基中含50mg/L的Kan(筛选阳性克隆)，其表面涂布有IPTG和X-gal(蓝白斑筛选)。

5)挑取4-6个白色克隆，在LB液体培养基(50mg/L Kan)中震荡过夜培养，次日收菌，提取质粒，进行酶切鉴定，质粒提取流程见《分子克隆实验指南Ⅲ》24—28页，酶切鉴定参照限制性内切酶的说明书。酶切正确的质粒送交华大基因测序，进一步明确该克隆的正确性。

实施例2：ZmPHT1；5启动子及缺失片段的植物表达载体构建及大肠杆菌和农杆菌转化

1)依据ZmPHT1；5全长启动子的核苷酸序列，利用primer5.0设计ZmPHT1；5全长启动子及系列缺失片段的引物，共8对，同时引入HindⅢ和BamHI酶切位点，便于后续质粒的重组。引物序列见下表：

2)以含M2P-1序列的质粒为模板，进行PCR扩增，以获得系列启动子缺失片段。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收目的片段(具体参照说明书进行)。

PCR体系：5×PCR Buffer(含Mg²⁺)5μL，引物Ⅰ1μL(10μM)，引物Ⅱ1μL(10μM)，dNTP 2μL(2.5mM)，高保真DNA polymerase 0.25μL(5U/μl)，质粒1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序:95℃预变性5min；95℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1.5min(具体依据序列长度进行调整)；35个循环后72℃延伸5min。

3)将回收的目的片段和pCAMBIA1391Z质粒用HindⅢ和BamHI进行双酶切(Fermentas公司，酶切程序参见说明书进行)。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收产物(具体参照说明书)。

4)将3)中回收的酶切后的目的片段与载体进行连接。目的DNA片段与质粒载体连接时的摩尔比控制在3:1～5:1，体系如下为10×缓冲液2μL，T4DNA Ligase 1μL，载体片段50-100ng，DNA片段与载体摩尔比对应的量，ddH2O补足至20μL。混匀后置于PCR仪中，22℃条件下10分钟，65℃条件下10分钟，10℃条件下10分钟。连接后产物直接用于大肠杆菌转化。

5)大肠杆菌转化

从-80℃冰箱中取出50μL感受态大肠杆菌，置于冰上，加入连接产物后混匀；冰浴30分钟，同时融化固体培养基，冷却至50℃左右加入Kan(50mg/L)后倒平板；42℃热激90秒后，迅速将其冰浴2分钟；向管中加入800μL液体LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于摇床，37℃，200rpm，1小时，使其复苏；在已倒好的平板表面将100μL IPTG(0.1M)和20μL X-gal(20mg/mL)涂匀，用于蓝白斑筛选；复苏后，5000rpm，离心3分钟，将上清移除，剩余约100μL，用枪轻轻吹打沉淀使菌散开；将其涂布于准备好的平板上，倒置平板放入培养箱中，37℃，过夜培养；挑取单克隆，保菌并提质粒进行酶切鉴定，并进一步进行测序确认。

6)农杆菌转化

YEP培养基25mL(利福平50mg/L)接入约100μL GV3101农杆菌，28℃，190rpm，过夜培养；次日收取菌液2mL加入25mL YEP培养基(含利福平50mg/L)中，培养至OD＝0.8左右；将菌液分装到2个7mL管中，每个5mL，冰浴30分钟，在此过程中配20mM的CaCl₂于7mL管中，放置冰上备用；菌液5000rpm离心10分钟，收菌后，每管加2mL0.15mol/L NaCl(灭菌且4℃预冷)，轻轻弹起；4℃，5000rpm，离心10分钟，弃上清，每管加入200μL 20mmol/LCaCl₂，混匀后合成1管，以200μL每管分装至1.5mL离心管中；每管加入8μL重组质粒，混匀后静置冰浴30分钟；液氮速冻90秒，迅速置入37℃水浴锅3分钟；加入1mLYEP培养基(未加抗生素)，28℃,200rpm复苏1小时；融化YEP固体培养基，冷却至50℃，加入利福平和Kan后倒平板；5000rpm，离心3分钟后，收菌涂平板，28℃，倒置暗培养2天；挑单克隆，鉴定正确后保菌。

