CN103642833A - 含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因bki1的植物表达载体的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建。所构建的植物表达载体pOX-BKI1是由苹果BKI1基因插入植物表达载体pRI101AN质粒进行重组反应得到。将该植物表达载体用于植物遗传转化，BKI1基因在CaMV35S启动子的启动下过量表达，阻断了油菜素甾醇的信号转导途径，对植物生长发育产生负调控作用，抑制了植物茎及主干的伸长，起矮化植株的作用。

Description

含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1及其植物表达载体的构建方法。

背景技术

油菜素甾醇（Brassinosteroids,BRs）是一种广泛存在于植物中的类固醇激素，在植物的生长发育过程中起重要作用。调控了植物生长发育的各个过程，包括细胞的伸长、细胞的分裂、衰老、维管束的分化、雄性育性和光形态建成，以及对生物和非生物胁迫的抗性等。

油菜素甾醇信号转导途径由多基因参与，其中，细胞膜上的BKI1蛋白是该信号途径的一个负调控因子，BKIl作为BRIl的底物，当细胞中甾类分子浓度低时，BKIl于质膜上和BRIl的同源二聚体相互作用，抑制BRIl与BAK1的相互作用，对BR信号转导途径起到抑制作用。当甾类分子与BRIl的胞外域结合时，诱导BRIl的磷酸化，BKIl与BRIl分离，从而激活BR信号传递途径，这与BR生物合成的反馈抑制相一致。过量表达BKI1基因的转基因拟南芥植株表现为株型矮化（Wang et al.,2006）。

苹果是世界性果树，其产量名列果品的前三名。我国是苹果生产大国，栽培面积约2000万亩，产量超过2985万吨，面积和产量均居世界第一位。随着苹果产业的逐年扩大和集约化生产的需要，培养矮化新品种是目前苹果产业的育种目标之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1（BRI1kinase inhibitor1）。

本发明的另一目的是提供含有该苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体及其构建方法。

本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：

苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的克隆方法如下：以苹果幼嫩叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA，设计特定引物扩增苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1：

上游引物：5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’

下游引物：5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pGM-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，得到序列如SEQ ID NO.1所示的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1。

上述的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1，所述的苹果为“寒富”苹果。

含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建，方法如下：

1)提取苹果叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

2)以cDNA为模板，通过设计的特定引物，PCR扩增得到上游和下游分别引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的BKI1基因；

其中，所述的特定引物是：

上游引物P1：5’-CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’；

下游引物P2：5’-GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3’；

3)将带有酶切位点的BKI1基因，连接到克隆载体pGM-T上，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pGM-BKI1；

4)限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分别对提取的阳性质粒pGM-BKI1和表达载体pRI101AN进行双酶切，将得到的BKI1基因片段插入到表达载体pRI101AN中，构建含有苹果油菜素甾醇途径号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体pOX-BKI1。

本发明的有益效果：

1.本发明构建的含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体，为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，获得BKI1超表达新种质。

2.本发明提供的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1是一个新的苹果油菜素甾醇负调控因子BKI1编码基因，该基因为油菜素甾醇信号转导途径的重要成员之一。通过实验，将苹果BKI1基因转入烟草中，使其在烟草中表达，至转基因烟草植株开花后调查其株高，发现转基因烟草植株主干的伸长与对照相比，显著受到了抑制；同样，将苹果BKI1基因转入‘寒富’苹果，使其在苹果中超量表达，在大田培养4个月的转基因苹果与对照相比，表现显著的矮化趋势。说明超量表达苹果BKI1基因起到了矮化植株的功能。

附图说明

图1为植物表达载体pOX-BKI1构建方法示意图。

图2为实施例1制备的苹果BKI1基因的PCR扩增电泳图；

其中，M：100bp Marker；1，2：BKI1基因；3：清水对照；。

图3a为引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的BKI1基因的PCR扩增电泳图；

M：100bp Ladder DNA marker；1：BKI1基因。

图3b为pGM-BKI1质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的电泳检测图；

M：100bp Ladder DNA marker；2：从pGM-BKI1质粒上酶切下来的BKI1基因。

图3c为pOX-BKI1表达载体质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的电泳检测图；

M：100bp Ladder DNA marker；3：从pOX-BKI1表达载体质粒上酶切下来的BKI1基因。

图4为转基因烟草植株BKI1基因表达检测的RT-PCR扩增电泳图；

M：100bp Marker;1：对照植株；2：转基因植株。

具体实施方式

实施例1：苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1编码区序列的克隆

植物材料为“寒富”苹果。

1.总RNA的提取及反转录成cDNA

（1）取自然条件下正常生长的幼嫩叶片（0.05～0.1g），在液氮中研碎，迅速移入1.5ml离心管中；

（2）加入600μL预热的2%CTAB提取缓冲液（预热前加入0.4%β-巯基乙醇；40U RNA酶抑制剂），65℃保温20～30min，期间颠倒几次；

（3）加入600μL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒若干次，10000r/min离心10min；

（4）把上清液（约500μL）移入新的1.5ml离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒若干次，10000r/min离心10min；

