CN103766221A

CN103766221A - 一种单子叶植物的组织培养方法

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Publication number: CN103766221A
Application number: CN201410046615.8A
Authority: CN
Inventors: 张万军; 刘燕蓉; 马宁; 叶文兴; 张蕴薇
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-02-10
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2034-02-10
Also published as: CN103766221B

Abstract

本发明公开了一种单子叶植物的组织培养方法。该方法涉及一种包括如下步骤的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法：1）以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2℃避光诱导培养4-6周，获得愈伤组织1；2）从步骤1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃避光培养3周，获得愈伤组织2；3）从步骤2）获得的愈伤组织2中选取在继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织；即为II型愈伤组织。实验证明，本发明适用于不同生态型的枝稷，且可在较短时间内获得再生效率高的优良愈伤组织，节省时间及成本，加快柳枝稷基因改良的生物育种进程。

Description

一种单子叶植物的组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组培领域，涉及一种单子叶植物的组织培养方法。

背景技术

单子叶植物的细胞再生多通过体细胞胚发生途径。高效、快速获得高频再生的胚性愈伤组织是单子叶植物进行生物技术育种的基础。但是对于大多数单子叶植物如柳枝稷、小麦、玉米的自交系要获得高效再生而且还可以进行遗传转化的胚性细胞系需要经过长时间的愈伤组织培养。

柳枝稷（Panicum virgatum L.）属禾本科（Gramineae）黍亚科（Panicoideae）黍属，为多年生草本植物，原产于北美大陆，适应性强，对土壤环境要求低，生物量大，被作为新型的能源植物。但由于柳枝稷木质素含量高，抗逆性方面还有待提高，要获得更高的经济效益，有必要对柳枝稷进行相应性状的遗传育种改良。柳枝稷具自交不亲和性和异源多倍体的遗传特性，采用传统育种方法难度较大，为此，目前的研究多采用生物技术及基因工程的方法。基因工程育种的关键是建立高效再生体系，以提供拟改良目标性状基因的受体材料和遗传转化后受体细胞的培养系统。但已报道的柳枝稷植株再生成功方面的研究主要集中在低地型品种，且再生周期长、效率低，有必要优化柳枝稷的再生体系，以便对其进行高效率遗传改良。

在柳枝稷遗传转化体系的建立过程中，获得再生能力强，转化效率高的愈伤组织一直是研究的重点及难点。在优良愈伤组织获得方面，虽有多例报道，但因为挑选效率低或应用特殊的外植体材料等难以普遍应用，并且组培材料局限于低地型柳枝稷品种Performer、Alamo及Alamo衍生材料。2009年Burris等（Burris J N,Mann D G J,JoyceB L,et al.An improved tissue culture system for embryogenic callus production and plantregeneration in switchgrass(Panicum virgatum L.)[J].BioEnergy Research,2009,2(4):267-274）以柳枝稷Alamo2花序为外植体进行再生研究时首次描述了柳枝稷优良愈伤的形态，表明此类愈伤与玉米的Ⅱ型愈伤相似。但使用花序为外植体受季节限制，不能得到广泛应用。随后，2011年Li等（Li R Y,Qu R D.High throughputAgrobacterium-mediated switchgrass transformation[J].Biomass and Bioenergy,2011,35(3):1046-1054）以成熟种子为外植体建立的遗传转化体系中再一次提到柳枝稷黄色、干燥、易碎的愈伤易于再生，此类愈伤的再生率达90%以上。但是，就其报道来看，获得此类愈伤组织比较困难，需经过长时间的愈伤培养（6个月以上）才可以挑选到约10%的胚性愈伤，期间有大量愈伤组织需要继代培养，工作量大，挑选效率低。并且，随着培养基组分的不同、柳枝稷品种的不同，优良愈伤的形态颜色也会发生变化。因此，仅根据对优良愈伤组织的描述很难挑出该类愈伤组织。为获得柳枝稷高效再生的材料，2011年Xu等（Xu B,Huang L k,Shen Z X,et al.Selection and characterizationof a new switchgrass(Panicum virgatum L.)line with high somatic embryogenic capacityfor genetic transformation[J].Scientia Horticulturae,2011,129(4):854-861）通过对500粒Alamo成熟种子的愈伤组织进行筛选，获得再生能力较高的愈伤组织细胞系，筛选出的愈伤再生获得苗结实后，对其种子再进行一次筛选，获得新种HR8，据报道84.9%的HR8成熟种子能产生胚性愈伤。筛选培育高再生能力的柳枝稷材料或许是一种有效的方法，但对于大多数柳枝稷品种要获得高再生的新品系难度大、工作量大、筛选周期长，至少需要2-3轮（年）选择才能可能获得高效再生的材料。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种单子叶植物的组织培养方法。