实施例3：本生烟草的转化和转基因植株的获得

1)农杆菌介导的本生烟草转化的具体步骤：

(1)取农杆菌阳性菌株，过夜培养至对数生长期(OD₆₀₀约0.6左右)。

(2)5000rmp离心10min，菌体用同体积的A2培养基悬浮。

(3)将烟草无菌苗叶片切成2.5mm²左右的小块，置入A2悬浮的菌液中，浸染10分钟左右。

(4)取出叶片置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后转至A2固体培养基上，26℃暗培养约3天。

(5)共培养后叶片切块，转移至含15mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的A3选择培养基上，每隔7天继代1次，连续筛选3代。

(6)切下抗性小芽，转至含200mg/L头孢霉素的A4培养基上壮苗。

(7)将(6)中小苗转至A5生根培养基中，诱导生根。

(8)生根小苗长到5-6cm后移栽至购买的营养土中。

烟草转化培养基如下：

A1培养基：1/2MS培养基无机盐，MS培养基维生素，0.7％琼脂，1％蔗糖，pH6.0；

A2培养基(浸染培养基)：B5培养基成分，3％蔗糖，250mg/L NH₄NO₃，0.5g/L MES，0.7％琼脂(for plate)，pH6.0；

A3培养基(诱导生芽培养基)：B5培养基成分，2％蔗糖，250mg/L NH₄NO₃，0.5g/LMES，0.1mg/L IAA，1mg/L 6-BA，0.7％琼脂，pH6.0；

A4培养基(壮苗培养基)：A3培养基，去掉IAA，pH6.0；

A5培养基(生根培养基)：1/2MS培养基无机盐，MS培养基维生素，0.5g/L MES，3％蔗糖，0.7％琼脂，pH6.0。

2)转基因植株的鉴定

试管苗移栽后，首先进行PCR检测，阳性植株进一步GUS染色鉴定，两者均为阳性的植株用于收获后代种子。

(1)PCR检测

CTAB法提取烟草基因组DNA：取少许叶片置于1.5ml管中，液氮冷冻研磨；加入400μL65℃预热的2×CTAB，65℃温育40分钟，中间不间断震荡；取出冷至室温，随后加入400μL氯仿：异戊醇(24:1)混合液，抽提10分钟；取上清200μL加入400μL4℃预冷的无水乙醇，混匀，-20℃静置30分钟；12500rpm，4℃，离心10分钟；沉淀用70％乙醇洗2次(第1次15分钟，第2次至少3小时)；DNA晾干后，加适量TE溶液，65℃水浴溶解40分钟；溶好的DNA置于-20℃冻存。

PCR体系：PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL；引物Ⅰ和引物Ⅱ(10μM)各1μL；dNTP0.5μL(10mM)；Taq DNA聚合酶0.125μL(5U/μl)；DNA模板1μL；ddH₂O补足至25μL。

PCR程序：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟；58℃退火1分钟；72℃延伸1分钟；35个循环后72℃延伸5分钟。

(2)GUS染色

GUS染色液：0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)0.5mL，Fe²⁺10μL，Fe³⁺10μL，Trition100(10％)10μL，EDTA(0.5M,pH8.0)20μL，X-GLUC 20μL，H₂O补足至1mL。

GUS染色步骤：取适当大小叶片，置入GUS染液中；避光0.05MPa抽真空15分钟；37℃染色16小时；70％乙醇脱色后观察。

实施例4：转基因烟草的GUS酶活检测

1)GUS酶活检测试剂的配制

反应液：0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)50mL，10％十二烷基肌氨酸钠1mL，0.5M EDTA(pH8.0)2mL，10％Trition100 1mL，β-巯基乙醇100μL，水补至100mL。

10mM 4-MUG母液：5mg 4-MUG加到1.42mL反应液中。

1mM 4-MUG检测液：450μL反应液+50μL 10mM/L 4-MUG母液。

反应终止液(0.2mol/L NaCO₃)：NaCO₃ 10.6g，水定容至500mL。

2)GUS酶活标准曲线的制定

用反应终止液将1mM的4-MU母液稀释成10nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4μM的浓度梯度，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10秒，狭缝宽度5nm，电压550V条件下测定各浓度溶液的荧光值，绘制标准曲线。

