CN104498505A - AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及 AtNF-YB-1 基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于：具有如SEQ.ID. NO.1所示的核苷酸序列，或至少80%同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过修饰改造的具有相同功能的蛋白，将 AtNF-YB-1 基因转入植物中获得了抽穗开花明显提前的品种，且不受长日照或短日照影响，均表现稳定。为培育适应性广、生育期短的水稻提供了新的基因资源。

Description

AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用。

背景技术

植物生长过程中抽穗（开花）期是植物生态适应性的重要农艺性状，决定植物品种适应地区和季节的关键性状。植物抽穗开花的早晚直接决定了生育期的长短，一般认为在最佳生长条件下，晚开花使得营养生长期延长，能够积累更多的干物质，产量更高；而在生长季节较短或不可预知的环境中早开花则更有利。在水稻品种选育中，生育期的长短与品种栽培适应范围也密切相关。因此，研究调控植物抽穗开花的基因及其作用机制对植物品种选育具有重要的指导意义。

其中比如水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的禾谷类作物之一，全世界约40%的人口，其主要食物来源于水稻。水稻同样也是我国最重要的粮食作物之一，水稻产量的高低，直接影响到我国的粮食安全以至国家安全。

目前，已有20多个控制水稻抽穗期的基因被克隆，比较经典的就是Hd1（Masahiro et al. The Plant Cell, 2000, 12: 2473-2483.）在长日照条件下，抑制水稻抽穗，短日照条件下，促进抽穗；Hd3a（Shoko et al. Plant Cell Physiol, 2002, 43(10): 1096-1105）能促进水稻抽穗；DTH8(Ghd8/LHD1)(Wei et al. Plant Physiology, 2010, 153(4):1747-1758; Yan et al. Molecular Plant, 2011,4(2): 319-330；Dai et al. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 790-799; Gao et al. PNAS, 2013, 110 (35): 14492-14497.)在长日照条件下，延迟抽穗，短日照条件下，促进抽穗开花。对于抽穗期基因来说，由于各地光周期的差异，不同地区就需要选择不同类型的光敏感材料以适应当地的光照条件。在这种情况下，筛选不受光周期影响的控制抽穗期的基因就显得尤为重要。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种控制植物抽穗期基因AtNF-YB-1，具有如SEQ. ID. NO.1所示的核苷酸序列，或至少80%同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过修饰改造的具有相同功能的蛋白，将AtNF-YB-1基因转入植物中获得了抽穗开花明显提前的品种，且不受长日照或短日照影响，均表现稳定。为培育适应性广、生育期短的水稻提供了新的基因资源。

本发明中，AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，通过AtNF-YB-1基因，SEQ. ID. No.1或与其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表达，使其蛋白基因的序列具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少80%同源性的序列，来达到调控植株的抽穗期从而提高农作物地区适应性、杂交亲本的花期调节和提高作物产量。

所述AtNF-YB-1基因序列是通过植物表达载体导入植物中，所述植物表达载体为在载体pCXUN的多点克隆位点间插入所述AtNF-YB-1基因得到的植物过表达载体。

所述植物为水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。

本发明中AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于： 包括以下步骤：

（1）根据AtNF-YB-1基因序列设计PCR扩增引物对，其引物序列为：002-F：5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R：5'-GCAACTTCTTTTACCA

GCTCGGC-3'；

（2）以拟南芥cDNA为模板，利用上述引物，通过PCR扩增获得AtNF-YB-1基因全序列；

（3）将PCR产物克隆至pCXUN载体上，经测序正确，得到植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1；

（4）采用冻融法将植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1导入农杆菌中成工程菌；

（5）采用根癌农杆菌介导法、直接DNA转化法将载体pCXUN- AtNF-YB-1导入植物中，筛选获得转基因植物。

步骤（5）中采用根癌农杆菌介导法为利用将带有AtNF-YB-1基因的植物表达载体转入植物愈伤组织中，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、壮苗和移栽，筛选转基因植物植株。

所述AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中应用的工程菌，其特征在于：所述工程菌含有植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1的工程菌。

所述工程菌含有植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1的农杆菌LBA4404，具体为LBA4404- pCXUN-AtNF-YB-1。

