CN116694676A - 一种敲除ZmABKHL10B-1基因在创制不同光周期环境下稳定提前开花玉米的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种敲除ZmABKHL10B‑1基因在创制不同光周期环境下稳定提前开花玉米中的应用。所述应用具体选自如下任一种：A1)降低或抑制玉米ZmABKHL10B‑1基因表达的物质在调控植物开花期中的应用；(A2)降低或抑制玉米ZmABKHL10B‑1基因表达的物质在制备调控植物开花期的产品中的应用；(A3)降低或抑制玉米ZmABKHL10B‑1基因表达的物质在植物育种中的应用；其中，所述ZmABKHL10B‑1基因在玉米基因组Zm‑B73‑REFERENCE‑GRAMENE‑4.0版本中基因号为：Zm00001d009927。本发明的应用可显著促进玉米品种或自交系的开花期，从而缩短生育期，提高对不同地区环境的适应性，降低遭受极端恶劣气候导致减产或绝产的可能性，同时也可保证后茬作物的正常轮作。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种敲除ZmABKHL10B-1基因在创制不同光周期环境下稳定提前开花玉米的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是我国乃至世界范围内种植范围最广的谷类作物，是重要的粮食、饲料、工业原料。开花期是决定玉米适应性的重要农艺性状，是玉米在不同生态环境种植均能保障产量供应的关键因素之一。中国共有6大玉米种植区，其中，北方春播玉米区和黄淮海平原夏播玉米区是两大玉米主产区。对于北方春播玉米区，适当早花能保证玉米有足够的时间进行灌浆并避开后期的霜冻，利于高产；对于黄淮海夏播玉米区，受“一年两熟”耕作制度的影响，适当早花是保证玉米产量和保障后茬作物正常轮作的关键。此外，研究表明，适当早花还有利于降低玉米空杆率和加速籽粒脱水，并且针对玉米开花期基因的改良还有助于玉米根系性状的改善。对美国和中国不同年代玉米自交系的研究还表明，开花期是玉米育种中重要的选择性状，并且早花是近现代中美玉米育种历程中共有的选择趋势。因此，发掘和应用控制玉米花期的关键基因，对于培育、筛选和改良适合不同生态区种植的玉米新品种至关重要。
鉴于开花期对于玉米生产的重要性，科研人员已对玉米花期的遗传和分子调控机制开展了部分研究。玉米开花期由多条信号途径参与调控。目前仅有少数的玉米开花期基因和数量性状位点(QTL)被克隆和功能验证。如ZCN8、DLF1、ZmMADS1、ZMM4、ID1、VGT1、ZmRAP2.7、ZmPHYB1、ZmPHYB2、ZmGI1a、ZmGI1b、ZmCOL3、ZmCCT9和ZmCCT10等。总体来讲，相较于模式植物拟南芥和单子叶植物水稻，玉米花期调控基因的克隆，及遗传基础和分子机理的研究还十分滞后。
目前，已报道玉米开花期相关基因有的影响开花期的同时会造成雌穗(玉米的收获器官)或雄穗的变异从而影响玉米产量(如ID1等)，而有的调控开花期的功能则受到光周期信号的调控(如ZmCCT9、ZmCCT10等)。目前，玉米开花期研究中鲜有功能不受光周期信号影响的玉米开花期调控基因被报道。
模式植物拟南芥研究表明，mRNA甲基化修饰m6A在植物生长发育过程有重要作用。ABKHL家族基因编码一类m6A去甲基化酶基因，其中ALKBH10B在拟南芥开花期调控中起重要作用。与拟南芥不同，玉米为单子叶植物，玉米中直系同源基因可能有不同的功能和调控机制，但目前为止，还没有玉米中ALKBH家族基因调控玉米发育的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除ZmABKHL10B-1基因在创制不同光周期环境下稳定提前开花玉米的应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种应用，所述应用为如下(A1)-(A3)：
(A1)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在调控植物开花期中的应用；
(A2)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在制备调控植物开花期的产品中的应用；
(A3)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在植物育种中的应用；
其中，所述ZmABKHL10B-1基因在玉米基因组Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0版本中基因号为：Zm00001d009927。
在具体的实施方案中，所述植物为玉米。
在具体的实施方案中，所述调控植物开花期为促进植物提前开花。
在更具体的实施方案中，所述促进植物提前开花为在不同光周期环境下促进植物提前开花。
所述植物育种的目的为玉米开花期调控，早熟玉米品种或品系选育。
