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Neues Antibiotikum und dieses enthaltende pharmazeutische Zusammen-
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setzungen, sowie Verfahren zur Herstellung desselben Gegenstand der
Erfindung ist ein neues, auf fermentativem Wege gebildetes Antibiotikum JM 971 und
seine individuellen Komponenten JM 971-A, jM 971-B, JM 971-C (weiterhin als Substanz
A, Substanz B und Substanz C genannt) sowie dessen fermentative Herstellung, Isolierung
und Trennung in individuelle Komponenten durch physikalische und/oder chemische
Methoden. Gegenstand der Erfindung sind ferner 0- und/oder N-Acylate der Substanzen
A, B und C, welche der Isolierung und/oder Charakterisierung der Substanzen A, B
und C dienen, und Säureadditionssalze von allen Verbindungen mit nicht-acylierter
Aminogruppe, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Gegenstand der
Erfindung sind auch pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend das neue Antibiotikum
oder dessen individuelle Komponenten als Wirkstoff, und die Herstellung dieser Zusammensetzungen
auf nicht-chemischem Wege, sowie die Anwendung dieser Wirkstoffe, auch in Form von
pharmazeutischen Zusammensetzungen, zur Tötung oder Wachstumsbehinderung (d.h. Inhibition)
von Mikroorganismen, insbesondere Pilzen, in freier Kultur oder im Organismus eines
durch den Mikroorganismus infizierten Warmblüters. Zum Gegenstand der Erfindung
gehören auch medizinische Methoden ;:ur Behandlung von mikrobiellen, insbesondere
fungischen Infektionen in Warmblütern, insbesondere im Menschen und Nutztieren,
durch die Verabreichung einer antimikrobiell aktiven Menge eines der erfindung;gemäasen
Wirkstoffe als solchen oder insbesßndere in Form einer phannazeutischen Zusammensetzung
an einen Patienten, bei welchem eine solche Behandlung angezeigt ist.
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Das Antlbiotikom JM 971 entsteht als Metabolit durch die biologische
Tätigkeit von verschiedenen Mikroorganismen, insbesondere der Art Leptographium,
z.B. durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der in unseren Laboratorien unter
der Bezeichnung F 8913 aufbewahrt wird.
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Der Stamm F 8913 ist der Art Leptographium lundbergii Lagerb., Melin,
zuzuordnen, welche von Lagerberg und Melin in Svensk Skogsvardstör Tidskr. 25, 248
(1927) eingehend beschrieben ist. Der neue Stamm F 8913 wurde, insbesondere unter
Berücksichtigung der entsprechenden Forderungen gemäss dem "Budapester Vertrag über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke
von Patentverfahren" (weiterhin Budapester Vertrag) und der Regel 28 EPUe, bei Agricultural
Research Culture Collection, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604,
U.S.A., unter der Bezeichnung NRRL 12 527 am 16. Juli 1981 deponiert. Eine entsprechende
Kultur dieses Mikroorganismus mit den Charakteristiken des deponierten Stammes gehört
ebenfalls zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
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Zur Herstellung des Antibiotikums JM 971 wird der Stamm NRRL 12 527
oder eine Mutante davon, oder ein anderer dieses Antibiotikums produzierender Mikroorganismus,
insbesondere einer der Art Leptographium lundbergiiS in einer wässerigen, eine Kohlenstoff-
und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob gezüchtet,
bis das Fermentationsgut eine nachweisbare antibiotische Wirkung zeigt, und hierauf
das Antibiotikum isoliert. Das Antibiotikum JM 971 bildende Mutanten können z.B.
unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen
gewonnen werden. Vorzugsweise verwendet man den erfindungsgemässen Stamm NRRL 12
527.
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Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare
Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, Glycerin, ferner
Inosit. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und
Proteine, sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte,
wasserlösliche
Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen,
von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere
der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze
und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise
Chloride, Carbonate, Sulfate und/ oder Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen,
von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
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Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur
oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in
Schüttelkolben oder Fermentern bekannter Konstruktion. Als Temperatur eignet sich
eine solche zwischen 18 und 400C, vorzugsweise ca. 250C. Eine wesentliche antimikrobielle
Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 4 bis 8 Tagen. Vorzugsweise
kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen
in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z.B.
im Verhältnis von etwa 1:20, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise,
indem man ein durch ca. 14-tägiges Wachstum auf einem festen Nährboden erhaltenes
versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft und 48 Stunden wachsen lässt.
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Zum Testieren der antibiotischen Wirkung im Kulturmedium, sowie auch
in den einzelnen Isolierungs-, Reinigungs- und Trennungsstufen, eignen sich als
Testmikroorganismen besonders gut Candida albicans und Xanthomonas oryzae.
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Erfindungsgemäss wird Antibiotikum JM 971 durch Isolierung aus einem
Fermentationsgut erhalten, worin es durch die Züchtung von den oben erwähnten Mikroorganismen,
vor allem vom näher charakterisierten Stamm NRRL 12 527 entsteht
Die
Iolierung erfolgt auf physiko-chemischem Wege mittels an sich bekannter Trennungsmethoden,
insbesondere durch Zentrifugieren, Filtrieren, Lösungsmittel-Extraktion, Fällung,
Kristallisieren und Chromatographie, vor allem Adsorptions- und Verteilungschromatographie,
z.B. unter Anwendung von Kieselgel, hydrophoben Molekularsieben, wie Sephadex Zu
ph 20, oder Ionenaustauscher. Bei einem typischen Isolierungsverfahren wird das
Mycel vom übrigen Fermentationsgut (Kulturbrühe) bei pH 7,7 durch Filtrieren, gegebenenfalls
unter Anwendung von Filterhilfsmitteln, wie Kieselgur, abgetrennt. Aus dem abgetrennten
Mycel wird der Wirkstoff (Antibiotikum JM 971) in Methanol oder ein ähnliches, mit
Wasser mischbares Lösungsmittel aufgenommen, der wasserhaltige Extrakt wird im Vakuum
vom organischen Lösungsmittel befreit und die wässrige Lösung der Extraktion mit
einem organischen, mit Wasser begrenzt mischbaren Lösungsmittel, insbesondere mit
Ethylacetat oder einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid,
Chloroform oder Trichlorethylen, in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen
Verfahren, wie Gegenstromverfahren, unterworfen. Aus der organischen Lösung werden
flüchtige Anteile, vor allem Lösungsmittel, durch Abdampfen entfernt, und der verbleibende
Rückstand (roher Extrakt) weiterverarbeitet.
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Zur Entfernung der Begleitstoffe, z.B. anderer Metaboliten, vom erfindungsgemässen
Antibiotikum JM 971, zu dessen Reinigung und gegebenenfalls auch zur Trennung individueller
Bestandteile, d.h. Substanzen A, B und C, voneinander wird der rohe Extrakt vornehmlich
durch Chromatographie, z.B. Säulenchromatographie, weiter gereinigt.
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Als Adsorbens ist z.B. Kieselgel oder ein Molekularsieb, wie Sephadex
zu ph 20, besonders geeignet, als Lösungsmittel eignet sich dabei z.B. Chloroform
oder Methylenchlorid, dem Aceton oder Methanol in allmählich ansteigenden Mengen
beigemischt wird, wobei die Wirkstoffe üblicherweise aus Kieselgel durch Gemische
von Chloroform (oder Methylenchlorid) mit Aceton in Volumenverhältnissen von 95:5
bis 50:50 (und unter Umständen mit Aceton allein), aus Sephadex
LH
20 durch Gemische von Methylenchlorid (oder Chloroform) mit Methanol, insbesondere
im Volumverhältnis von etwa 4:1, in angereicherter Form eluiert werden.