本发明的优点在于：

（1）利用本发明AtNF-YB-1基因转化植物，可培育出抽穗开花早的植物品种，为调控植物生育期提供了新的基因资源；

（2）利用AtNF-YB-1基因进行转基因育种可缩短育种周期；

（3）本发明转AtNF-YB-1基因植物，比如水稻，不管是在长日照地区还是短日照地区，均能促进抽穗开花10-15天，因而利用该基因所培育的植物适应性广、生育期短，能适应不同生态型和季节性。

本发明将AtNF-YB-1基因转入植物，比如水稻中获得了抽穗开花明显提前的品种，且不受长日照或短日照影响，均表现稳定。为培育适应性广、生育期短的水稻提供了新的基因资源。

本发明利用AtNF-YB-1基因在植物，比如水稻中过表达，得到了生育期明显缩短（10-15天）的植株，且不受长日照或短日照的光周期影响。为培育短生育期、适应不同生态型和季节型的水稻品种提供了一条新的途径。

附图说明

图1 为AtNF-YB-1基因的PCR扩增产物电泳图谱，其中M为DNA marker。

图2 为重组质粒pCXUN-AtNF-YB-1检测目的基因AtNF-YB-1的PCR扩增产物电泳图谱，其中M为DNA marker；P为回收产物为模板的阳性对照；N为不加模板的空白对照；1,2分别为不同的单菌落。

图3 为重组质粒pCXUN-AtNF-YB-1经BamH 的酶切验证电泳图，其中M为DNA marker。

图4 为pCXUN-AtNF-YB-1质粒表达载体构建示意图。

图5 为水稻遗传转化流程图，其中A为诱导的愈伤组织；B为抗性愈伤组织筛选；C为抗性愈伤分化初期；D为抗性愈伤分化出苗；E为生根培养。

图6 为用Hpt 引物和AtNF-YB-1对T0代分化植株进行PCR检测的电泳图谱，其中A为Hpt PCR检测结果；B为AtNF-YB-1 PCR检测结果；M为DNA marker；P为质粒pCXUN-AtNF-YB-1为模板；N为非转基因水稻Kasalath总DNA为模板；1、2、3、4为4个独立的潮霉素抗性再生植株。

图7 为转基因植株AtNF-YB-1 mRNA表达水平的检测，其中WT为非转基因水稻Kasalath总RNA杂交结果；P1、P2、P3、P4为4个独立的转基因株系。

图8 为6-BA和Hyg溶液处理叶片结果，其中A为二叶龄叶片处理结果；B为四叶龄叶片处理结果。

图9 为T-DNA在水稻基因组的整合情况示意图，其中002A、002B、002C分别表示不同转基因株系，A、B、C、D、E分别表示水稻基因组上的不同编码基因。

图10为转基因水稻盆栽试验，其中WT为非转基因水稻Kasalath品种；002C为一个转基因株系。

图11为转基因水稻在田间表型，其中A为在成都种植；B为在海南种植；WT为非转基因水稻Kasalath品种；002A为一个转基因株系。

图12为转基因植株与非转基因植株抽穗时间比较，其中WT为非转基因植株；002A、002B、002C：为不同的转化株系；A表示2013年夏季在四川省成都市取样调查结果；B表示2012年冬季在海南省陵水县取样调查结果。

  

具体实施方式

实施例1

AtNF-YB-1基因的克隆

按照如下步骤进行：

目的基因片段的扩增 根据Genbank上AtNF-YB-1基因序列，利用Primer5.0软件分别设计目标基因的上游和下游引物，以拟南芥cDNA为模板，进行PCR扩增，所述引物序列为：002-F：5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R：5'-GCAACTTCTTTTACCA

GCTCGGC-3'。PCR反应体系为：拟南芥cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture （2.5 mM) 4 μL，002引物（10μM, 北京华大基因）1 μL，ExTaq（5 U/μL） 0.5 μL，补ddH₂O至50 μL，所用PCR试剂购自TakaRa公司。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃总延伸 8 min。电泳检测，结果（见图1）所得PCR扩增产物大小约为500 bp，切下目的条带，用胶回收试剂盒（Axygen公司）进行胶回收，按照试剂盒说明书进行。