在具体的实施方案中，所述植物育种的目的为创制不同光周期环境下稳定提前开花的玉米。
在具体的实施方案中，所述降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质为生物材料，所述生物材料为下述(B1)-(B7)中的任一种：
(B1)含有ZmABKHL10B-1基因的重组载体；
(B2)含有(B1)所述重组载体的重组微生物、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的重组微生物；
(B3)含有(B1)所述重组载体的转基因植物细胞系、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物细胞系；
(B4)含有(B1)所述重组载体的转基因植物组织、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物组织；
(B5)含有(B1)所述重组载体的转基因植物器官、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物器官。
(B6)抑制或降低或下调所述ZmABKHL10B-1基因的表达的RNA分子；
(B7)表达(B6)所述RNA分子的编码基因。
在具体的实施方案中，所述(B6)中的RNA分子为靶向ZmABKHL10B-1基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA组合物，所述sgRNA组合物包括sgRNA1和sgRNA2。
所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在具体的实施方案中，含有前文所述sgRNA的重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织、或转基因植物器官也在本申请的保护范围内。
第二方面，本发明保护一种调控植物开花期的方法，所述方法包括抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达来调控植物开花期。
如前文所述，调控植物开花期主要为促进植物提前开花，更具体为在不同光周期环境下促进植物提前开花。
第三方面，本发明保护一种制备不同光周期环境下提前开花玉米的方法，所述方法包括抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达，所述受体植物为受体玉米，从而得到不同光周期环境下开花时间早于受体玉米的目的玉米。
在具体的实施方案中，所述方法为通过基因编辑敲除ZmABKHL10B-1基因来实现，所述基因编辑通过簇规律间隔短回文重复基因编辑系统或基于巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)基因编辑方法来实现。
在更具体的实施方案中，所述方法通过向受体植物中导入前文所述的sgRNA的编码基因来抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达。
在更更具体的实施方案中，所述方法包括如下具体步骤：
(1)构建含前文所述sgRNA组合物的重组载体；
(2)将所述重组载体转入植物如玉米中，从而得到转基因玉米。
所述重组载体为pBUE411-ZmABKHL10B-1，通过向骨架载体pBUE411中插入前文所述的sgRNA来实现。
所述重组载体可用现有的植物基因编辑载体构建。使用所述基因编辑载体时，在所述重组载体中的功能元件组份(例如：CRISPR/CAS9基因编辑系统中CAS9蛋白的编码基因)转录起始位点前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子(例如：35S启动子、ubiquitin启动子、rd39A启动子等)以增强基因编辑的效率。
在具体的实施方案中转入植物方法包括但不限于：聚乙二醇法、农杆菌介导或基因枪轰击法。
本发明的有益效果：
本发明克隆了一个可以在不同光周期环境下抑制玉米开花的基因ZmABKHL10B-1基因，并提供了利用基因编辑工具对ZmABKHL10B-1基因敲除创制不同光周期环境下提前开花玉米的应用。该应用可显著促进玉米品种或自交系的开花期，从而缩短生育期，提高对不同地区环境的适应性，降低遭受极端恶劣气候导致减产或绝产的可能性，同时也可保证后茬作物的正常轮作。
附图说明
图1为本发明提供的ZmABKHL10B-1基因敲除载体质粒pBUE411-ZmABKHL10B-1的图谱；
图2为本发明提供的pBUE411-ZmABKHL10B-1转基因阳性材料PCR检测结果电泳图；
图3为本发明提供pBUE411-ZmABKHL10B-1转基因材料中靶基因编辑情况；
图4为本发明提供的ZmABKHL10B-1敲除玉米材料在不同光周期环境下开花期表型。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本发明提供了敲除ZmABKHL10B-1基因在不同光周期环境下促进玉米提前开花的应用。