本发明所提供的单子叶植物的组织培养方法，涉及一种获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，该方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤：

（1）以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2℃（如25℃）避光诱导培养4-6周（如6周），获得愈伤组织1；

（2）从步骤（1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃（如25℃）避光继代培养3周，获得愈伤组织2；

其中，所述最外层的白色愈伤组织结构疏松，含水量大呈棉花状，无硬核，生长快，不能分化成苗。所述内部黄色的胚性愈伤组织为一团表面多突起，色泽鲜亮的愈伤组织。

（3）从步骤（2）获得的愈伤组织2中选取在继代培养的3周时间内体积增大60%以上（如60%）的愈伤组织；即为II型愈伤组织。

进一步，所述II型愈伤组织在解剖镜下有明显胚性化细胞，呈微黄色，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜亮，增殖较快，容易分化成苗。

本发明所提供的单子叶植物的组织培养方法，具体可包括如下步骤：

（2）将步骤（1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃避光继代培养3周，获得愈伤组织2；

（3）从步骤（2）获得的愈伤组织2中选取II型愈伤组织接种于分化培养基上，25±2℃光照培养4周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmol m^-2s^-1，获得再生芽；

所述II型愈伤组织为在所述继代培养的3周时间内体积增大60%以上（如60%）的愈伤组织；

在实际操作中，也可以将从步骤（2）一粒种子胚获得的愈伤组织2中选取的所述II型愈伤组织进行多次继代培养，形成细胞系，后再接种于所述分化培养基上。在此过程中，来源于同一个所述成熟单粒种子的II型愈伤组织单独培养，从而可消除同一品种间的遗传差异性。

（4）将步骤（3）获得的再生芽接种生根培养基上，25±2℃光照培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmol m^-2s^-1，获得再生苗。

在上述两个方法中，所述愈伤组织诱导培养基均具体可为MB固体培养基或MS7固体培养基或NB7固体培养基；所述愈伤组织继代培养基具体可为MP固体培养基；所述分化培养基具体可为REG固体培养基；所述生根培养基具体可为1/2MS固体培养基。

更加具体的，所述MB固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖、2,4-D和6-BA后得到的培养基；所述MB固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2,4-D的终浓度为5mg/L、6-BA的终浓度为1mg/L；所述MS7固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖和2,4-D后得到的培养基；所述MS7固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2,4-D的终浓度为7mg/L；所述NB7固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：硝酸钾2830mg/L，硫酸铵463mg/L，二水合氯化钙166mg/L，七水合硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，四水合硫酸锰4.4mg/L，七水合硫酸锌1.5mg/L，硼酸1.6mg/L，碘化钾0.8mg/L，Na₂·EDTA·2H₂O37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，盐酸硫胺素10mg/L，麦芽糖30g/l，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2,4-D7mg/L，植物凝胶4.0g/l；所述MP固体培养基是在所述MB固体培养基中加入终浓度为2g/L的脯氨酸后得到的培养基；所述REG固体培养基是在MS固体培养基中加入NAA、GA、6-BA和麦芽糖后得到的培养基；所述REG固体培养基中NAA的终浓度为0.2mg/L、GA的终浓度为0.5mg/L、6-BA的终浓度为1mg/L、麦芽糖的终浓度为30g/L；所述1/2MS固体培养基为将MS固体培养基中的大量元素组分浓度减半其余组分浓度不变，再加入麦芽糖后得到的培养基；所述1/2MS固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/l。

在上述两种方法的步骤（1）中，将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上，具体可为如下（a1）或（a2）：

（a1）将所述成熟种子直接接种于所述愈伤组织诱导培养基；

（a2）将所述成熟种子的盾片纵切后接种于所述愈伤组织诱导培养基。

在上述方法的步骤（1）中，在将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上之前，还包括对所述成熟种子按照如下方法进行消毒的步骤：将所述成熟种子在体积分数5%的次氯酸钠水溶液中浸泡1.5h，用无菌去离子水洗涤（如洗涤5次）后浸泡于无菌去离子水中放于4℃的培养箱内3天，3天之后再用体积分数5%的次氯酸钠水溶液处理30min，无菌去离子水洗涤（如洗涤5次）。

本发明的还一个目的是提供用于单子叶植物的组织培养的成套培养基。

本发明所提供的用于单子叶植物的组织培养的成套培养基，具体由独立包装的如下培养基中的全部或部分组成：

（a）愈伤组织诱导培养基；

所述愈伤组织诱导培养基为以上所述MB固体培养基或所述MS7固体培养基或所述NB7固体培养基；

（b）愈伤组织继代培养基；

所述愈伤组织继代培养基为以上所述MP固体培养基；

（c）分化培养基；

所述分化培养基为以上所述REG固体培养基；

（d）生根培养基

所述生根培养基为以上所述1/2MS固体培养基。

利用本发明所提供的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法获得的II型愈伤组织在作为遗传转化材料中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述方法中，来源于同一个所述成熟种子的II型愈伤组织单独培养，从而可消除同一品种间的遗传差异性。