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Das Reinigungsverfahren kann, wenn notwendig, wiederholt werden, gegebenenfalls
unter Anwendung von anderen Adsorbentien und/oder Lösungsmittelsystemen. - Die Wirksamkeit
der Reinigung kann in der üblichen Weise durch Dünnschichtchromatographie kontrolliert
werden, wozu die weiter unten angegebenen Systeme besonders vorteilhaft sind. Man
kann auch biologische Testmethoden anwenden oder mit der Dünnschichtchromatographie
kombinieren, z.B. die antibiotische Wirkung der einzelnen Fraktionen gegen einen
geeigneten, vorzugsweise spezifisch empfindlichen, Mikroorganismus testieren. Als
Testorganismus eignet sich Candida albicans oder Xanthomonas oryzae besonders gut,
als Testmethode bewährt sich besonders die Kombination der dünnschichtchromatographischen
Trennung und der bioautographischen Detektion. Dabei wird die entwickelte chromatographische
Platte auf eine mit einem Testorganismus, z.B. einem oben erwähnten, beimpfte Keimplatte
abgedrückt, und der Wirkstoff durch die Bildung einer entsprechenden Hemmzone lokalisiert.
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Zur Reindarstellung kleiner Mengen des Antibiotikums JM 971 kann man
präparative Dünnschichtchromatographie mit Vorteil anwenden; geeignet sind dazu
z.B. Kieselgel-Dünnschichtplatten (wie die Platten 60 F 254 der Fa. Merck) und Gemische
von Chloroform und Methanol mit Zusatz von wässerigem Ammoniak als Elutionsmittel.
In analoger Weise werden auch die individuellen Komponenten (Substanzen A, B und
C) rein erhalten, indem man dieselben Platten und geeignete Elutionssysteme verwendet.
Zusammenfassend sind die besonders geeigneten Bedingungen zur Trennung der Substanzen
A, B und C in der nachstehenden Tabelle A angegeben, die auch über die Richtwerte
einer alternativen Trennmethode - der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) orientiert.
Die gewünschte Zone wird jeweils mechanisch abgetrennt, gesammelt und mit einem
geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise einem Chloroform-Methanol
Tabelle
A Chromatographische Unterscheidung der Wirkstoffe
| * |
| DC am Kieselgel : Rf-Werte HPLC (RP) |
| Wirkstoff System 1 System 2 | System 3 Retentionszeiten |
| Substanz C |
| (1; R1 = R2 = H) 0,41 0,40 0,19 8,2 min. |
| Substanz B |
| (I; R1 = CH3, | 0,40 | 0,50 | 0,22 | 9,8 min. |
| R2 = H) 3' 0,40 0,50 0,22 |
| Substanz A |
| (1; R1 = R2 = 0,50 0,56 0,25 11,1 min. |
| CH3) |
| Gliotoxin als |
| Referenz 0,74 0,71 0,73 - |
* Dünnschichtromatographie: Kieselgelplatten: Merck 60 F 254 (20 x 20 cm; 0,25 mm
dick), Laufdistanz 10 cm.
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Substanzmengen: 10 pg (Gliotoxin 5 pg) Indikator: Jod-Spray oder
-Kammer (ev. Bioautographie mit Cand.
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albic.) Lösungsmittelsysteme (Vol. %): System 1: CHCl3-MeOH-NH4OH
(25 Gew.-% wässrig) 80:19:1 System 2: Untere Phase eines Gemisches von CHC13-MeOH-NH40H
(17 Gew.-% wässrig) 2:1:1 System 3: CHC13-MeOH-Eisessig 80:19:1 ** High Pressure
Liquid Chromatography: (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) Säule: RP C-l8 (analytisch)
4,6 x 250 mm Lichrosorb (Merck) 5 >1m.
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Substanzmengen: 10 ;ug Aufnahme bei 282 nm, Fliessgeschwindigkeit
1,5 ml/min.
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Lösungsmittelsystem isokratisch (Vol.%): 47% Acetonitril und 53%
0,25N Triethylammoniumphosphat-Puffer, pH 2,25, filtriert durch LC-500 cartridge
40 µm (Waters).
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(7:3) Gemisch, welches 1-5% konzentrierter wässriger Ammoniaklösung
enthält, zur Isolierung des reinen Produktes extrahiert. Dieses Reinigungsverfahren
kann auch nach Bedarf unter Anwendung von verschiedenen Adsorbentien und/oder Lösungsmittelkombinationen
wiederholt werden.
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Eine besonders vorteilhafte spezielle Methode zur Reindarstellung
von Substanz A (Formel I; R1 = R2 = CH3) aus Antibiotikum JM 971 oder analogen Konzentraten
besteht darin, dass man ein solches Konzentrat, welches Substanz B und/oder C enthält,
in an sich bekannter Weise mit einem N-Methylierungsmittel behandelt, z.B. mit einem
Methylester einer starken anorganischen Säure (wie eines Halogenwasserstoffs, insbesondere
Bromwasserstoffs oder Jodwasserstoffs, d.h. mit Methylbromid oder Methyljodid, oder
der Schwefelsäure, d.h. mit Dimethylsulfat) oder mit einem analogen Methylester
einer organischen Sulphonsäure (wie der Benzol-, p-Toluol-, p-Brombenzol- oder p-Chlorbenzolsulphonsäure
oder der Methan- oder Ethansulphonsäure), oder aber mit Formaldehyd zusammen mit
einem Reduktionsmittel (wie insbesondere Ameisensäure oder einem komplexen Metallhydrid,
z.B. Natriumborhydrid) unter den allgemeinen Bedingungen der Reaktion nach Eschweiler-Clarke
(vgl. z.B. Merck Index, 9. Edition; Merck & Co. Inc., Rahway, N.J., U.S.A.,
1976, Seite ONR-28 und die dort zitierten Publikationen).
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Durch diese N-Methylierung werden die gegebenenfalls im Gemisch anwesenden
Substanzen B und C in die Substanz A umgewandelt und somit ihre Isolierung, Reinigung
und Ausbeute wesentlich verbessert. Eine solche N-Methylierung kann erfindungsgemäss
auch mit reinen Substanzen B und C durchgeführt werden.
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Eine andere spezielle Methode, die zur Isolierung und Reindarstellung
von Substanz B oder C führt, besteht darin, dass man ein Gemisch von einer dieser
Substanzen mit Substanz A, z.B. das Antibiotikum JM 971, oder ein ähnliches Konzentrat,
mit einem N-Acylierungsmittel, z.B. in der unten beschriebenen Weise, behandelt
und somit die primäre Aminogruppe der Substanz C, oder die Methylaminogruppe der
Substanz B, zu einer acylierten Aminogruppe umwandelt, wobei als die N-Acylgruppe
eine der weiter unten beschriebenen abspaltbaren Amino-Schutzgruppen verwendet wird.
Die N-Acylderivate sind dann infolge ihrer abweichen-.