本发明提供了敲除ZmABKHL10B-1基因在制备不同光周期环境下促进玉米提前开花的产品中的应用。
本发明还提供了敲除ZmABKHL10B-1基因在制备不同光周期环境下稳定提前开花玉米的的应用。
所述ZmABKHL10B-1基因玉米基因组Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0版本(https://maizegdb.org/)中基因号为：Zm00001d009927，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种用于敲除玉米ZmABKHL10B-1基因的sgRNA组合物，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(GTTCGGGCTCCGCCTCAGAGGGG)所示；所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(TGAAGATGTTTTTACAACATCGG)所示。
本发明提供了一种用于敲除玉米ZmABKHL10B-1基因的重组载体，所述重组载体包括pBUE411-ZmABKHL10B-1；所述pBUE411-ZmABKHL10B-1为骨架载体pBUE411插入所述sgRNA组合物的sgRNA1和sgRNA2。
在本发明中，构建含所述sgRNA组合物的重组载体的方法包括构建pBUE411-ZmABKHL10B-1重组载体的方法。
所述构建pBUE411-ZmABKHL10B-1载体的方法，优选包括以下步骤：
A.利用限制性内切酶Bsa I对pBUE411载体进行线性化；
B.利用(10B-1-T1-MT1T2-F、10B-1-T1-MT1T2-F0、10B-1-T2-MT1T2-R0、10B-1-T2-MT1T2-R)4条引物以pCBC-MT1T2为模板进行靶向ABKHL10B-1基因的sgRNA表达框的片段。
C将所述含靶向ZmABKHL10B-1基因的sgRNA表达框的片段与经Bsa I限制性内切酶片段化的pBUE411载体在同时含有Bsa I及T4 DNA连接酶的反应体系中进行边酶切边连接反应实现片段与载体的连接。
在本发明中，重组载体构建中设计的引物信息如表1所示。
表1各扩增引物的信息
在本发明中，10B-1-T1-MT1T2-F、10B-1-T1-MT1T2-F0、10B-1-T2-MT1T2-R0、10B-1-T2-MT1T2-R引物对pCBC-MT1T2进行扩增，PCR反应中10B-1-T1-MT1T2-F/R引物浓度为正常浓度，10B-1-T1-MT1T2-F0/R0引物浓度为正常浓度稀释20倍，从而将引导序列整合到载体片段中，进行PCR产物电泳检测及产物回收。将回收的PCR产物与pBUE411载体质粒进行酶切连接，在PCR仪中进行反应，反应步骤为：①37℃，30min；②22℃，10min；③①-②步骤重复10个循环；④80℃，10min。
体系如下：
边酶切边连接反应完成后，依次进行大肠杆菌感受态细胞转化、大肠杆菌菌落PCR筛选阳性菌落、菌样测序、质粒提取。
本发明提供了一种敲除ZmABKHL10B-1基因的试剂，所述试剂含有前文所述sgRNA或所述重组载体。
本发明还提供了一种前文所述的试剂在创制不同光周期环境下稳定提前开花玉米的应用。
采用所述sgRNA组合物或所述重组载体创建不同光周期环境下稳定提前开花玉米的方法包括以下步骤：
1)构建含所述sgRNA组合物的重组载体；
2)将所述重组载体用农杆菌介导的转基因技术转入玉米中，得到转基因玉米；
3)将所述转基因玉米进行转基因阳性鉴定及靶基因序列检测，筛选得到ZmABKHL10B-1基因敲除突变体，进而得到不同光周期环境下稳定提前开花玉米突变体。
本发明对所述重组载体用农杆菌介导的转基因技术转入玉米中的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。
在本发明中，所述阳性检测的方法优选分别采用CAS9 411F/CAS9 411R引物对转基因植物进行PCR扩增，得到目标扩增产物的玉米植株为有T-DNA插入片段的转基因阳性植株，而无目标产物的玉米植株为为T-DNA插入片段的转基因阴性植株。所述CAS9 411F与CAS9411R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示。所述PCR扩增的反应步骤优选如下：①95℃预变性5min；②95℃30sec；③58℃30sec；④72℃1min；⑤②-④步骤重复30个循环；⑥72℃5min。
筛选得到转基因阳性植株后，本发明优选对所述转基因植株采用sanger测序方法来鉴定编辑情况。所述sanger测序的方法优选在靶标位点上下游300bp范围内设计基因特异性引物，9927-1SEQ F/9927-1SEQ R引物组合扩增sgRNA1靶向位点，9927-2SEQ F/9927-2SEQ R引物组合扩增sgRNA2靶向位点。