（5）取上清液（约400μL）移入新的1.5mL离心管，加入1/4体积的10M LiCL，颠倒混匀，–20℃放置1h，10000r/min离心10min；

（6）弃上清，加入400μL DEPC水溶解沉淀，14000r/min离心10min。弃沉淀，用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；

（7）加入1/10体积的3M NaAc（pH5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰冷的无水乙醇（-20℃），颠倒混匀，–20℃放置30min，10000r/min离心10min；

（8）弃上清，加入100μL DEPC水，待沉淀溶解后，加入4μL RNase-free DNase I（5U·μL^-1），Buffer10μL，1μL RNasin（40U·μL^-1），轻轻混匀后在37℃水浴4h；

（9）加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒若干次，10000r/min离心10min；

（10）取上清液（70μL）加入1/10体积的3M NaAc（pH5.2），2.5倍体积冰冷的无水乙醇，颠倒几次，混匀后–70℃放置1h，10000r/min离心10min；

（11）弃上清，用70%乙醇洗涤RNA沉淀2次，在超净工作台上风干RNA，加入30μL DEPC水溶解沉淀；

（12）利用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将RNA反转录为cDNA。

2.利用Primer Primer5.0软件分析设计引物扩增BKI1

上游引物：5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’

下游引物：5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’

以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应；

PCR反应体系为：取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer2μL，dNTPs(2.5mmol·L^-1)1.6μL，正反向引物各1μL，最后用水补足到20μL；

PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；

PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图如图2所示，从图2可见一条1206bp的目的条带。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，回收后取1μL回收产物与pGM-T载体进行连接，操作步骤按天跟公司产品pGM-T试剂盒说明书进行。然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在表面涂有24μg·mL^-1异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和40μg·mL^-15-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的含Amp（60μg·mL^-1）的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。挑取单个白色克隆，分别涂布于新的含有Amp（60μg·mL^-1）的LB培养基平板上（二转），37℃培养12～16h，将菌株穿刺培养后，送上海生工公司测序，得到如SEQ ID NO:1所示的“寒富”苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1。

实施例2：植物表达载体pOX-BKI1的构建

植物材料为“寒富”苹果。

1.总RNA的提取及反转录成cDNA

方法同实施例1的步骤1。

2.PCR扩增引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点

上游引物P1：5’-CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’

下游引物P2：5’-GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3’

以提取的叶片cDNA为模板，通过引物P1和P2，进行PCR扩增反应，在目的基因BKI1的上游和下游分别引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

回收后，取1μL回收的PCR产物与pGM-T载体进行连接，操作步骤按天根公司产品pGM-T试剂盒说明书进行，然后转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pGM-BKI1。

PCR反应体系：取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer2μL，dNTPs(2.5mmol·L^-1)1.6μL，正反向引物各1μL，最后用水补足到20μL；

PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳如图3a所示，从图3a可见一条1219bp的谱带，回收，测序，测得序列比原BKI1基因1206bp（SEQ ID NO:1序列）,5’端增加CGCAT，3’端增加GGGAATTC，共增加13bp，说明在苹果BKI1基因序列上游和下游分别引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的。

3.植物表达载体pOX-BKI1的构建

取载体pRI101AN（TaKaRa，Japan）和带有酶切位点的阳性质粒pGM-BKI1，用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，双酶切体系（40μL）：10×T buffer4μL，pGM-BKI1/pRI101AN34μL，NdeⅠ和EcoRⅠ各1μL；37℃酶切过夜；取质粒pGM-BKI1双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析如图3b所示，从图3b可见两条谱，其中一条较小片段大小为1208bp，比原BKI1基因1206bp（SEQ ID NO:1序列）5’端增加T，3’端增加G，共增加2bp，说明双酶切反应成功，证明含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点质粒pGM-BKI1构建成功。

用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收pRI101AN较大片段和pGM-BKI1较小片段。用T4DNA连接酶（NEB）连接两个回收产物，连接反应体系（10μL）：10×Ligase Buffer1μL，pRI101AN大片段1μL，pGM-BKI1小片段7.5μL，T4DNA连接酶0.5μL。16℃反应过夜，将BKI1基因片段插入pRI101AN中，得到重组质粒植物表达载体pOX-BKI1。

取10μL重组质粒植物表达载体pOX-BKI1转化TOP10感受态细胞。37℃培养12～16h，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳如图3c所示，从图3c可见，两条谱带，其中一条较小片段大小为1208bp，说明双酶切反应成功，初步证明苹果BKI1基因表达载体构建成功。

将1208bp的酶切片段回收，回收产物与pGM-T载体进行连接，挑取阳性克隆，提取质粒，送上海生工测序，测得含有序列SEQ ID NO:1所示的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控BKI1基因，所以近一步证明苹果BKI1基因表达载体构建成功。