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den Eigenschaften (z.B. der vermindertem Basizität) von einem Amin,
wie der Substanz A, leichter trennbar.
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Das erfindungsgemässe Antibiotikum JM 971 ist charakterisiert als
ein aus einem entsprechenden Fermentationsgut isoliertes Konzentrat enthaltend als
Wirkstoff eine der weiter unten charakterisierten Substanzen A, B und C, oder ein
Gemisch mehrerer dieser Substanzen in beliebiger Kombination und Mengenverhältnis,
wobei der Mindestgehalt an gesamten Wirkstoffen mindestens 50 Gewichts-%, vorzugsweise
mindestens 90 Gewichts-% beträgt.
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Die einzelnen wirksamen Komponenten des Antibiotikums JM 971, d.h.
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die Substanzen A, B und C, zeichnen sich alle durch die Grundstruktur
eines gegebenenfalls N-substituierten 2-Amino-l- (4-hydroxyphenyl)-8, 10-dimethyl-6-trans-dodecen-3-als
aus, und entsprechen der allgemeinen Formel
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 worin R¹ und R² unabhängig voneinander je ein Wasserstoffatomen
oder Methyl bedeuten. Substanz A ist dabei ein Dimethylamino-Derivat,
Substanz
B ein Monoethylamino-Derivat, und Substanz C ein primäres Amin. Die chemische Struktur
g2mäss Formel I wurde durch Analyse von physikalischen, insbesondere spektralen
Daten z.B. Massenspektrum, Lichtabsorption in ultraviolettem und infrarotem Bereich,
Nuklearmagnetische-Resonanz-Spektrum (CH-NMR), sowie durch chemische Reaktionen,
insbesondere Ozonolyse, ermittelt.
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Die einzelnen Wirkungskomponenten von Antibiotikum JM 971 sind folgendermassen
näher charakterisiert: Substanz A ist ekne chemisch einheitliche Verbindung entsprechend
der Formel I, worin R1 und R2 je ein Methyl bedeutet. Die Summenformel ist C22H37N02
[MG = 347,54]; das ermittelte Elektronenstoss-Massenspektrum des Di-trimethylsilylderivates
mit dem Wert von MH+ = 492 entspricht MH+ = 348 für das unsubstituiertem Molekül.
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Die Verbindung ist farblos und besitzt die gleichen Löslichkeitseigenschaften
wi die nachstehend beschriebenc Substanz B.
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Die optische Drehnung (c = 0,353 im Aethanol) [α]D20 = -15 #
1° und [α]365 nm20 = -53° IR-Spektrum (in Methylenchloridlösung): 3580, 3250,
2960, 2920, 2870, 2850, 2790, 1642, 1615, 1595, 15@5, 1460, 1378, 1330, 1172, 1200,
1052, 1035, 972 und 830 cm-1.
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UV-Spektrum (in Methylenchloridlösung) #max (#): 278 nm (1'400) und
284 nm (1'200).
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Substanz B ist eine chemisch einheitliche Verbindung entsprechend
der Formel I, worin R1 Methyl und R² Wasserstoff bedeutet, das Summenformel C21H35N02
[MG = 333,52]; die dem durch Elektronenstoss-Massenspektrum ermittelten Wert von
MH = 334 entspricht.
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Die Vetbindung ist farblos und relativ gut löslich in (leicht) polaren
Lipoidlösungsmitteln, wie Chloroform, Dichlormethan, Aceton, Ethylacetat, Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxid, und in Alkoholen wie Methanol, Ethanol und Propylenglykol. Sie
ist relativ schwerlöslich in Ether und praktisch unlöslich in aliphatischen Kohlenwasserstoffen
(Hexan, Pentan) und Wasser.
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Die optische Drehung (c = 0,363 in Methylenchlorid): [α]D20
20 = -13 + 1° und [α]365 nm 20 = -46°.
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Die schenbare Diisoziationskonstante in 80% wässrigem MethylcellosolveR:
pKMCS* = 8,3 [vergleiche W. Simon, Helv. 41, 1835 (1958)].
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IR-Spektrum (in Methylenchloridlösung): 3580, 3345, 2960, 2920, 2870,
2850, 2800, 1612, 1595, 1515, 1456, 1446, 1376, 1330, 1171, 1090, -l 1070, 971,
855, 840 cm UV-Spektrum (in Methylenchloridlösung) X (g ): 277 nm (1700) und max
283 nm (1450).
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Substanz C ist eine chemisch einheitliche Verbindung entprechend der
Formel I, worin R¹ und R² je ein Wasserstoffatom bedeuten. Die Summenformel ist
C20H33N02 [MG = 319,49]; die durch das Elektronenstoss-Massenspektrum der freien
Base, MH+ = 320 und des Ditrimethylsilylderivates, M = 463, ermittelten Werte stimmen
mit den berechneten überein.
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Die Verbindung ist farblos und besitzt mit den Substanzen A und B
vergleichbare Löslichtkeitseigenschaften.
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Die optische Drehnung (c = 0,153 in Methylenchlorid): [α]D20
- 24 # 1° und [α]365 nm 20 = -90°.
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IR-Spektrum (in Methylenchloridlösung): 3580, 2960, 2925, 2875, 2855,
1612, 1595, 1515, 1460, 1378, 1330, 1172, 1100, 1072, 1055, 972 und -l 825 cm UV-Spektrum
(in Methylenchloridlösung) A (g ): 277 nm (1450) und max 283 nm (1230).
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Zum Erfindungsgegenstand gehören auch diejenigen 0- und/oder N-Acylderivate
der Substanzen A, B und C, die ihrer Trennung, Reindarstellung, Identifikation und/oder
Charakterisierung dienen. Der Acylrest ist dabei der Rest einer Carbonsäure mit
höchstens 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einer Monocarbonsäure.
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Zur Trennung und Reindarstellung sind besonders N-Acyl-Derivate der
Substanzen B und C geeignet, in welchen der Acylrest eine leicht abspaltbare Amino-Schutzgruppe
ist, wie sie z.B. in der Chemie der Aminosäuren und Peptide allgemein gebräuchlich
sind und in den entsprechenden Wachschlagewerken. z.B. in Houben-Weyl: Methoden
der organischen Chemie: 4. Auflage, Band 15/I, E. Wünsch (Herausgeber): Synthese
von Peptiden. (Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 1974) zusammenfassend beschrieben
werden.
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Unter diesen, dem vorübergehenden Schutz dienenden Resten sind insbesondere
diejenigen bevorzugt, die sich von der Kohlensäure, und speziell von ihren Monoestern,
ableiten. Unter diesen sind besonders bevorzugt acidolytisch abspaltbare Acylreste,
wie in erster Linie das tert.-Butoxycarbonyl (BOC) und analoge Reste, wie tert.-Amyloxycarbonyl,
Isopropyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl,
Cyclohexyloxycarbonyl, d-Isobornyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl, sowie auch
bestimmte Aralkoxycarbonyl-Reste des 2- (p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl-Typs.