在本发明中，以上所有的所述单子叶植物均可为柳枝稷。

进一步，所述柳枝稷可为低地型柳枝稷、过度型柳枝稷或高地型柳枝稷。

更加具体的，在本发明中，所述低地型柳枝稷为柳枝稷品种Alamo或Performer；所述过度型柳枝稷为柳枝稷品种Carthage；所述高地形柳枝稷为柳枝稷品种Blackwell或Dacotah。

本发明通过定向挑选由成熟种子胚的优良II型愈伤组织，建立了柳枝稷低地型和高地型品种的高频植株再生体系，遗传转化实验证明在该技术流程下所挑选的胚性愈伤组织适宜于进行遗传转化。本发明使多倍体作物应用生物技术育种方向更为明确、效率更高。适宜于快速挑选获得高频再生的单子叶植物的胚性愈伤组织。本发明的实施例中将柳枝稷成熟胚产生的愈伤组织分为三种类型，并且明确指出各类型愈伤组织形态特征及在整体中的存在位置。借助显微镜通过两次挑选，轻松获得优良Ⅱ型愈伤组织。本方法适用于各生态型柳枝稷，容易操作，只需9周时间即可获得由单粒种子产生的优良细胞系，消除同一品种间的遗传差异性。另外，为进一步降低挑选难度，借助显微镜将成熟胚纵切，可增加了优良愈伤的量。

本发明适用于不同生态型的柳枝稷品种，并且可使组培工作人员在较短的时间内获得再生效率高的优良愈伤组织，节省时间及成本，加快柳枝稷基因改良的生物技术育种进程。另外，本发明所述的方法也适用于其它单子叶植物的再生，遗传转化和生物技术育种。

附图说明

图1为实施例1中柳枝稷Alamo的Ⅱ型愈伤组织的挑选、再生及转化。其中，A：愈伤组织诱导6周；B：体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C：外层愈伤组织剖开后，可见内部紧实，黄色胚性愈伤组织（箭头指向处）；D：第一次挑选后，继代培养三周时愈伤组织形态（箭头指向处为Ⅱ型愈伤组织）；E：继代培养一个月的Ⅱ型愈伤组织；F：Ⅱ型愈伤组织分化培养三周；G：农杆菌侵染Ⅱ型愈伤组织后共培养；H：GUS基因瞬时表达（愈伤组织被染成蓝色）；I：未转化愈伤组织经过潮霉素筛选后，分化培养三周，筛选率为100%；J：Ⅱ型愈伤组织经农杆菌侵染后，分化培养三周；K：生根培养；L：分化苗移栽。

图2为实施例2中柳枝稷Performer的Ⅱ型愈伤组织的挑选、再生及转化。其中，A：愈伤组织诱导6周；B：体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C：外层愈伤组织剖开后，内部紧实胚性愈伤组织（箭头指向处）；D：第一次挑选后，继代培养三周时愈伤组织形态（箭头指向处为Ⅱ型愈伤组织）；E：Ⅱ型愈伤组织；F：Ⅱ型愈伤组织分化培养三周；G：Ⅱ型愈伤组织经农杆菌侵染后共培养；H：GUS基因瞬时表达（愈伤组织被染成蓝色）；I：未转化愈伤组织经过潮霉素筛选后，分化培养三周，筛选率为100%；J：Ⅱ型愈伤组织经农杆菌侵染后，分化培养三周；K：生根培养；L：分化苗移栽。

图3为实施例3中柳枝稷Carthage的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生。其中，A：愈伤组织诱导6周；B：体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C：外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织（箭头指向处）；D：Ⅱ型愈伤组织分化三周；E：生根培养；F：分化苗移栽。

图4为实施例4中柳枝稷Blackwell的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生。其中，A：愈伤组织诱导6周；B：体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C：外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织（箭头指向处）；D：Ⅱ型愈伤组织分化三周；E：生根培养；F：分化苗移栽。

图5为实施例5中柳枝稷DacotahⅡ的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生。其中，A：愈伤组织诱导6周；B：体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C：外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织（箭头指向处）；D：Ⅱ型愈伤组织分化三周；E：生根培养；F：分化苗移栽。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