实施例3：植物表达载体pOX-BKI1遗传转化烟草及其基因功能初步鉴定

1.农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

将冻存的农杆菌EHA105菌液在含有50mg·L^-1利福平（Rif）的YEP（pH=7.0）固体培养基上划线培养，28℃倒置培养48h，出现菌斑→挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含有50mg·L^-1Rif的YEP（pH=7.0）液体培养基中，28℃，200rpm/min振荡培养过夜（约16h）→取上述菌液按1:50比例接种于50mL含有50mg·L^-1Rif的YEP（pH=7.0）液体培养基中，28℃，150rpm/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右→取1.5mL摇好的菌液，冰上冷却10min→4℃，5000rpm/min离心5min，弃上清液液，收集菌体→加入等体积冰预冷的25mM CaCl₂溶液重悬沉淀，冰上放置20min→4℃，5000rpm/min离心5min，弃上清液→每管加入50μL预冷的25mM CaCl₂溶液重悬沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受态细胞在液氮中速冻后于-80℃超低温冰箱中保存。

2.将pOX-BKI1质粒DNA迅速加入制备好的50μL农杆菌感受态细胞中（约10μL），轻混，冰浴5min后于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min，然后加入800μL YEP（pH=7.0）液体培养基，28℃，160rpm/min震荡培养，4-6h后离心后剩约100μL菌液涂布于含50mg·L^-1Rif和50mg·L^-1Kan的YEP（pH=7.0）固体培养基中，28℃倒置培养48h，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于烟草叶片转化。

3.挑取已活化的含pOX-BKI1质粒的EHA105农杆菌单菌落。在添加了50mg·L^-1Kan和100mg·L^-1Rif的YEP液体培养基中，28℃条件下200rpm/min振荡培养，直至OD₆₀₀值达到0.8。然后将1mL的菌液移入到新的YEP液体培养基中，继续28℃200rpm/min振荡培养，直至OD₆₀₀为0.5。然后在25℃条件下，5000rpm/min离心5min收集菌体后，用等量MS液体培养基重悬备用。

4.将在三角瓶内继代生长30天的组织培养苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm的大小，置于步骤2中重悬好的菌液中，轻轻摇晃10min后取出，用无菌的干滤纸吸干叶块上多余的农杆菌菌液，然后置于再生培养基上。在黑暗条件下培养2-5d后，将烟草‘NC89’叶块转移到加入250mg·L^-1Cef和100mg·L^-1Kan的再生培养基中进行抗性芽筛选。在抗性芽再生出后，将抗性芽转移到新的附加250mg·L^-1Cef、100mg·L^-1Kan的增殖培养基中进行增殖培养，至得到纯合转化植株。

5.PCR鉴定及基因功能初步鉴定：

待抗性苗长至7～8片叶，提取烟草‘NC89’转基因植株幼嫩叶片RNA，进行RT-PCR检测目的基因是否转入

上游引物：5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’，

下游引物：5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’，

结果如图4所示，从图4可见，转基因植株出现了1206bp片段，而对照植株没有，说明苹果BKI1基因成功导入烟草中。

6.对转基因烟草表型观察

非转基因的烟草‘NC89’组织培养植株（4株）设为空白对照组，转入含有苹果BKI1的植物表达载体pOX-BKI1的烟草‘NC89’组织培养植株（10株）设为试验组，将两组组织培养植株同时移栽致大田，在相同栽培条件下，培养3个月，待全部植株开花后，分别测量各组烟草的株高。空白对照组平均株高为71.5cm，试验组平均株高为48.2cm。可见，转入苹果BKI1基因的烟草株高有所减少，表现为矮生的现象，说明BKI1基因的表达影响了烟草的发育，即表达苹果BKI1基因的烟草植株表现矮化，进一步说明苹果BKI1基因负调控烟草株高表型。

实施例4：植物表达载体pOX-BKI1遗传转化苹果表型观察

参照实施例3的方法，将植物表达载体pOX-BKI1转入‘寒富’苹果，将非转基因的‘寒富’苹果组织培养植株（5株）设为空白对照组，转入含有苹果BKI1的植物表达载体pOX-BKI1的‘寒富’苹果组织培养植株（12株）设为试验组，将两组组织培养植株同时移栽致大田，在相同栽培条件下，培养4个月，分别测量各组苹果的株高。空白对照组平均株高为36.7cm，试验组平均株高为18.9cm。可见，转入苹果BKI1基因的苹果株高有所减少，表现为矮生的现象，说明BKI1基因的超量表达影响了苹果的发育，即超量表达苹果BKI1基因的苹果植株表现矮化，进一步说明苹果BKI1基因负调控苹果株高表型。

Claims (3)

1.含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建，其特征在于方法如下：

1)提取苹果叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

2)以cDNA为模板，通过设计的特定引物，PCR扩增得到上游和下游分别引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的BKI1基因；

其中，所述的特定引物是：

上游引物P1：5’-CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’；

下游引物P2：5’-GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3’；

3)将带有酶切位点的BKI1基因，连接到克隆载体pGM-T上，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pGM-BKI1；

4)限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分别对阳性质粒pGM-BKI1和表达载体pRI101AN进行双酶切，将得到的BKI1基因片段插入到表达载体pRI101AN中，构建含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体pOX-BKI1。

2.如权利要求1所述的含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建，其特征在于：所述的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建，其特征在于：所述的苹果为“寒富”苹果。

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