Fcrner gehören unter diese Acylreste auch Amino-Schutzgruppen vom BenzyloxScar bonySTyS
wie Benzyloxycarboryl selber und seine Derivate, die im aromatischen
Teil
durch Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkoxygruppen und/oder Niederalkylreste
substituiert sind, wie p-Chlor- und p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl,
p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Tolyloxycarbonyl, welche im vorliegenden Fall basisch
abspaltbar sind, sowie auch Isonicotinyloxycarbonyl, welches durch Zink-Reduktion
abspaltbar ist. Ein besonders vorteilhafter Acylrest ist ein Ethoxycarbonylrest,
der in p-Stellung eine mit drei Kohlenwasserstoffresten substituierte Silylgruppe,
wie Triphenylsilyl-, Dimethylbutyl-silyl- oder vor allem Trimethylsilylgruppe, trägt.
Ein solcher ß Trihydrocarbylsilyl)-ethoxycarbonylrest, wie ein ß-(Triniederalkylsilyl)-ethoxycarbonyl,
z.B. insbesondere das ß-(Trimethylsilyl)-ethoxycarbonyl, bildet mit der zu schützenden
2-Aminogruppe eine entsprechende ß-Trihydrocarbylsilyl-ethoxyearbonylaminogruppe
(z.B. die I3-Trimethylsilylethoxycarbonylaminogruppe). Diese Gruppe lässt sich unter
ganz spezifischen, sehr milden Bedingungen durch Einwirkung von Fluoridionen abspalten.
Alle diese Acylreste können auch zur Veresterung der Hydroxylgruppen dienen.
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Zum Zweck der Charakterisierung eignen sich insbesondere Acylreste,
abgeleitet von einfach verzweigten oder insbesondere geradkettigen unsubstituierten
Alkansäuren, die höchstens 8 Kohlenstoffatome besitzen, wie von der Ameisen-, Essig-,
Propion-, Butter-, Isobutter-, Valerian-, Isovalerian-, Capron- oder Oenanthsäure
einerseits, oder von einer gegebenenfalls durch Halogene (wie Chlor, Brom und Fluor),
Nitro, Niederalkoxy (wie Methoxy) und/oder Niederalkyl (wie Methyl) einfach oder
mehrfach substituierten Benzoesäure, wie der Benzoesäure selber, der p-Chlor-, p-Brom-,
p-Nitro-, 2,4-Dinitro-, oder 3,5-Dimethoxy-benzoesäure oder p-Toluylsäure andererseits.
Acylgruppen dieser Art, vor allem das Acetyl und Benzoyl, bilden sowohl 0-wie auch
N-Acylderivate.
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Alle diese Reste werden durch die Behandlung von Substanzen A, B und
C, oder eines Gemisches davon, mit den entsprechenden Säuren, wie
der
Ameisensäure, oder mit einem geeigneten reaktionsfähigen Säurcderivat, insbesondere
einem Halogenid (vorzugsweise Chlorid), symmetrischem Anhydrid, gemischtem Anhydrid
(insbesondere einem solchen mit Trifluoressigsäure) oder Keten, eingeführt. Als
Reaktionsmedium kann man z.B. überschüssiges Acylierungsmittel verwenden, sowie
auch neutrale, nicht acylierbare organische Lösungsmittel, wie Kohlenwasserstoffe
(z.B. Pentan, Hexan, Cyclohexan), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Methylenchlorid,
Chloroform), Ether (z.B. Diethylether, Ethylenglykoldimethylether, Tetrahydrofuran,
Dioxan), Säureester (z.B. Ethylacetat) und Säureamide (z.B. Acetamid, Dimethylformamid);
und gegebenenfalls auch nicht acylierbare organische Basen verschiedener Basizität,
wie heteroaromatische Basen (z.B. Pyridin, Collidin, Chinolin), tertiäre Amine (z.B.
Triethylamin, N-Ethylpiperidin, N-Methylmorpholin, N,N'-Dimethylpiperazin) oder
1,5- Diazabicyclo[5,4,0]undec-5-en; oder aber man arbeitet mit zweckmässigen Kombinationen
aller dieser Lösungsmittel. Die Reaktionstemperatur kann sich im Bereich von etwa
-70" bis zur Siedetemperatur des Gemisches, vorzugsweise zwischen etwa -200 bis
etwa +300C, bewegen.
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Je nach den jeweiligen Acylierungsbedingungen, insbesondere mit Hilfe
vom angewendeten Reagens, Reaktionsmedium, Base, Temperatur und Reaktionszeit, kann
man die Acylierung so lenken, dass eine oder beide Hydroxylgruppen und/oder die
Aminogruppe bevorzugt acyliert wird, wobei man gemäss allgemein bekannten Methoden,
die auch in den nachstehenden Beispielen näher illustriert werden, vorgeht. - Die
Abspaltung der zum vorübergehenden Schutz verwendeten Acylgruppen erfolgt nach an
sich bekannten allgemeinen Methoden, vgl. das oben zitierte Nachschlagewerk (Houben-Weyl).
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Substanzen A, B und C, sowie ihre O-Acylderivate, können auch in Form
ihrer Säureadditionssalze, insbesondere physiologisch verträglicher SEureadditionssalze
, vorliegen. Zur Salzbildung werden vorzugsweise übliche pharmazeutisch anwendbare
Säuren eingesetzt; von den anorganischen Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren,
wie die Chlorwasserstoffsäure, aber auch Schwefelsäure und Phosphor- bzw. Pyrophosphorsäure
zu
nennen, von den organischen Säuren sind es in erster Linie die Sulfonsäuren, wie
die Benzol- oder p-Toluol-sulfonsäure, oder Niederalkansulfonsäuren, wie Methansulfonsäure,
ferner auch Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitin- und Stearinsäure,
Aepfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Zitronensäure.
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Säureadditionssalze werden aus entsprechenden basischen Verbindungen
in konventioneller Weise erhalten, z.B. durch eine vorsichtige Behandlung dieser
mit einer äquivalenten oder überschüssigen Menge der gewünschten Säure, vorzugsweise
in einem inerten Lösungsmittel. Aus diesen Salzen können mit Basen in konventioneller
Weise, z.B. durch die Behandlung mit organischen Basen oder Alkalimetallhydroxiden
oder vorzugsweise -carbonaten oder -hydrocarbonaten, die entsprechenden Basen zurück
erhalten werden.
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Das erfindungsgemässe Antibiotikum JM 971, sowie seine Komponenten
(Substanzen A, B und C) weisen neben einer schwächeren Wirkung gegenüber grampositiven
Bakterien eine gute antifungische Wirkung auf Fadenpilze (Hyphomyceten), wie Trichoderma
mentagrophytis, Pythium debaryanum und Botrytis cinerea, und vor allem eine sehr
gute Wirkung gegenüber hefeartigen Pilzen, wie Candida albicans, auf (vgl. Tabelle
B).
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Die antibiotische Aktivität des Antibiotikums JM 971 und dessen Komponenten
in vitro wurde durch die konventionelle Agarverdünnungsmethode ermittelt. Die gefundenen,
das Wachstum der Testorganismen noch hemmenden Minimalkonzentrat ionen (MIC = minimum
inhibiting concentrations) werden in Mikrogramm pro Milliliter (g/ml) angegeben.
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Tabelle B Antibiotische Wirksamkeit von Antibiotikum JM 971.
| Mikroorganismus | K Nr. | MIC µg/ml | |
| Candida albicans ATCC 11651 1082 0.1 |
| Candida albicans 1133 0.1 |
| Candida albicans 1133/A 0.2 |
| Candida albicans 1114 0.2 |
| Candida albicans 355 0.1 |
| Candida albicans 75 0.2 |
| Candida tropicalis ATCC 13803 1102 0.2 |
| Aspergillus fumigatus ATCC 9197 76 32 |
| Sporotrichum schenkii ATCC 10212 83 0.05 |
| Trichophyton mentagrophytes AT- 9533 84 2 |
| Microsporum canis ATCC 10214 240 2 |
Das neue Antibiotikum JM 971 und seine individuellen Komponenten (Substanzen A,
B und C in beliebgem Verhältnis) können daher erfindungsgemäss zu Bekämpfung vc.