柳枝稷品种Alamo、Performer、Carthage、Blackwell和Dacotah成熟种子均来源于美国Ernst Conservation Seeds公司（详见http://www.ernstseed.com/biomass/switchgrass-variety-zone-map-key/；8884Mercer Pike,Meadville PA16335.U.S.A），生产于2010年。

pCAMBIA1301质粒为Cambia公司产品，货号为VZC0324。

下述实施例中所涉及的MS液体培养基的pH为5.8-5.9，溶剂为水，溶质及其浓度如下：

a.大量：NH₄NO₃1.65g/L，KNO₃1.9g/L，MgSO₄.7H₂O0.37g/L，KH₂PO₄0.17g/L，CaCl₂0.33g/L；

b.微量：KI0.0083mg/L，H₃BO₃8mg/L，MnSO₄.4H₂O22.3mg/L，ZnSO₄.7H₂O10mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O0.25mg/L，CuSO₄.5H₂O0.025mg/L，CoCl₂.6H₂O0.025mg/L；

c.维生素：烟酸0.5mg/L，吡哆醇0.5mg/L，硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；

d.铁盐：FeSO₄.7H₂O27.85mg/L，Na₂EDTA37.25mg/L；

e.肌醇0.1g/L。

以上各浓度为相应组分在所述MS液体培养基中的终浓度。

MS固体培养基：均为在所述MS液体培养基中加入终浓度为4g/L的植物凝胶后得到的固体培养基。

相应的，下述实施例中所涉及的以下各培养基配方如下：

注：以上各浓度为相应组分在相应培养基中的终浓度。

N6盐：硝酸钾（KNO₃）2830mg/L，硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）463mg/L，氯化钙（CaCl₂·2H₂O）166mg/L，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）185mg/L，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）400mg/L，硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）27.8mg/L，硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）4.4mg/L，硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）1.5mg/L，硼酸（H₂BO₃）1.6mg/L，碘化钾（KI）0.8mg/L，Na₂·EDTA·2H₂O37.3mg/L。以上各浓度为相应组分在相应培养基（NB7固体培养基）中的终浓度。

B5维生素：肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，盐酸硫胺素10mg/L。以上各浓度为相应组分在相应培养基（NB7固体培养基）中的终浓度。

实施例1、柳枝稷品种Alamo的II型愈伤组织的获得及组培

供试材料：柳枝稷品种Alamo成熟种子。Alamo为低地型柳枝稷，生物量高，秋天开花，中度耐盐性，适应于多数土壤类型，为柳枝稷组培常用材料。供试Alamo成熟种子为2010年生产于美国德克萨斯州（25°50'N-36°30'N）。

（1）种子消毒

选取Alamo饱满种子，用5%（体积分数）的次氯酸钠水溶液消毒1.5h，用无菌去离子水洗涤5次，浸泡于无菌去离子水中放于4℃的培养箱内3天。3天之后再用5%（体积分数）的次氯酸钠水溶液处理30min，无菌去离子水洗涤5次。

（2）愈伤组织的诱导

愈伤组织诱导时选用如下三种培养基作为愈伤组织诱导培养基：MB固体培养基，MS7固体培养基，NB7固体培养基。

消毒处理过的种子做两种处理：①直接诱导：在解剖镜下选取露白的有活力的种子直接放置于三种愈伤组织诱导培养基中，每种培养基3皿，每皿20粒种子。②切伤后诱导：在解剖镜下选取露白的种子，用解剖刀将其盾片纵向切伤，放置于三种愈伤组织诱导培养基中，每种培养基3皿，每皿20粒种子。

25℃避光培养，两周后统计愈伤诱导率（有愈伤组织形成的种子数/所有种子数），6周后进行愈伤组织的挑选及继代培养。

愈伤组织的诱导率见表1，对于处理①（直接诱导），MB固体培养基上的愈伤诱导率为27.39%，MS7固体培养基上的愈伤诱导率为33.12%，NB7固体培养基上的愈伤诱导率为33.32%，三种培养基在愈伤诱导率中无明显差异性。而处理②（切伤后诱导）相比处理①（直接诱导）而言，其愈伤诱导率降为20%左右。

表1Alamo成熟种子在三种培养基上不同处理的愈伤诱导率

注：同列相同小写字母表示差异不显著（P<0.05）。

（3）愈伤组织的挑选及继代培养

愈伤组织继代时选用如下培养基作为愈伤组织继代培养基：MP固体培养基。

A.愈伤组织的第一轮挑选

愈伤诱导培养6周后，进行愈伤组织的第一轮挑选。将单个外植体诱导的愈伤组织放置于解剖镜下，可以看到外层愈伤呈白色，结构疏松，含水量大呈棉花状，无硬核，生长快，不能分化成苗，将其定义为Ⅲ型愈伤。在解剖镜下用镊子剥去最外层松软愈伤组织后，可看到有些愈伤组织（并不是所有种子诱导的愈伤组织可以清晰地看到这种解剖结构）在整个愈伤团的中心位置有一块表面多突起、色泽鲜亮的愈伤组织，为本发明要挑选的胚性愈伤组织。理论上说，该团胚性愈伤组织来源于胚芽顶端分生组织，为分化能力最强的细胞团。