实施例2

植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1的构建

按照如下步骤进行：

(1) 重组质粒pCXUN-AtNF-YB-1的连接

用XcmI（美国NEB公司）双酶切pCXUN质粒4h将质粒上ccdB基因切除，并获得含T的粘性末端，酶切反应体系：10×NEBuffer2 5μL，XcmI 1 μL, pCXUN质粒15 μL，加ddH₂O至50 μL，电泳检测酶切后为两条带，一条大带11000 bp左右，另一条小带约700 bp，切胶回收大条带，用胶回收试剂盒（Axygen公司）进行。将回收后的质粒大条带（含T的粘性末端）与实施例1所得基因片段回收产物（含A尾）进行连接：质粒DNA和基因片段DNA的摩尔数比为0.03 pmol：0.1~0.3 pmol，按照测定浓度加入相应体积的回收产物混合至5 μL，再加入5 μL等体积的Solution (TakaRa公司DNA  Ligation试剂盒)充分混匀，16 ℃连接过夜。

(2) 连接产物转化大肠杆菌

操作步骤如下：

① 取上述方法新鲜制备的感受态细胞，或从-70 ℃冰箱中取出一管感受态细胞（50 μL），冰上自然融化；

②将5-10 μL DNA的连接物加入一管感受态细胞中，轻轻混匀后放置冰上30 min；

③ 42 ℃水浴中热激恰恰45 sec，迅速取出立即放于冰上2 min；

④ 室温恢复3~5 min左右，加入800 ??L 37 ℃预热的LB液体培养基，37 ℃、180 rpm培养1-2 h；

⑤ 培养菌液于室温4000 rpm离心10 min，去掉800 ??L 上清液，将剩余的50 ??L菌液混匀，全部加入含相应抗生素的LB固体平板上；

⑥ 用无菌的涂布棒将菌液均匀涂布，晾于超净台上30 min左右至菌液完全被培养基吸收；

⑦ 37 ℃倒置暗培养12-14 h。

(3) 重组质粒的鉴定

于转化次日挑取转化子于LB+Kan进行液体培养，同时进行菌落PCR检测，引物为002，PCR反应体系同实施例1中，将反应条件中预变性时间增至8 min，选取菌落PCR检测为阳性（如图2）的克隆扩大培养，提取质粒（步骤按Axygen质粒抽提试剂盒操作），用BamHⅠ进行酶切鉴定，酶切产物与预期片段大小一致(如图3)，初步表明AtNF-YB-1基因片段已经整合进pCXUN载体，再将质粒送去测序，经测序结果验证插入的片段正确。将构建好的植物表达载体命名为pCXUN- AtNF-YB-1（其构建示意图见图4）。

(4) 重组质粒pCXUN-AtNF-YB-1转化农杆菌

首先是制备农杆菌感受态，操作步骤如下：取本实验室-70 ℃保存的农杆菌LBA4404用YEP+40 mg·L^-1 Rif+50 mg· L^-1 Str固体培养基划单菌落活化第一次，再挑取单菌落用YEP+40 mg·L^-1 Rif+50 mg· L^-1 Str液体培养基活化至第二次OD600=0.3~0.5可用于农杆菌感受态细胞的制备：将菌液冰浴30 min；取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，4 ℃ 5000 rpm 离心5 min，去上清；用灭菌的0.1 M CaCl₂（预冷）400 μL悬浮菌体（用移液枪轻轻打匀）；冰上放置30 min，4 ℃5000 rpm 离心5 min，去上清；用50~100 μL预冷的0.1 M CaCl₂悬浮菌体，4 ℃保存10 h备用或者加20-30%的灭菌甘油混匀，液氮速冻后于-70 ℃保存。

将构建好的重组质粒pCXUN-AtNF-YB-1采用冻融法导入制备好的农杆菌LBA4404感受态细胞中：取重组质粒10 μL（3-5 μg），加入一管100 μL的LBA4404感受态细胞中，轻轻混匀；立即冰上放置30 min，迅速投入液氮中2 min；迅速放入37 ℃水浴至完全融化；加入800 μL无抗生素的YEP液体培养基，轻轻混匀；振荡培养活化（28 ℃，200 rpm，3-5 h）；室温离心（4000 rpm，5 min），去上清，余下100 μL菌液重悬菌体混匀；将100 μL重悬活化菌液均匀涂布到YEP+40 mg·L^-1 Rif+50 mg· L^-1 Str+100 mg· L^-1 Kan固体筛选培养基平板上；28 ℃培养箱中倒置培养2~3天至长出菌落大小适中，挑选抗性单菌落在含YEP+40 mg·L^-1 Rif+50 mg· L^-1 Str+100 mg· L^-1 Kan液体培养基中培养。当培养菌液达到一定浓度后做目的基因AtNF-YB-1（引物为002）和抗性标记基因潮霉素Hygr的PCR检测（检测目的基因的PCR体系和条件同前，潮霉素Hygr的PCR检测方法与目的基因类似，引物为HptII-F：5'-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3'；HptII-R：5'-CGATGTAGGAGGGCG