Infektionen, die durch Pilze oder grampositive Bakterien hervorgerufen werden ferner
als Futtermittelzusatz, zur Konservierung von Nahrungsmitteln, als Pflanzenschutzmittel
(insbesondere für S?tn.lingskulturen, Tomatenkulturen und Reiskulturen) oder als
Desinfektsmittel verwendet werden.
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Die erfindung umfaßt ebenfalls pharmazeutische präparate enthaltend
Antibiotikum JM 97 oder mindestens eine seiner Komponenten (d.h.
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Substanz A, B oder @) als Wirkstc-- , gegebenenfalls zusammen mit
mindestens einem konventionellen pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff.
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Diese erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate können auch noch
andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Auch die Futtermittetzusätze
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Konservierungs-, Pflanzenschutz- und I)esinfektionsmittel können geeignete Trägerstoffe,
wie bekannt, enthalten.
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Zwecks Herstellung pharmazeutischer, sowie übriger, Präparate kann
jeder einzelne der genannten erfindungsgemässen Wirkstoffe mit einem für die topische,
enterale oder parenterale Applikation geeigneten anorganischen oder organischen
Trägermaterial vermischt werden. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht,
die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, z.B. Gelatine, Milchzucker, Stärke,
Magnesiumstearat, pflanzliche Oele, Benzylalkohol, oder andere Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien,
oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben
vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie
Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Auch die Desinfektionsmittel
können mit geeigneten Trägerstoffen, wie bekannt, vermischt werden.
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Die Dosierung der Wirkstoffe (Substanzen A, B und C in beliebigem
Verhältnis oder aber des Antibiotikums JM 971) erfolgt analog derjenigen von anerkannten
Antibiotika und hängt vorwiegend einerseits von Spezies, Körpergewicht, Alter und
individuellem Zustand des behandelten Warmblüters, andererseits von der Applikationsweise
und insbesondere von der jeweiligen Empfindlichkeit des Krankheitserregers ab.
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Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Tötung oder Wachstumsbehinderung
eines gegen mindestens eine der erfindungsgemässen Substanzen A, B und Cg der oben
definierten Formel I, empfindlichen
Mikroorganismus, welche durch
die Behandlung dieses Mikroorganismus oder eines durch diesen Mikroorganismus infizierten
Medium mit einer antimikrobiell wirksamen Dosis einer der genannten erfindungsgemässen
Verbindungen, oder einem Gemisch davon, wie mit Antibiotikum JM 971, charakterisiert
ist. - (Unter der Bezeichnung "eine antimikrobiell wirksame Dosis" ist eine solche
Menge des Wirkstoffes zu verstehen, die zu einer wirkungsvollen Inhibition des betreffenden
zu behandelnden Mikroorganismus ausreicht.) - Insbesondere, nicht aber ausschliesslich,
dient eine solche Methode ' der Heilung eines tierischen oder insbesondere menschlichen
Körpers, welcher durch einen solchen Mikroorganismus infiziert ist.
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Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die obenbeschriebene Erfindung;
sie sollen jedoch diese in ihrem Umfang in keiner Weise einschränken. Temperaturen
werden in Celsiusgraden angegeben. Die Zusammensetzung von Lösungsmittelgemischen
ist im Volumenverhältnis angegeben. Wenn nicht anders angegeben, ist das als Adsorbens
verwendete Kieselgel ein Produkt der Fa. Merck, Darmstadt, BRD, welches unter der
Bezeichnung Kieselgel 60 im Handel ist, die verwendeten präparativen Dünnschicht-Platten
sind Produkte derselben Firma und tragen die Bezeichnung Kieselgel 60 F 254.
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Beispiel 1: Für die Fermentation werden die folgenden Kulturmedien
vorrätig zubereitet: Kulturmedium Nr. 1 Hefecxtraktpulver 10 g Pepton 20 g Glucose
20 g Aqua destillata ad 1000 ml pH: 6,0 Sterilisation: 20 Minuten bei 1200 C Kulturmedium
Nr. 2 Protanimal 20 g Sojamehl 5 g Pharmamedia 3 g Hefeextrapulver 3 g Proteosepepton
3 g Ammoniumnitrat lg Glucose 40 g Dextrin 20 g Glycerin 20 g Malzextraktpulver
10 g KH2PO4 0,6g CaC03 10 g Aqua destillata ad 1000 ml pH: 7,0 Sterilisation: 20
Minuten bei 1200 C Ein gut bewachsenes Schrägagarröhrchen des Leptographium lundbergii
F 8913 (NRRL 12 527) wird mit 5 ml 0,2-m Phosphatpuffer vom pH 7 aufgeschwemmt.
3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane (Einbuchtung, "baffle") mit je 100 ml Kulturmediums
Nr. 1 werden mit je 5 ml der Leptograplijum-Suspension beimpft und 48 Stunden auf
einer rotierender Schüttelmaschine mit 250 upm bei 25° inkubiert. Durch je 25 ml
der so gewonnenen
Kultur werden in sechs 2-Liter Erlenmeyerkolben
mit 4 Schikanen jeweils 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden
anschliessend bei 25C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden
inkubiert.
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1,5 Liter der Kultur aus den 2-Liter-Kolben werden in einen 50-Liter
Fermenter der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 48 Stunden
bei 250 inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter
des Kulturmediums Nr. 2 übertragen. [Der Fermenter weist ein Totalvolumen von 500
Liter auf und besitzt einen 6-blättrigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche,
"baffles")].
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Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 1 atü, Rührgeschwindigkeit
450 upm, Temperatur 250, Luftdurchsatz 1 Liter ViV/Min. Die Bedingungen entsprechen
einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 200 mM 02/1/Et. Die
optimale Bildung des Antibiotikums JM 971 erfolgt nach ca. 160 Stunden Inkubation.
Die Kulturlösung weist dann ein pH von 7,7 auf. Sie hat eine Aktivität von 10 bis
14 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans und Xanthomonas oryzae
unter Verwendung von Whatmann A discs 0 6 mm.
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Beispiel 2: 300 Liter der nach Beispiel 1 aus 168-stündiger Fermentation
erhaltenen Kulturlösung von pH ~7,7 werden unter Zugabe von 2 % Dicalit (Diatomeenerde)
als Filterhilfsmittel filtriert.