B.愈伤组织的继代培养

将内部胚性愈伤组织放置于MP固体培养基上，25℃避光继代培养3周。

C.愈伤组织的第二轮挑选

继代培养3周之后进行第二轮挑选。可见有些愈伤组织生长量明显，在继代培养的3周时间内体积增大超过60%，在解剖镜下有明显胚性化细胞，呈微黄色，结构松脆，色泽鲜亮，在解剖镜下能看到明显的胚性化细胞，与报道的柳枝稷优良愈伤组织相似，将其定义为Ⅱ型愈伤组织。而另外一些结构致密，生长较慢，不易分化成苗的愈伤组织定义为Ⅰ型愈伤组织。挑选其中的Ⅱ型愈伤组织，进行分化培养。也可将所挑选的II型愈伤组织继续进行多次继代培养（来源于同一个所述成熟种子的所述II型愈伤组织单独培养，从而可消除同一品种间的遗传差异性），然后再进行分化培养。

D.两轮挑选率的统计

以初始时接种于愈伤组织继代培养基上的内部胚性愈伤组织的个数为分子，以被挑选的愈伤组织为分母，计算得到第一轮挑选率。

以在继代培养的3周之内体积增大超过60%（II型愈伤组织）的愈伤组织的个数为分子，以初始时接种于愈伤组织继代培养基上的内部胚性愈伤组织的个数为分母，计算得到第二轮挑选率。

结果显示：对于处理①（直接诱导），愈伤组织诱导培养基NB7及愈伤组织诱导培养基MB上的第一轮筛选率较高，可达65%以上，而愈伤组织诱导培养基MS7次之，达48.7%；对于处理②（切伤后诱导），愈伤组织三种诱导培养基第一轮挑选率较处理①相比显著提高，其中NB7及MB挑选率可达80%，MS7次之达60%。详见表2。第二轮挑选只挑选生长速率超60%，结构典型的二型愈伤组织。

表2Alamo成熟种子在三种培养基上不同处理的第一轮挑选率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（4）愈伤组织的分化培养

进行愈伤组织的分化培养时选用如下培养基作为分化培养基：REG固体培养基。

将步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织每皿15块，接种于REG固体培养基上，25℃分化培养4周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmolm^-2s^-1，得到丛生芽。培养1周后，有明显的绿芽出现，培养4周后统计分化率。分化率=长出再生芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100%。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表3所示，步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织的分化率为95.73±1.9。

表3Alamo成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的分化率（单位：%）

重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
				96.67	93.54	96.96	95.73±1.9

（5）生根培养

进行生根培养时选用如下培养基作为生根培养基：1/2MS固体培养基。

将步骤（4）获得的丛生芽转接入1/2MS固体培养基中，25℃生根培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmol m^-2s^-1，将得到的无菌苗移栽，获得再生苗。

（6）农杆菌侵染

①将pCAMBIA1301质粒（T-DNA区包括由烟草花叶病毒35S启动子控制的hyg筛选标记基因及gus报告基因）导入农杆菌菌株EHA105，将得到的含有pCAMBIA1301质粒的重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA1301。

②将重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1301接入YEP液体培养基（含有300mg/L壮观霉素，300mg/L链霉素，50mg/L利福平），28℃，220rpm摇菌16h左右至OD₆₀₀达0.8-1.0。收集菌液3000rpm离心10min，用MP液体培养基重悬菌株调OD₆₀₀至0.8-1.0，加入乙酰丁香酮（AS）至终浓度为100μM。

③选取大小为2×2mm²的II型愈伤组织打散放置1h，将其浸泡在3%（3g/100ml）麦芽糖水溶液中冰浴20min。倒掉麦芽糖水溶液，浸泡在以上步骤②获得的重悬农杆菌溶液中，添加100μM乙酰丁香酮（AS），添加Gln至终浓度为300μM，真空处理10min后28℃温和震荡（70rpm）培养20min。

④将步骤③侵染后的愈伤组织放置于3层无菌滤纸上，干燥处理2h，随后将愈伤组织放置于含有500μl MP液体培养基（添加300μM Gln及100μM AS）的2层无菌滤纸上，放置于26℃共培养2天。

⑤将步骤④共培养后的愈伤组织2mm大小摆放于MP固体培养基（添加250mg/L特美汀）中培养7天。7天后进行第一次筛选，将愈伤组织放置MP固体培养基（添加50mg/L潮霉素、150mg/L特美汀）中25℃暗培养两周。两周后，一方面检测II型愈伤组织中gus报告基因的瞬时表达（GUS染色法），另一方面，将愈伤组织放置于MP培养基（添加100mg/L潮霉素、150mg/L特美汀）上进行第二次筛选。