TGGATATG-3'）。将构建好的工程菌命名为LBA4404- pCXUN-AtNF-YB-1。

实施例3 AtNF-YB-1遗传转化水稻

采用根癌农杆菌介导的方法，将AtNF-YB-1导入水稻愈伤组织，经潮霉素B筛选获得转基因植株，所用基本培养基N6和MS salts购自PhytoTechnology Laboratories。

    转化步骤如下（转化流程见图5）：

① 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养：去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡30秒，然后用0.1%升汞浸泡8-10 min，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗7-8次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基CIM上，光照周期为：33℃光照14 h，30 ℃暗培养10 h。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基CIM上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。浸染前三天，将愈伤组织切成2-4毫米大小转至新的诱导培养基上进行预培养。

② 农杆菌的培养和准备：将农杆菌LBA4404- pCXUN-AtNF-YB-1在LB+50 mg/L Str+100 mg/L Kan平板上划线，19℃暗培养三天。用接种环挑取少量菌悬浮于15毫升浸染培养基IM+100 μM AS中，调整菌体浓度OD550=0.06-0.08，即为转化水稻用的农杆菌悬浮液。

③ 农杆菌浸染与共培养：将预培养的水稻愈伤组织接入15毫升浸染培养基+100μM乙酰丁香酮中预洗一遍倒掉液体，再将准备好的15毫升农杆菌悬浮液倒入，轻轻摇动2分钟。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转入共培养基上，19℃暗培养三天。

④ 洗菌与抗性愈伤组织的筛选：将共培养三天后的愈伤组织，先用无菌水洗7-8次，再用浸染培养基+250mg/L羧苄青霉素+10mg/L万古霉素洗一次，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余的液体，转入加筛选培养基SM上（33℃光照14 h，30 ℃暗培养10 h），每14天继代一次，筛选2次。

⑤ 抗性愈伤组织的分化：从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有分化培养基RM上，约14-20天左右有绿点出现，30天左右进一步分化成小苗。

⑥ 转基因苗生根、壮苗、移栽：当抗性愈伤组织分化的芽长至约2-4厘米时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右再转至壮苗培养基上培养2-3周。选择高约10厘米、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。

实施例4  T0代转基因植株的分子生物学检测

(1) 转化植株的PCR检测

经实施例3一共获得42株转化植株，用CTAB法提取DNA（操作步骤参照《分子克隆实验指南》（第二版）（J. 萨姆布鲁克等人，1992）），以潮霉素抗性基因Hpt 和AtNF-YB-1的特异引物对转化植株进行常规PCR检测。分别以非转基因水稻Kasalath总DNA和质粒pCXUN-AtNF-YB-1为模板，在相同条件下进行PCR扩增作为阴性和阳性对照。经鉴定筛选获得了38株阳性植株（部分植株PCR检测结果见图6）。

(2) 阳性植株的Northern检测

    对PCR鉴定为阳性的部分植株，取叶片提取RNA（步骤按天根生化科技有限公司TRNzol-A⁺总RNA提取试剂说明书进行），进行Northern杂交（步骤按Roche DIG-Northern Starter试剂盒说明书进行），检测目的基因AtNF-YB-1 mRNA表达水平，以非转基因水稻Kasalath为阴性对照（部分结果见图7）。

实施例5 转基因植株后代遗传分析及田间性状调查

(1) 转基因植株后代遗传分析

对转基因植株后代进行分离比鉴定，采用6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和潮霉素B（Hyg）溶液浸泡叶片的方法，每个株系随机选取20株植株，剪取1 cm左右的叶子浸泡在1.0 mg/L 6-BA +50 mg/L Hyg溶液中，25 ℃，16h光照/8h黑暗放置4天后观察叶片状况，记录叶片绿色和黄色的比例，转基因阳性植株的叶片仍为绿色，而非转基因植株叶片部分或全部变黄或变褐。筛选符合3：1孟德尔遗传规律的株系（单拷贝植株）。并随机选取Hyg浸泡后为绿色和黄色的植株提取DNA，进行PCR验证结果。对T2代植株采用同法鉴定，筛选全部为阳性的株系，即为单拷贝的纯合株系，用于后续实验。最终筛选获得了11个单拷贝转基因株系，部分Hyg溶液处理叶片结果见图8。