靶点序列测序过程中涉及引物序列如表2所示。
表2靶点序列测序过程中涉及到的引物序列
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1ZmABKHL10B-1基因CRISPR载体的构建
(1)CRISPR敲除载体pBUE411-ZmABKHL10B-1的构建
本发明创建一个包含两个靶向ZmABKHL10B-1基因不同位点的sgRNA，根据2条sgRNA序列设计引物进行2次PCR扩增，引物序列见表3。
表3各扩增引物的信息
利用引物10B-1-T1-MT1T2-F、10B-1-T1-MT1T2-F0、10B-1-T2-MT1T2-R0、10B-1-T2-MT1T2-R引物对pCBC-MT1T2进行扩增，PCR反应中10B-1-T1-MT1T2-F/R引物浓度为正常浓度，10B-1-T1-MT1T2-F0/R0引物浓度为正常浓度稀释20倍，从而将引导序列整合到载体片段中，进行PCR产物电泳检测及产物回收。将回收的PCR产物与pBUE411载体质粒进行酶切连接，在PCR仪中进行反应，反应步骤为：①37℃，30min；②22℃，10min；③①-②步骤重复10个循环；④80℃，10min。
(2)载体转化大肠杆菌
将上述载体转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，培养16小时后挑取单克隆用引物OsU3-FD3和TaU3-RD对菌液进行PCR阳性检测，PCR反应步骤为：①95℃预变性5min；②95℃30sec；③58℃30sec；④72℃1min；⑤②-④步骤重复30个循环；⑥72℃5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，测序确认后即获得用于转化质粒pBUE411-ZmABKHL10B-1，并进行。所述OsU3-FD3核苷酸序列如SEQ ID NO:14(GACAGGCGTCTTCTACTGGTG CTAC)所示；所述TaU3-RD核苷酸序列如SEQ ID NO:15(CTCACAAATTATCAGCACGCT AGTC)所示。
将EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上解冻，完全溶解后加入5μL上述重组载体，轻弹混匀。冰浴5min后液氮冷冻5min，随后快速转移至37℃水浴锅中，放置5min。冰浴5min，加入1mL LB液体培养基，28℃200rpm培养3h。取200μL菌液均匀涂布于含卡那霉素(50mg/L)和利福平抗生素(50mg/L)的LB平板上，28℃倒置培养2.5天。菌落PCR筛选阳性菌种。
实验例2pBUE411-ZmABKHL10B-1载体转化玉米自交系
(1)农杆菌介导的玉米遗传转化
以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2ml塑料离心管中；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中加入1.0ml农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后在新的筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
实施例3pBUE411-ZmABKHL10B-1转基因植株的分子鉴定
(1)转基因植株阳性检测
利用CTAB法提取转基因植株叶片的基因组DNA，以CAS9 411F/CAS9 411R进行PCR分别检测是否有相应T-DNA插入。PCR反应步骤：①95℃预变性5min；②95℃30sec；③58℃30sec；④72℃1min；⑤②-④步骤重复30个循环；⑥72℃5min。
图2为本发明提供的pBUE411-ZmABKHL10B-1转基因材料PCR阳性检测结果电泳图；泳道M表示Marker，WT表示野生型受体材料，泳道1-8为转基因材料，如图2所示，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型没有条带。由图2可知，本发明得到了多株含T-DNA序列的转基因玉米材料。
(2)转基因植株的编辑情况检测
CRISPR-Cas9介导的转基因编辑植株采用sanger测序的方法来鉴定编辑情况。在靶标位点上下游各300bp范围内设计基因特异的引物，9927-1SEQ F/9927-1SEQ R引物组合扩增sgRNA1靶向位点，9927-2SEQ F/9927-2SEQ R引物组合扩增sgRNA2靶向位点。PCR反应步骤：①95℃预变性5min；②95℃30sec；③58℃30sec；④72℃1min；⑤②-④步骤重复30个循环；⑥72℃5min。对PCR产物进行测序。