⑥两次筛选后，一方面，统计转化效率（转化效率=潮霉素抗性愈伤数/总转化愈伤数），另一方面，将愈伤组织放置于添加20mg/L潮霉素和150mg/L特美汀的REG固体培养基中25℃，光照16h/黑暗8h进行分化培养4周，光照强度为200μmol m^-2s^-1。

⑦将步骤⑥获得的分化苗移栽到1/2MS固体培养基（添加50mg/L潮霉素、150mg/L特美汀）中，25℃生根培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmolm^-2s^-1。将得到的无菌苗移栽，获得再生苗。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表4所示，采用本发明方法Alamo转化效率可达72.85%±1.2，比Li报道（Li R Y,Qu R D.High throughput Agrobacterium-mediated switchgrass transformation[J].Biomass and Bioenergy,2011,35(3):1046-1054）的50%有明显的提高。

表4Alamo成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的转化率（单位：%）

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					本发明方法	73.58	73.47	71.43	72.85±1.2^a
Li报道的方法	58.2	67.1	45	56.77±11.1^b

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

本实施例中，Alamo的Ⅱ型愈伤组织的挑选、再生及转化如图1所示。

实施例2、柳枝稷品种Performer的II型愈伤组织的获得及组培

供试材料：柳枝稷品种Performer成熟种子。Performer为低地型柳枝稷，营养价值高，饲草品质优良，生物量高。为柳枝稷组培常用材料。供试的Performer成熟种子产于2010年美国北卡罗来纳州（33°50N-36°35'N）。

（1）种子消毒

参照实施例1步骤（1）操作。

（2）愈伤组织的诱导

参照实施例1步骤（2）操作。

愈伤组织的诱导率见表5，对于处理①（直接诱导），MB固体培养基上的愈伤诱导率为53.34%，MS7固体培养基上的愈伤诱导率为41.11%，NB7固体培养基上的愈伤诱导率为52.78%，三种培养基在愈伤诱导率中无明显差异性。而处理②（切伤后诱导）相比处理①（直接诱导）而言，其愈伤诱导率降为25%左右。

表5Performer成熟种子在三种培养基上不同处理的愈伤诱导率

注：同列相同小写字母表示差异不显著（P<0.05）。

（3）愈伤组织的挑选及继代培养

参照实施例1步骤（3）操作。

结果显示：对于处理①（直接诱导），愈伤组织诱导培养基NB7及愈伤组织诱导培养基MB上的第一轮筛选率较高，可达70%以上，而愈伤组织诱导培养基MS7次之，达46.15%；对于处理②（切伤后诱导），愈伤组织三种诱导培养基第一轮挑选率较处理①相比显著提高，其中NB7及MB挑选率可达80%，MS7次之达60%。详见表6。两种处理方式在第二轮挑选时挑选率均可达30%左右。

表6Performer成熟种子在三种培养基上不同处理的第一轮挑选率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（4）愈伤组织的分化培养

参照实施例1步骤（4）操作。

结果如表7所示，步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织的分化率为97.91%±3.6。

表7Performer成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的分化率（单位：%）

重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
				100	100	93.75	97.91±3.6

（5）生根培养

参照实施例1步骤（5）操作。

（6）农杆菌侵染

参照实施例1步骤（6）操作。

结果如表8所示，采用本发明方法Performer转化效率可达96.50%±1.7，与Li报道（Li R Y,Qu R D.High throughput Agrobacterium-mediated switchgrasstransformation[J].Biomass and Bioenergy,2011,35(3):1046-1054）的90%结果一致。

表8Performer成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的转化率（单位：%）

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					本发明方法	97.44	94.44	97.62	96.50±1.7^a
Li报道的方法	98.7	91.3	85	91.67±6.9^a

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

本实施例中，Performer的Ⅱ型愈伤组织的挑选、再生及转化如图2所示。

实施例3、柳枝稷品种Carthage的II型愈伤组织的获得及组培

供试材料：柳枝稷品种Carthage成熟种子。Carthage为过渡型柳枝稷品种，多叶，茎秆生长快，早春返青，生物产量超过美国中西部品种，营养价值高，由于再生困难，较少用于组织培养。供试的Carthage成熟种子产于2010年北卡罗来纳州（33°50'N-36°35'N）。

（1）种子消毒

参照实施例1步骤（1）操作。

（2）愈伤组织的诱导

参照实施例1步骤（2）操作。

愈伤组织的诱导率见表9，对于处理①（直接诱导），MB固体培养基上的愈伤诱导率为60.56%，MS7固体培养基上的愈伤诱导率为61.67%，NB7固体培养基上的愈伤诱导率为69.44%，三种培养基在愈伤诱导率中无明显差异性。而处理②（切伤后诱导）相比处理①（直接诱导）而言，其愈伤诱导率降为30%左右。