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(Das Kulturfiltrat, welches nur wenig des erfindungsgemässen Antibiotikums
enthält, wird verworfen.) 70 kg Rückstand (Mycel + Dicalite) aus obiger Filtration
werden einmal mit 300 Litern Methanol verrührt und unter Druck abgenutscht. Das
inaktive Mycel wird verworfen und 297 Liter des wässrig-methanolischen Extraktes
im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein wässriger Mycel-Extrakt; von 44 Litern
mit pH 8,8. Dieser wird dreimal mit je 80 Litern Ethylacetat extrahiert, die inaktive
wässrige Schicht verworfen und 240 Liter Mycel-Ethylacetatextrakt werden im Vakuum
eingedampft. Der zähflüssige Rückstand wird zwischen Heptan und 80-%
wässriges
iekhiiol verteilt und die untere Phase im Hochvakuum bei Raumtemperatur zur Trockne
eingedampft. Man erhält 192 g braunes Harz. Dieses wird mit einem Hochleistungsmischer
viermal mit je 1 Liter Heptan digeriert, und der unlösliche Rückstand im Hochvakuum
nachgetrocknet: 118,8 g gelbbraunes Pulver, welches den grössten Teil des Antibiotikums
JM 971 enthält.
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Das erhaltene rohe Antibiotikum wird in 0,5 1 Chloroform gelöst und
an einer Säule von 8 kg Kieselgel 60 (Korngrösse 0,063 - 0,2 mm) chromatographiert.
Man eluiert zuerst mit Chloroform, dann mit Chloroform-Aceton-Gemischen unter stufenweiser
Erhöhung des Acetongehalts von 3 % bis 50 % (v/v). Die Chloroformeluate, die (Chloroform
+ 3 % Aceton)-Eluate und die ersten (Chloroform + 5 % Aceton)-Eluate enthalten lipophilere
Nebenprodukte (ca. 53,5 g). Dann wird mit einer weiteren Menge Chloroform + 5 %
Aceton eluiert und der Acetdngehalt über 10 % auf 50 % gesteigert, wobei man das
Antibiotikum JM 971 grösstenteils in angereicherter Form erhält (30 g Trockenrückstand).
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Aus Resteluaten mit reinem Aceton und mit Methanol kann nur noch eine
kleine Menge des Antibiotikums gewonnen werden.
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16,5 g des erhaltenen angereicherten Antibiotikums JM 971 werden an
einer Säule von 1,5 kg Molekularsieb, wie Sephadex0RLH 20 (Korngrösse 25 bis 100»),
mit einem Gemisch aus 4 Vol.-Teilen Methylenchlorid und 1 Vol.-Teil Methanol chromatographiert.
In den ersten Fraktionen werden 10,5 g eines braunen, harzigen und inaktiven Materials
eluiert. Mit weiteren Mengen des gleichen Elutionsgemisches folgen Fraktionen des
gereinigten Antibiotikums JM 971 von 3,5 g Trockengewicht.
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3,4 g dieses gereinigten Antiobiotikums JM 971 werden in 20 ml Chloroform
an eine Säule von 600 g Kieselgel (Korngrösse 0,05-0,2 mm) adsorbiert. Man eluiert
nacheinander mit Chloroform,einem Gemisch von Chloroform-Aceton im Volumenverhältnis
von 95:5 und mit einem Gemisch von Chloroform-Methanol-25-% wässriges Ammoniak im
Volumenverhältnis
von 35:5:0,5, wodurch insgesamt 0,4 g eines
lipophilen Begleitstoffs abgetrennt wird, Mit dem nachfolgenden Gemisch von Chloroform-Methanol-25-%
wässriges Ammoniak im Volumenverhältnis von 90:10:1 wird das von Verunreinigungen
praktisch freies Antibiotikum JM 971 (ein Gemisch von drei Komponenten: Substanz
A, B und C) in nahezu reiner Form eluiert (ca. 0,6 g).
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Beispiel 3: 140 mg des gemäss Beispiel 2 erhaltenen reinen Antibiotikums
JM 971 werden durch präparative Schichtchromatograpllie auf Kieselgel in seine Komponenten
A, B und C aufgetrennt. Die Substanz wird auf 10 Kieselgelplatten (Merek;60 F 254;
20x20 cm; 2 mm dick), strichförmig aufgetragen, und die Platten werden während 10
Minuten in der Gasphase eines Gemisches von Chloroform-Methanol 8:2 enthaltend 3
Vol.-% wässriges Ammoniak (25-%) vorkonditioniert. Dann entwickelt man mit der abgetrennten
unteren Phase eines Läsungsmittelsystems bestehend aus 2 Vol. Chloroform, 1 Vol.
Methanol und 1 Vol.
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17-%igem wässrigem Ammoniak, bis die Laufstrecke 15 cm beträgt (2
1/2-3 Stunden). Es bilden sich im Uv254-Licht schwach sichtbare Zonen, welche den
Rf-Werten in Tab. A entsprechen und durch Besprühen eines schmalen Streifens (Rest
der Platte abgedeckt) mit Jod stärker hervortreten und markiert werden können. Man
schneidet diese Zonen einzeln heraus und eluiert mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol
7:3, welchem 1 Vol.-% NH4OH (25-%, wässrig) zugesetzt worden ist Dabei lassen sich
die stark angereicherten Wirkstoffe gewinnen, wobei je nach Fraktion, 50 bis 90
% Substanz B, 5 bis 50 % Substanz A und 0,1 bis 5 % Substanz C im wirksamen Anteil
auftreten.
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Unter Umständen kann eine zweite Dünnschichtplattenchromatographie
als zusätzliche Reinigungsstufe notwendig sein.
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Beispiel 4: Die Abtrennung von Substanz C von Substanz B kann auch
mit Vorteil folgendermassen vorgenommen werden: 105 me einer durch wiederholte Säulenchromatographie
hoch angereicherten Wirkstoff fraktion werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst, mit
einer Lösung von 150 mg tert.-Butyloxykohlensäureanhydrid (tert.-Bu.O.CO.O.CO.0.-tert.
-BJ)
in 3 ml Ethylacetat und lässt während 75 MinUten bei Raumtemperatur reagieren. Nach
Zugabe von 0,2 ml wässriger 4N-Ammoniaklösung werden die Lösungsmittel im Hochvakuum
abgedampft. Der trokkene Rückstand wird in 2 ml Chloroform-Methanol (9:1) gelöst
und, wie oben beschrieben, an Kieselgelplatten (Merck 60 F 254, 2 mm dick) im System
Chloroform-Aceton oder Chloroform-Methylethylketon (75:25) oder Chloroform-Methylisobutylketon
(75:25) über eine Distanz von 15 cm chromatographiert. Dabei geben die BOC-Derivate
im W-Licht (254 nm) gut sichtbare und kompakte Zonen, die sich leicht herausschneiden
und einzeln mit Chloroform-Methanol (9:1) eluieren und rein gewinnen lassen. Dabei
ist das eingesetzte primäre Amin vollständig-und das Monomethylamin ungefähr zur
Hälfte in das entsprechende N-Tertiärbutyloxycarbonyl-Derivat (BOC-Derivat) übergeführt
worden. Der nicht umgesetzte Anteil an Monomethylamin bleibt in der Startzone und
kann durch Elution des Rf 0,0 - O,1-Bereiches in der im Beispiel 3 beschriebenen
Weise zurückgewonnen werden.Einige Rf-Werte der BOC-Derivate sind in der Tabelle
C zusammengefasst.