通过测序分析，我们筛选到5个ZmABKHL10B-1基因被编辑转基因家系。通过自交繁种我们对被编辑的转基因家系进一步纯化和筛选，通过测序鉴定到2个ZmABKHL10B-1基因纯合的敲除突变体，测序结果如图3所示。
实施例4ZmABKHL10B-1基因敲除转基因植株开花期表型观察
将实施例3中筛选到的ZmABKHL10B-1基因敲除转基因植株(Zmabkhl10b-1)与野生型材料(WT)种植于试验田。观察发现，在郑州(长日照条件)与三亚(短日照条件)Zmabkhl10b-1突变体比野生型开花期均提前约8天左右(图4)。
Claims (10)
1.应用，其特征在于，所述应用为如下(A1)-(A3)：
(A1)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在调控植物开花期中的应用；
(A2)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在制备调控植物开花期的产品中的应用；
(A3)降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质在植物育种中的应用；
其中，所述ZmABKHL10B-1基因在玉米基因组Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0版本中基因号为：Zm00001d009927。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降低或抑制玉米ZmABKHL10B-1基因表达的物质为生物材料，所述生物材料为下述(B1)-(B7)中的任一种：
(B1)含有ZmABKHL10B-1基因的重组载体；
(B2)含有(B1)所述重组载体的重组微生物、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的重组微生物；
(B3)含有(B1)所述重组载体的转基因植物细胞系、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物细胞系；
(B4)含有(B1)所述重组载体的转基因植物组织、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物组织；
(B5)含有(B1)所述重组载体的转基因植物器官、或含有所述ZmABKHL10B-1基因的转基因植物器官。
(B6)抑制或降低或下调所述ZmABKHL10B-1基因的表达的RNA分子；
(B7)表达(B6)所述RNA分子的编码基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述(B6)中的RNA分子为靶向ZmABKHL10B-1基因的sgRNA，所述sgRNA如SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3所示。
4.一种调控植物开花期的方法，其特征在于，所述方法包括抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达来调控植物开花期。
5.一种制备不同光周期环境下提前开花玉米的方法，其特征在于，所述方法包括抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达，所述受体植物为受体玉米，从而得到不同光周期环境下开花时间早于受体玉米的目的玉米。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法为通过基因编辑敲除ZmABKHL10B-1基因来实现，所述基因编辑通过簇规律间隔短回文重复基因编辑系统或基于巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶基因编辑方法来实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过向受体植物中导入权利要求3所述的sgRNA的编码基因来抑制或降低受体植物中ZmABKHL10B-1基因的表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
(1)构建含权利要求3所述sgRNA的重组载体；
(2)将所述重组载体用转入植物中，得到转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组载体为pBUE411-ZmABKHL10B-1，通过向骨架载体pBUE411中插入权利要求3所述的sgRNA来实现。
10.权利要求2所述的生物材料、权利要求3所述的sgRNA、含有权利要求3所述sgRNA的重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织、或转基因植物器官。
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