表9Carthage成熟种子在三种培养基上不同处理的愈伤诱导率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（3）愈伤组织的挑选及继代培养

参照实施例1步骤（3）操作。

结果显示：对于处理①（直接诱导），愈伤组织诱导培养基MB及愈伤组织诱导培养基MS7上的第一轮筛选率较高，可达50%以上，而愈伤组织诱导培养基NB7次之，达27%；对于处理②（切伤后诱导），愈伤组织三种诱导培养基第一轮挑选率较处理①相比显著提高，其中MS7及MB挑选率可达60%，NB7次之达30%。详见表10。两种处理方式在第二轮挑选时挑选率均可达30%左右。

表10Carthage成熟种子在三种培养基上不同处理的第一轮挑选率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（4）愈伤组织的分化培养

参照实施例1步骤（4）操作。

结果如表11所示，步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织的分化率为90.39%±3.4。

表11Carthage成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的分化率（单位：%）

重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
				93.33	86.67	91.18	90.39±3.4

（5）生根培养

参照实施例1步骤（5）操作。

本实施例中，Carthage的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生如图3所示。

实施例4、柳枝稷品种Blackwell的II型愈伤组织的获得及组培

供试材料：柳枝稷品种Blackwell成熟种子。Blackwell为高地型柳枝稷品种，中等高度，茎秆粗壮，多叶，较强的抗病性，在贫瘠土地和湿地中生产良好，组培体系再生效率较低。供试的Blackwell成熟种子产于2010年俄克拉何马州（33°35'N-37°N）。

（1）种子消毒

参照实施例1步骤（1）操作。

（2）愈伤组织的诱导

参照实施例1步骤（2）操作。

愈伤组织的诱导率见表12，对于处理①（直接诱导），三种培养基上的愈伤诱导率为60%-70%，无明显差异性。而处理②（切伤后诱导）相比处理①（直接诱导）而言，其愈伤诱导率为50%左右。

表12Blackwell成熟种子在三种培养基上不同处理的愈伤诱导率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（3）愈伤组织的挑选及继代培养

参照实施例1步骤（3）操作。

结果显示：对于处理①（直接诱导），愈伤组织诱导培养基MB及愈伤组织诱导培养基NB7上的第一轮筛选率较高，可达45%以上，而愈伤组织诱导培养基MS7次之，约33%；对于处理②（切伤后诱导），愈伤组织三种诱导培养基第一轮挑选率较处理①相比显著提高，其中MS7及MB挑选率可达50%，NB7达60%。详见表13。两种处理方式在第二轮挑选时挑选率均可达30%左右。

表13Blackwell成熟种子在三种培养基上不同处理的第一轮挑选率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（4）愈伤组织的分化培养

参照实施例1步骤（4）操作。

结果如表14所示，步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织的分化率为88.56%±5.8。

表14Blackwell成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的分化率（单位：%）

重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
				90	82.14	93.55	88.56±5.8

（5）生根培养

参照实施例1步骤（5）操作。

本实施例中，Blackwell的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生如图4所示。

实施例5、柳枝稷品种Dacotah的II型愈伤组织的获得及组培

供试材料：柳枝稷品种Dacotah成熟种子。Dacotah为高地型柳枝稷品种，开花较早，株型矮，具有更高的抗旱性，为典型的高地型品种，种子活力高但组培再生困难，目前未报道有成功的再生体系。供试的Dacotah成熟种子产于2010年美国北达科他州（45°55'N-49°N）。

（1）种子消毒

参照实施例1步骤（1）操作。

（2）愈伤组织的诱导

参照实施例1步骤（2）操作。

愈伤组织的诱导率见表15，对于处理①（直接诱导），三种培养基上的愈伤诱导率均为70%左右，无明显差异性。而处理②（切伤后诱导）相比处理①（直接诱导）而言，其愈伤诱导率为60%左右。

表15Dacotah成熟种子在三种培养基上不同处理的愈伤诱导率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（3）愈伤组织的挑选及继代培养

参照实施例1步骤（3）操作。

结果显示：对于处理①（直接诱导），愈伤组织诱导培养基MB及愈伤组织诱导培养基NB7上的第一轮筛选率较高，可达50%以上，而愈伤组织诱导培养基MS7次之，为46.45%；对于处理②（切伤后诱导），愈伤组织三种诱导培养基第一轮挑选率较处理①相比显著提高，其中NB7及MB挑选率可达60%，MS7次之达40%。详见表16。两种处理方式在第二轮挑选时挑选率均可达30%左右。