(2) T-DNA插入转基因植株基因组位置的确定

对得到的11个单拷贝纯合转基因株系，通过T1代和T2代田间小量种植，我们发现这些株系相对非转基因水稻Kasalath均有不同程度提前抽穗开花的特性。选取三个表型最明显的株系，命名为002A、002B、002C，对其进行T-DNA在基因组上的整合位置的分析。分别提取基因组DNA，采用EcoRI和HindIII双酶切DNA，再在酶切片段的两端连入接头，通过用接头引物和T-DNA上特异引物PCR，将PCR产物测序，从而获得T-DNA在基因组上侧翼序列信息（具体步骤参照O’Malley RC, Alonso JM, Kim CJ, et al. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nature protocols, 2007, 2(11): 2910-2917.）。结果显示，这三个株系T-DNA整合在水稻基因组的不同位置，插入位置示意图如9。结果证明，这三个株系为不同的独立转化事件，并且其共有表型（抽穗提前）不是由T-DNA插入突变所致，而是由转入的基因引起的。

(3) 田间性状调查

将002A、002B、002C三个株系的T3代种子和非转基因水稻Kasalath分别种植在四川省成都市（夏季，自然长日照）和海南省陵水县英州镇（冬季，自然短日照），种10×10株，三个重复。随机各取30株调查抽穗时间，结果表明，无论在成都还是海南，转基因株系都比对照提前抽穗10-15天左右（图10）。证明AtNF-YB-1基因能促进水稻抽穗提前、缩短生育期，而且不受光周期调控，具有很好的地区适应性。

我们还对2013年在成都种植材料进行了其他农艺性状调查，如株高、有效分蘖数、穗长、枝梗数等（如表1）。由表1可知，转AtHAP3a基因的植株平均株高比对照矮20多cm，呈极显著差异（P＜0.01），且穗长、枝梗数、穗粒数、单株谷粒重和千粒重都极显著低于非转基因植株，但是有效穗数与对照差别不明显（除002C株系）。所有这些变化可能都是由于抽穗期缩短，使得营养生长期缩短，从而积累的营养物质也减少所致。

表1.转基因植株与非转基因植株农艺性状调查表

（注：以上表中002A、002B、002C：为不同的转化株系；WT：为非转基因植株；^＊,^＊＊分别表示转基因株系与非转基因株系WT间比较显著水平P＜0.05，P＜0.01）。

Claims (8)

1.AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用, 所述AtNF-YB-1基因的序列如SEQ. ID. NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于：所述AtNF-YB-1蛋白基因的序列如SEQ. ID. NO.2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于：所述AtNF-YB-1基因序列是通过植物表达载体导入植物中，所述植物表达载体为在载体pCXUN的多点克隆位点间插入所述AtNF-YB-1基因得到的植物表达载体。

4.根据权利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于：所述植物为水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于： 包括以下步骤：

（1）根据AtNF-YB-1基因序列设计PCR扩增引物对，其引物序列为：002-F：5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R：5'-GCAACTTCTTTTACCA

GCTCGGC-3'；

（2）以拟南芥cDNA为模板，利用上述引物，通过PCR扩增获得AtNF-YB-1基因全序列；

（3）将PCR产物克隆至pCXUN载体上，经测序正确，得到植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1；

（4）采用冻融法将植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1导入农杆菌中成工程菌；

（5）采用根癌农杆菌介导法将载体pCXUN- AtNF-YB-1导入植物中，筛选获得转基因植物。

6.根据权利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中的应用，其特征在于： 步骤（5）中采用根癌农杆菌介导法为利用将带有AtNF-YB-1基因的植物表达载体转入植物愈伤组织中，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、壮苗和移栽，筛选转基因植物植株。

7.根据权利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中应用的工程菌，其特征在于：所述工程菌含有植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1的工程菌。

8.根据权利要求7所述的AtNF-YB-1基因在促进植物抽穗提前、缩短生育期中应用的工程菌，其特征在于：所述工程菌含有植物表达载体pCXUN-AtNF-YB-1和农杆菌LBA4404，具体为LBA4404- pCXUN-AtNF-YB-1。