3)GUS荧光活性测定

取适量叶片，加1mL 4℃预冷的反应缓冲液磨碎，转入1.5ml离心管中置于冰上抽提10分钟，期间不断混匀；12500rpm，4℃，离心10分钟；取100μL上清液加入37℃预热的1mL检测液中迅速混匀，迅速取出80μL加入到720μL终止液中，将该管的酶活值作为酶促反应的空白对照。剩余上清用于蛋白的测定；分别在10、20、30、40和60分钟时取出80μL上述检测液加入到720μL终止液中，迅速混匀；用荧光分光光度计测定上述终止液的荧光值，激发波长365nm、发射波长455nm，狭缝宽度5nm，扫描时间10秒，电压550V；各样品酶活力的计算(单位：nM 4-MU/min mg protein)：依据上述2)中绘制的标准曲线，求出相应4-MU含量，以反应时间对4-MU含量作图，直线部分的斜率为酶促反应速率。

4)蛋白定量

取蛋白提取液30μl，Bradford法测定蛋白含量(Bradford MM,A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein–dye binding.Ann.Biochem.,1976，72:248–254.)。

实施例5：M2P-1～M2P-8转基因本生烟草的低磷胁迫响应特性分析

1)材料的培养

将烟草种子置于1.5mL离心管中，70％乙醇处理1min，然后5％次氯酸钠灭菌7min，无菌水冲洗5-6遍，灭菌后的烟草种子涂布于1/2MS固体培养基表面,置于暗处萌发3天，置于光下继续培养10天左右。随后分成两组，一组在含400uM KH₂PO₄的1/2MS培养基上培养(+P)；一组在去掉磷元素的1/2MS培养基上培养(-P)。处理7天和12天后测定生物量、有效磷含量和GUS酶活性。

2)生物量测定

取+P和-P处理7天和12天小苗的根和地上部分分别称重。

3)有效磷含量的测定

(1)取0.3克新鲜叶片在液氮下研磨成粉末，加入0.5mL 10％的高氯酸研磨均匀。

(2)用5％的高氯酸将匀浆液稀释10倍，冰浴30分钟。

(3)4℃，12500rpm离心10分钟，上清液用于有效磷含量的测定。

(4)取1mL上清与2mL工作液混合，40℃温育20min。(工作溶液：溶液A和溶液B按体积比6:1混合。溶液A(硫酸-钼酸铵溶液)：0.25M H2SO4中含有0.4％(w/v)的钼酸铵。溶液B(10％抗坏血酸溶液)：2g抗坏血酸溶于水中，定容至20mL。)

(5)反应液在冰上冷却后，于820nm波长下测定吸光值。

(6)标准曲线绘制：将60mg/L的标准磷溶液用提取液稀释，分别制成0.6、1.2、2.4、3.6、4.8和6mg/L的磷溶液。提取液用10％(w/v)的高氯酸和5％(w/v)的高氯酸按体积比1:9混合配制。用提取液与工作液的反应液作空白对照。

(7)计算有效磷浓度(mg Pi/g Fresh Weight)。

4)不同供磷条件下M2P-1～M2P-8转基因烟草的GUS酶活测定

分别收取+P和-P处理7天和12天小苗的根、茎和叶片，进行GUS酶活测定，对GUS酶活测定结果统计分析，计算其酶活速率；GUS酶活测定具体步骤按照实例4中的程序进行。

结果表明M2P-1～M2P-8的表达均显著受到低磷胁迫的诱导表达，且M2P-7具有显著更高的启动子活性，远高于目前双子叶植物转基因中最常用的35S启动子(图7)，为高强度启动基因表达的低磷胁迫诱导性启动子。

实施例6：M2P-7转化玉米评估其在玉米磷高效或耐低磷育种中的应用潜质

1)以玉米齐319自交系为材料进行农杆菌介导的遗传转化。种子灭菌后萌发，其茎尖离体培养产生丛生芽，最终以丛生芽为受体进行转化。培养基如下：

种子萌发培养基：KI 0.83mg/l，KNO₃ 1900mg/l，KH₂PO₄·H₂O 170mg/l，CaCl₂·2H₂O440mg/l，H₃BO₃ 10mg/l，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l，MgSO₄·7H₂O370mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，NH4NO₃ 1650mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，蔗糖30g/l,酪蛋白水解物500mg/l,生物素0.05mg/l，肌醇100.0mg/l，琼脂粉7g/l，pH6.0，用于种子萌发(液体培养基中不加琼脂)。

A培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加2,4—D 1.0-3.0μmol/l和6-BA 4.5-9.0μmol/l。