表16Dacotah成熟种子在三种培养基上不同处理的两轮挑选率

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

（4）愈伤组织的分化培养

参照实施例1步骤（4）操作。

结果如表17所示，步骤（3）挑选得到的Ⅱ型愈伤组织的分化率为80.23%±4.5。

表17Dacotah成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的分化率（单位：%）

重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
				75	82.35	83.33	80.23±4.5

（5）生根培养

参照实施例1步骤（5）操作。

（6）农杆菌侵染

参照实施例1步骤（6）操作。

结果如表18所示，采用本发明方法Dacotah转化效率可达51.70%±4.8。

表18Dacotah成熟种子的Ⅱ型愈伤组织的转化率（单位：%）

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					本发明方法	53.24	55.53	46.32	51.70±4.8

本实施例中，Dacotah的Ⅱ型愈伤组织的挑选及再生如图5所示。

Claims

1.一种获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，包括如下步骤：

（1）以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2℃避光诱导培养4-6周，获得愈伤组织1；

（2）从步骤（1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃避光条件下继代培养3周，获得愈伤组织2；

（3）从步骤（2）获得的愈伤组织2中选取在所述继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织；即为II型愈伤组织。

2.一种单子叶植物的组织培养方法，包括如下步骤：

（2）将步骤（1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃避光条件下继代培养3周，获得愈伤组织2；

所述II型愈伤组织为在继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织；

（4）将步骤（3）获得的再生芽接种生根培养基上，25±2℃生根培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200μmol m^-2s^-1，获得再生苗。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基为MB固体培养基或MS7固体培养基或NB7固体培养基；或

所述愈伤组织继代培养基为固体MP培养基；或

所述分化培养基为REG固体培养基；或

所述生根培养基为1/2MS固体培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述MB固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖、2,4-D和6-BA后得到的培养基；所述MB固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2,4-D的终浓度为5mg/L、6-BA的终浓度为1mg/L；

所述MS7固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖和2,4-D后得到的培养基；所述MS7固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2,4-D的终浓度为7mg/L；

所述NB7固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：硝酸钾2830mg/L，硫酸铵463mg/L，二水合氯化钙166mg/L，七水合硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，四水合硫酸锰4.4mg/L，七水合硫酸锌1.5mg/L，硼酸1.6mg/L，碘化钾0.8mg/L，Na₂·EDTA·2H₂O37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，盐酸硫胺素10mg/L，麦芽糖30g/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2,4-D7mg/L，植物凝胶4.0g/L；

所述MP固体培养基是在所述MB固体培养基中加入终浓度为2g/L的脯氨酸后得到的培养基；

所述REG固体培养基是在MS固体培养基中加入NAA、GA、6-BA和麦芽糖后得到的培养基；所述REG固体培养基中NAA的终浓度为0.2mg/L、GA的终浓度为0.5mg/L、6-BA的终浓度为1mg/L、麦芽糖的终浓度为30g/L；

所述1/2MS固体培养基为将MS固体培养基中的大量元素组分浓度减半其余组分浓度不变，再加入麦芽糖后得到的培养基；所述1/2MS固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上，为如下（a1）或（a2）：

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，在将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上之前，还包括对所述成熟种子按照如下方法进行消毒的步骤：将所述成熟种子在体积分数5%的次氯酸钠水溶液中浸泡1.5h，用水洗涤后浸泡于水中放于4℃的培养箱内3天，3天之后再用体积分数5%的次氯酸钠水溶液处理30min，水洗涤。

7.用于单子叶植物的组织培养的成套培养基，由独立包装的如下培养基中的全部或部分组成：

（a）愈伤组织诱导培养基；

所述愈伤组织诱导培养基为权利要求3或4中的所述MB固体培养基或所述MS7固体培养基或所述NB7固体培养基；

（b）愈伤组织继代培养基；

所述愈伤组织继代培养基为权利要求3或4中的所述MP固体培养基；

（c）分化培养基；

所述分化培养基为权利要求3或4中的所述REG固体培养基；

（d）生根培养基

所述生根培养基为权利要求3或4中的所述1/2MS固体培养基。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法或成套培养基，其特征在于：所述单子叶植物为柳枝稷；

所述柳枝稷具体为低地型柳枝稷、过度型柳枝稷或高地型柳枝稷；

所述低地型柳枝稷具体为柳枝稷品种Alamo或Performer；所述过度型柳枝稷具体为柳枝稷品种Carthage；所述高地形柳枝稷具体为柳枝稷品种Blackwell或Dacotah。

9.利用权利要求1、3-6和8中任一所述的方法获得的II型愈伤组织在作为遗传转化材料中的应用。

10.根据权利要求1-6和8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，来源于同一个所述成熟种子的所述II型愈伤组织单独培养。