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Tabelle C Rf-Werte der BOC-Derivate
| BOC-Derivat CHCl3-An CHCl3-MeEtK CHCl3-MIBK Cy-MIBK Tol-MeEtK
Tol-MIBK |
| von. 7:3 75:25 75:25 6:4 7:3 75:25 |
| Substanz C 0,47 0,31 0,22 0,25 0,37 0,16 |
| Substanz B 0,51 0,37 0,28 0,29 0,40 0,20 |
| Gl iotoxin |
| (Referenz) 0,41 0,26 0,18 0,09 0,28 0,10 |
DC: Kieselgelplatten (Merck 60 F 254; 0,25 mm dick) Laufdistanz: 10 cm (An = Aceton;
MeEtK = 2-Butanon; MIBK = 2-Methyl-4-pentanon; Cy = Cyclohexan, Tol = Toluol)
Eigenschaften
der BOC-Derivate a) N-t-Butoxycarbonyl (BOC)-Derivat der Substanz C (Formel I; R1
= R = BOC-, d.h. t-BuO.CO-) der Summenformel C25H4lNO4 (MG=419) kristallisiert in
farblosen, rosettenförmig angeordneten Nädelchen vom Schmelzpunkt 117-122° (Kofler-Block),
und ist gut löslich in geläufigen organischen Lösungsmitteln.
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IR-Spektrum (in Methylenchlorid): 3580, 3435, 2960, 2925, 2870, 1708,
1613, 1597, 1515, 1504, 1456, 1396, 1384, 1185, 987 und 822 cm-1 Elektronenstoss-Massenspektrum
(höchste Signale): 419 [M+]. 346 [M - 0-C(CH3)3].
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b) N-t-Butoxycarbonyl (BOC)-Derivat der Substanz B (Formel I; R =
-CH3, R2 = BOC-) der Summenformel C26H43N04 (MG = 433) ist ein farbloses Harz, das
in den meisten organischen Lösungsmitteln gut löslich ist.
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IR-Spektrum (in Methylenchlorid): 3580, 3340 (breit), 2960, 2925,
2875, 1682, 1607, 1598, 1515, 1490, 1455, 1397, 1384, 1186 und 987 cm-1 Beispiel
5: Die Freisetzung der Amine aus den BOC-Derivaten kann folgendermassen vorgenommen
werden: 6 mg des N-BOC-Derivates der Substanz C (Formel I; R¹ = H, R² = BOC-) werden
mit 0,2 ml 90-% wässriger Trifluoressigsäure während 10 Minuten bei Raumtemperatur
unter Stickstoff behandelt. Dem Gemisch wird unter gutem Kühlen 1 ml 4N wässriger
Ammoniaklösung zugegeben, nach ca. 5 Minuten mit Ethanol verdünnt und im Vakuum
zur Trockne eingedampft. Der rohe Rückstand wird, wie unter Beispiel 3 beschrieben,
einer Vorreinigung an 2 Kieselgelplatten von 2 mm Dicke
unterwotfen,
und die dem Rf-Wert des freien Amins einspPechende Zone herausgeschnitten und extrahiert.
Die weitere Reinigung kann entweder, wie oben beschrieben, an 0,25 mm dicken Kieselgelplatten,
oder aber durch HPLC unter den bei Tabelle A beschriebenen Bedingungen durchgeführt
werden. Man erhält 3,6 mg Substanz C.
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In analoger Weise kann man auch das entsprechende N-BOC-Derivat der
Substanz B zum freien Amin umwandeln.
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Beispiel 6: Gehaltsbestimmung von Substanzen A, B und C in Kultur
lösungen bzw. Mycelrückständen von getesteten Mikroorganismen (mengenmässige Angaben
haben nur orientativen Charakter und können je nach Mikroorganismus in breiten Grenzen
variieren).
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Analog Beispiel 1 wird aus insgesamt 4 Liter Kulturlösung 1,9 kg eines
Gemisches von Mycel und Filterhilfsmittel erhalten, welches nach der gemäss Beispiel
2 durchgeführten Extraktion 236 mg eines durch Digerieren mit Heptan entfetteten
Ethylacetat-Extraktes ergibt. Davon werden 220 mg strichförmig auf 2 Kieselgelplatten
Merck 60 F 254 (20x20 cm, 2 mm dick) aufgetragen und im System CHC13-MeOH-wässr.
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NH40H (25 % ) (80:19:3) entwickelt. Gleichzeitig lässt man am Rande
als Standard 10 ug der Substanz B mitlaufen. Dann wird ein ca. 2 cm breiter Bereich,
der die Wirkstoffe enthält, herausgekratzt und gemäss Beispiel 3 extrahiert,wobei
man 5,8 mg eines angereicherten Präparates erhält. Davon werden 40 >ig auf einer
HPLC-Säule unter den bei Tabelle A angegebenen Bedingungen (280 mm) aufgetrennt
und dabei z.B. 7,5 pg Substanz B, 0,7 »g Substanz A und 0,35 »g Substanz C aufgefunden.
Pro 4 Liter Kulturlösung bedeutet dies in typischen Versuchen folgende Gehalte:
Fermentationsversuch
Substanz P Substanz B Substanz C I ~0,1 mg ~1,1 mg ~0,05 mg II ~0,04 mg ~0,75 mg
~0,05 mg III ~0,4 mg ~1,6 mg ~0,4 mg Beispiel 7: Acylderivate der Substanz B der
allgemeinen Formel
Die Acylierung kann mit oder ohne Pyridin durchgeführt werden. Dabei werden die
in der Tabelle D aufgeführten Derivate als Hauptprodukt gebildet.
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Methode A (Acetylierung mit Pyridin): 20 mg Substanz B (80-90 7 rein)
werden in 0,2 ml Pyridin gelöst, mit 0,4 ml Benzol verdünnt und mit 0,1 ml Essigsäureanhydrid
versetzt. Nach 15 Stunden bei Zimmertemperatur werden die Lösungsmittel im Hochvakuum
vollständi entfernt und der Rückstand an 4 Kieselgel-latten durch Entwickeln mit
Chloroform-Aceton 70:30 in seine Komponenten aufgetrennt. Die Zonen von verschiedenen
Acetylderivaten (Rf-Werte siehe Tabelle D) sind im UV-Licht bei 254 nm sichtbar
und werden einzeln mechanisch abgetrennt und durch Extraktion mio Aceton-Methanol
80:20 aus Trägermaterial extrahiert. Man erhält 2,5 mg 4'-O-Monoacetat B1 14 mg
N-,3',4'-0-Triacetat B6 und 1,8 mg N-,4'-0-Diacetat B4.
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Tabelle D Dünnschichtchromatographische Trennung von Acylderivaten
(Kieselgelplatten 20x20 cm, 0,25 mm dick, Laufstrecke 10 cm Fliessmittel: E: Chloroform-Aceton
70:30 X: Chloroform-Methanol-wässeriges Ammoniak (25 %) 80:19:1
| Acylierungs- Verbindung Formel II Rf-Wert |
| methode II |
| R¹ R² R³ R4 System E System X |
| *Ac2O/Pyridin B1 CH3 H H Ac 0,028 0,62 |
| (Methode A) B4 CH3 Ac H Ac 0,53 0,77 |
| 136 CH3 Ac Ac Ac 0,66 0,81 |
| * |
| Ac20 B2 CH3 H Ac H 0,53 0,66 |
| (Methode B) B3 CH3 Ac H H 0,34 0,65 |
| 134 CH3 Ac H | Ac 0,53 0,77 |
| B5 CH3 Ac Ac H 0,49 0,72 |
| C1** H Ac H H 0,20 0,36 |
| Substanz CH3 H H H 0 0,36 |
| Gliotoxin 0,47 | 0,74 |
| (Standard) |
* Ac = Acetyl Aus unreiner Substanz B isoliert.