B培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l。

成苗培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l。

生根培养基：在上述种子萌发培养基的基础上添加IBA 2.8-3.6μmol/l。

培养基经高温高压灭菌，抗生素及除草剂等活性成分应经高压过滤灭菌。

2)种子灭菌和萌发：玉米种子70％乙醇灭菌8分钟，0.1％氯化汞灭菌10分钟，无菌水洗涤6-7遍。灭菌后种子置于培养瓶中萌发，于28℃黑暗处萌发2天。种子露白后转移到基本培养基中，继续培养(28℃，黑暗)。

3)茎尖的离体培养：萌发种子的胚芽长到3-5厘米时，剥离胚芽鞘和幼叶，切取5毫米左右的上胚轴和茎尖，接种在A培养基中，26℃暗培养(在此过程中要注意及时切除伸长的下胚轴和幼叶)。

4)丛生芽组织的诱导、继代和分化：离体茎尖在培养7-10天后开始不规则膨大，在膨大分生组织处有指状和瘤状突起。20天后，在突起表面开始形成不定芽和胚状体。通常4周继代1次。继代培养过程中，若发现丛生芽组织块上的丛生小芽过多，则将2,4-D浓度调整为3.0μmol/l；若发现丛生芽组织块上的愈伤组织化比较严重，而不定芽少，则将2，4-D浓度降至1.0μmol/l，进行继代培养直至产生大量的指状或瘤状突起(在A培养基上进行培养的组织块中，有少数材料会产生不定根，要注意及时切除)。将丛生芽组织块再次转移到B培养基上培养2-3天，其质地变得较为柔韧，色泽则慢慢变黄。利用扫描电镜观察可看到各个时期的胚状体和不定芽。胚状体和不定芽迅速发育，在其表面上产生丛生小芽。

5)以丛生芽为受体进行农杆菌介导的遗传转化

将含有M2P-7质粒的农杆菌GV3101在LB液体培养基(含有50mg/L Kan)中震荡培养(28℃，200rpm)至对数期。3500rpm,离心10分钟，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(不加琼脂粉)进行洗涤，离心收菌。用含100μM/L的乙酰丁香酮的1/2浓度的丛生芽诱导培养基进行悬浮(稀释5-20倍)后，用于遗传转化。

以已培养12-18天的丛生芽组织块为受体进行遗传转化，随后在黑暗处恢复培养。将农杆菌感染后的丛生芽或组织块在含250mg/L头孢霉素的培养基上抑菌培养(暗处)，然后将丛生芽或组织块转到筛选培养基中筛选(3-4代)。筛选过程中大量丛生芽组织块死掉，存活组织块转到不含筛选剂和2,4-D的A培养基上培养，直至产生抗性小芽。

切下抗性小芽，转移到成苗培养基上(光强2000-3000lx，光照14-16h/d)。当小苗长至3-4叶期时，转到生根培养基中诱导生根。生根后小苗移栽至蛭石中(洗去粘附的培养基)。植株生长条件为：自然光下，日/夜温度22-28℃/16-21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐营养液。两周后产生大量根系，将其定植于田间生长。

6)转基因植株的鉴定

取转化的玉米植株叶片，提取DNA，进行PCR扩增，阳性植株进一步进行GUS染色鉴定。两者均为阳性的植株收获种子，繁殖后代。玉米叶片DNA的提取同实例3中烟草叶片的提取；PCR反应体系及程序和转基因玉米的GUS组织化学染色程序同实例3中所述。

7)以M2P-7T3代转基因纯合玉米植株为材料，开展低磷胁迫处理实验

低磷胁迫处理实验:将种子播种在砂盆中，从三叶期开始一半浇灌含400uM KH₂PO₄的1/2MS培养液，另外一半浇灌去掉磷元素的1/2MS培养液。在胁迫处理至15天和21天后分别取材进行GUS酶活测定。实验结果表明M2P-7在玉米中具有很高的启动基因表达能力，并且明显受低磷胁迫诱导，为低磷胁迫诱导性强启动子，在玉米磷高效育种中具有重要的应用价值。