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Methode B (Acetylierung ohne Pyridin): 30 mg Substanz B (80-90% rein)
werden in einer Mischung von 0,3 ml Acetanhydrid und 0,6 ml Benzol gelöst und 2
Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann werden die Lösungsmittel im Hochvakuum
vollständig entfernt und der Rückstand, wie oben beschrieben, an Kieselgel-Platten
aufgetrennt. Man erhält 19,5 mg N-Monoacetat B3, 2,5 mg N-,4'-0-Diacetat B4, 1,5
mg N-,3-0-Diacetat 13 und 1,5 mg 3-0-Monoacetat B2. Daneben kann noch 1 mg Mono-5
acetat C1, abgeleitet vom primären Amin (Substanz C) und 5 mg unverändertes Ausgangsmaterial
(Substanz B) isoliert werden.
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Eigenschaften der Acetylderivate der Formel II (vgl. Tabelle D) 4'-O-Monoactat
B1. C23H37N03 (MG = 375), Elektronenstoss-Massenspektrum (EI-Massenspektrum): MH+
= 376; IR-Spektrum (CH2C12): 3460, 3355, 2960, 2925, 2872, 2850, 2800, 1760, 1608,
1510, 1460, 1450, 1372, 1218, 1198, 1168, 1018, 1012, 972, 912, -1 853 cm 3-0-Monoacetat
2 : C23H37N03 (MG = 375) IR-Spektrum (CH2C12): 3600, 2960, 2928, 2875, 1737, 1611,
1517, 1405, -1 1375, 1174, 1035, 972, 830 cm N-Monoacetat B3: C23H37NO3 (MG = 375);
EI-Massenspektrum: MH+ = 376 IR-Spektrum (CH2C12): 3620, 3580, 3300, 2960, 2925,
2875, 2855, 1622, 22 1612, 1594, 1518, 1456, 1408, 1377, 1172, 1036, 1019, 971,
828 cm
N-,4'-O-Diacetat B4-. C25H39NO4 (MG = 417): EI-Massenspektrum:
MH+ = 418, M+ = 417.
-
IR-Spektrum (CH2Cl2): 3620, 3420, 2960, 2925, 2873, 2850, 1760, 1630,
-1 1510, 1403, 1371; 1220, 1199, 1102, 1018, 971, 907, 846 cm N-,3-0-Diacetat B
C25H39N04 (MG = 417): EI-Massenspektrum: MH+ = 418; IR-Spektrum (CH2C12): 3580,
3300, 2960, 2925, 2870, 2857, 1738, 1626, 1613, 1595, 1519, 1457, 1408, 1375, 1240,
1174, 1035, 972, 828 cm 1.
-
N-,3,4'-O-Triacetat B6: C27H41NO5 (MG = 459: EI-Massenspektrum: MH+
= 460.
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IR-Spektrum (CH2C12): 2960, 2925, 2873, 2855, 1760, 1738, 1645, 1603,
1510, 1460, 1401, 1370, 1313, 1240, 1220, 1198, 1168, 1032, 1019, 971, 945, 913,
846 cm 1.
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Monoacetat C1 von Substanz C wird bei der Acetylierung einer Substanz
C-haltigen Probe von Substanz B mit Acetanhydrid gebildet utd kann aufgrund der
unterschiedlichen Rf-Werte (vgl. Tabelle D, System E = 0,20 und System X = 0,36)
durch präparative Schichtchromatographie abgetrennt und rein isoliert werden.
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Eigenschaften: C22H35NO3 (MG = 361); EI-Massenspektrum: MH+ = 362
IR-Spektrum (CH2C12): 3580, 3435, 3250, 2960, 2925, 2870, 1660, 1615, 1598, 1518,
1448, 1375, 1330, 1172, 1106, 1073, 1039, 972, 825 cm-1
Beispiel
8: N-Methylierung von Substanz B zu Substanz A In Anlehnung an Borch. J. Org. Chem.
37, 1673 (1972) wird eine Lösung von 6 mg Substanz B (80-90% rein) in 0,1 ml Acetonitril
unter Rühren mit 0,01 ml 37%-iger wässriger Formaldehydlösung und nachher, unter
Rühren und Kühlen mit Eiswasser, mit einer Lösung von 2,5 mg Natriumcyanoborhydrid
(NaBH3CN) in 0,05 ml Acetonitril versetzt.
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Nach 15 Minuten wird die leicht alkalische Lösung durch tropfenweise
Zugabe von 0,04 ml einer 10obigen (Volumen)Lösung von Eisessig in Acetonitril auf
ein pH von ca 7 (Indikatorpapier) eingestellt. Später wird nochmals 0,005 ml Eisessiglösung
zugegeben und total 1 L/2 Stunden gerührt, wobei die Zemperatur auf ca. 350C gehoben
wird. Dann wird 0,1 ml 25-%iges wässriges Ammoniak zugegeben und noch 5 Minuten
gerührt. Nach Zugabe von ca. 1 ml Ethanol wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur
Trockne eingedampft. Der schmierige Rückstand wird in 0,2 ml Methanol gelöst, auf
2 Kieselgelplatten (20 x 20 cm) 0,5 mm dick) aufgetragen, und mit Chloroform-Methanol-Ammoniak
(25%) 80:19:1 entwickelt (16 cm Laufdistanz). Durch Isolieren gemäss Beispiel 3
erhält man 3,7 mg reines Dimethylderivat, welches hinsichtlich seiner Hemmwirkung
auf Candida albicans, Rf-Werte im DC und IR-Spektrums mit der Substanz A identisch
ist.
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Beispiel 9 Methylierung der Substanzen B und C in rohen, bzw. angereicherten
Extrakten zur Ueberführung der verschiedenen Wirkstoffe in die einheitliche Substanz
A, sowie deren Isolierung und Reindarstellung.
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100 mg eines gemäss Beispiel 2 gewonnenen entfetteten Ethylacetat-Extraktes
des Mycels werden in 0,4 ml Acetonitril soweit wie möglich gelöst und nach Zugabe
von 0,04 ml 37%iger wässriger Formaldehydlösung unter Kühlen (Eiswasser) und Rühren
langsam mit einer Lösung von 1Q mg Nat:riumcyanoborhydrid (NaBH3CN) in 0,2 ml Acetonitril
versetzt. Nach 15 Minuten wird die leicht alkalische Lösung durch tropfenweise Zugabe
von 0,16 ml einer 10%gen Lösung von Eisessig in Acetonitril auf pH ca. 7 eingestellt
und noch 2 Stunden weitergerührt,
wobei die Temperatur von 250
auf 350 angehoben wird. Dann wird 0,4 ml 25%iges wässriges Ammoniak zugegeben, 5
Minuten gerührt, mit ca. 5 ml Ethanol versetzt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 1,2 ml Methanol gelöst, auf 3 Kieselgel-Platten (20 x 20 cm
, 2 mm dick) aufgetragen, und mit Chloroform-Methanol-Ammoniak (25%) 80:19:3 entwickelt.
Durch mechanische Abtrennung der entsprechenden Zone und Extraktion wird angereicherte
Substanz A gewonnen, die durch Wiederholung der Chromatographie auf zwei 0,25 mm
dicken Platten reindargestellt wird.