序列表

<110> 山东大学

<120> 玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体及其应用

<141> 2019-6-8

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1895

<212> DNA

<213> 玉米

<221> 玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的核苷酸序列

<400> 1

atagcctgag tagcaatcca ataagctcat gagtttcgaa gtagctgctg catccacaag 60

agaatctatt cttggtaatg ggaattcatt cttcggacat gccttgttaa gatccgtaaa 120

gtcaatacac attttccatt tgccatttgc tttctttaac atgacggtgt tggccagcca 180

ctctaggacc tagagtctag gtatgttact tctctgataa cgccggcact tagaagtctt 240

ttcacatcat ttcgtgcacc ttcggcttta tcatcagaaa ttttcctaaa cctctgcttt 300

cttggtctga aggacaagtc cacattgagt gattgctcaa tatgtctcta ttgatgccac 360

atagatcatt agccgtccaa gcaaaaacat cttctgtgta ccgcctgatg aagggtcctt 420

gcactccaac atgttgtacc cttatgtgtg cttctttctt ttgcctcttg ttagctggtt 480

tagagcttga gcccccctgt gattgggagc aacagcttca tagccgaatg tgccacaact 540

tggttggttt gcgaagccat cattggggtt gtggaagtga gttcaccgga ggtggatgcc 600

aatattgttc atttattctc aaatgctatt aattaagaac aagacaacac aattgttaat 660

ggttaaagac cttcgtcctt tggaatatta ttttctctcg gatataataa tctttagacg 720

aaggtcatga aggacacacc ttcatcattt tacaatataa acacgaatat aagtaataaa 780

atgaaagaat atagaggaat gaagataata tttgttatat gtttatgatt catttagatt 840

aattaaacat gaataagcat taacgatatc catattacaa tggtaccttc ggtttgctgg 900

aaggtgggag agcgagaatg gctcaagagt gtgatcacaa ttcagcgtga acagtacggt 960

ggtactgttc atctatttat aggcacggga cgcagcctgg gtaaaattac atccatgcac 1020

ttgaacattt gtttacaagc aactaaaact aataaggtct atttagtcat ttgttcttct 1080

ttgtttggtc tagaccgaag ctattgagct tcgttattct gcattgtcgc ctctatgtag 1140

agtcttcgtc ttgaggggct aaactgagtc ttaaggtagc tttgacgagc ctttgtatta 1200

ttttgccgaa gttgtttttc ctttagtacc ttcggcggag aagaagacca ccaacagata 1260

tactccatcc ctccattaca aattataatt cgtttgactt tttaccctac atttgaccat 1320

tcgtcgtatt aaaatattta taattattat tacttttacc gtgatatcgt ttaccatata 1380

atatacatta ataacttcaa aattttcatt tttcgtaaac atttttaata agacgagctc 1440

gttaaacttg ttataaattt ggacaaatga gtacatagat acttacgtcc ctgaagattc 1500

tgaccaatag acggcgtagt aatttctgca caatcccatt ccagtgacat agaaattatt 1560

ttgttttagg taatctataa ggtccattcc acgcgtagaa cttgtcgtac atactagtgt 1620

gttgcaagaa ggatattcgg cacatatcca tttgcccagt tttctgaacg cagttggcga 1680

gaataaacta tgcctaggag tgttggatca ttcagttagg cttttatgtt ggtgtcttat 1740

ccaatataag ctattgcaaa tgatctccat atgtctccta caggggacac aaccctgaag 1800

caaacctctt gaaaaaacga cagtttctga cactccattt ctctgcaggc cggagtggct 1860

tgcagcaaga gctcgcgaga gggagaagaa gacca 1895

<210> 2

<211> 295

<212> DNA

<213> 玉米

<221> 玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体M2P-7的核苷酸序列

<400> 2

cttgtcgtac atactagtgt gttgcaagaa ggatattcgg cacatatcca tttgcccagt 60

tttctgaacg cagttggcga gaataaacta tgcctaggag tgttggatca ttcagttagg 120

cttttatgtt ggtgtcttat ccaatataag ctattgcaaa tgatctccat atgtctccta 180

caggggacac aaccctgaag caaacctctt gaaaaaacga cagtttctga cactccattt 240

ctctgcaggc cggagtggct tgcagcaaga gctcgcgaga gggagaagaa gacca 295

Claims (3)

1.一种玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体是位于玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因起始密码子ATG上游的295bp 的连续核苷酸序列，该缺失突变体命名为玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体M2P-7；其中所述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体M2P-7的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体在作物磷高效或耐低磷抗逆育种中的应用，其中所述作物为烟草或玉米。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的磷高效或耐低磷育种是通过利用所述玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体在所述作物体启动磷高效或耐低磷相关基因的表达实现；所述磷高效或耐低磷是指植株在器官、组织、细胞或整株水平上表现出的磷利用效率的提高或低磷耐受性提高或其组合。

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