DE69917668T2

DE69917668T2 - Substanz gm-95, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69917668T2
Application number: DE69917668T
Authority: DE
Inventors: Haruo Hachioji-shi SETO; Kazuo Shin-Ya; Konstanty Sayama-shi WIERZBA
Original assignee: Sosei Co Ltd
Current assignee: Sosei Co Ltd
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: CA2346201A1; AU770166B2; ES2217815T3; DK1123937T3; ATE267832T1; EP1123937A1; WO2000024747A1; US7192763B2; CA2346201C; KR100446323B1; US20030191165A1; AU6227799A; US6613759B1; EP1123937B1; EP1123937A9; PT1123937E; KR20010103610A; DE69917668D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung, die über Antitumor-Wirkungen verfügt und als Arznei verwendbar ist, ein Verfahren zur Herstellung derselben sowie Mikroorganismen zur Herstellung der Substanz.
Stand der Technik
Bekannte Beispiele eines Makrolids mit zwei oder mehr Oxazolringen schließen Ulapualid A und B ein (Journal of American Chemical Society, 108, 846–847, 1986), das aus Nacktschnecken gewonnen wird und Antitumor-Wirkung aufweist, sowie Kabiramid C (Journal of American Chemical Society, 108, 847–849, 1986), das ebenfalls aus Nacktschnecken gewonnen wird und fungizide Wirkungen hat.
Makrolide mit Antitumor-Wirkungen, die durch Mikroorganismen des Genus Streptomyces erzeugt werden, sind aus US-A-5567709 und EP-A-269322 bekannt.
Ein Ziel der Erfindung ist die Gewinnung einer neuen Verbindung unter Verwendung eines Mikroorganismus, die über Antitumor-Wirkungen verfügt und als Arzneimittel verwendet werden kann, ein Verfahren zur Herstellung derselben sowie Mikroorganismen, die zur Herstellung der neuen Verbindung mit Antitumor-Wirkungen in der Lage sind.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben Untersuchungen an verschiedenen, mittels Mikroorganismen hergestellten Verbindungen durchgeführt und festgestellt, dass in einer Kulturbrühe des zum Genus Streptomyces gehörigen 3533-SV4-Stammes eine Substanz mit Antitumor-Wirkungen erzeugt wurde. Anschließend gelang den Erfindern die Isolierung des Wirkstoffes, bestimmten sie dessen physikalischchemische Eigenschaften und Struktur und wiesen dessen Antitumor-Wirkungen nach, um damit die Erfindung zu bewerkstelligen.
Die Erfindung stellt eine Verbindung der folgenden Formel (1) zur Verfügung.
Die obige Verbindung wird im Folgenden als „Substanz GM-95" bezeichnet.
Des weiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Substanz GM-95 bereit, welches die Kultivierung eines zum Genus Streptomyces gehörigen Mikroorganismus umfasst und zur Herstellung der Substanz GM-95 in einem Kulturmedium sowie zur Isolierung der Substanz aus der entstehenden Kulturbrühe in der Lage ist.
Des weiteren stellt die Erfindung ein Arzneimittel sowie ein Antitumormittel bereit, die als Wirkstoff die Substanz GM-95 umfassen.
Des weiteren stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die Substanz GM-95 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür bereit.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der Substanz GM-95 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Tumortherapie.
Des weiteren stellt die Erfindung Mikroorganismen bereit, die in der Lage sind, die Substanz GM-95 zu erzeugen, insbesondere Mikroorganismen, die zum Genus Streptomyces gehören.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Es zeigen:
1 ein UV-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung, wie in den BEISPIELEN erhalten.
2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung, wie in den BEISPIELEN erhalten.
3 ein ¹H-NMR-Spektrum der erfindungsgemäßen Verbindung, wie in den BEISPIELEN erhalten.
4 ein ¹³C-NMR-Spektrum der erfindungsgemäßen Verbindung, wie in den BEISPIELEN erhalten.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz GM-95, dargestellt durch obige Formel (1), sind folgende.

1) Molekularformel: Wird die Messung mittels hochauflösender Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie durchgeführt, ist der gemessene Wert von (M + H)⁺ 583,0790 und die diesem Wert entsprechende Molekularformel ist C₂₆H₁₅N₈O₇S.
2) Molekulargewicht: Wird die Messung mittels hochauflösender Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie durchgeführt, wird ein Wert von 582,0712 gemessen.
3) Schmelzpunkt: 138°C–143°C (Zersetzung)
4) Spezifischer Drehwert: [α]_D ²⁰ = –9,38°, bestimmt bei einer Konzentration von C = 0,129 g/100 ml (Methanol).
5) UV-Absorptionsspektrum: siehe 1. Die Messung wurde in Methanol (in einer 7,39 μM Lösung) durchgeführt. Die maximale Absorption lag bei einer Wellenlänge von 259,5 nm und die Extinktion bei dieser Wellenlänge betrug 0,288. Der molare Extinktionskoeffizient (ε) betrug 38982.
6) Infrarot-Absorptionsspektrum (FT-IR): siehe 2. νmax (cm^–1): 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914, 883, 798
7) Löslichkeiten in Lösungsmitteln: In Wasser und in Aceton unlöslich. Löslich in einer Mischung aus Chloroform : Methanol = 1 : 1
8) Farbe der Substanz: gelblich-weiße Pulver
9) Kernresonanzspektrum Die chemischen Verschiebungen im 500 MHz ¹H-NMR-Spektrum (3) und im 125 MHz ¹³C-NMR-Spektrum (4), gemessen in Lösung in einer Mischung aus deuteriertem Chloroform : deuteriertem Methanol = 1 : 1 bei 25°C, sind unten dargestellt. Tabelle 1
10) Retentionszeit (Rt) bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Bei der Analyse wurde bei 6,1 min ein Peak unter folgenden Bedingungen gemessen: Analytische Bedingungen: Säule: PEGASIL ODS (4,6 mm ID × 250 mm, Senshu Scientific Co.) Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (70 : 0,1 : 30, v/v/v) Durchflussrate: 1 ml/min Detektion: 254 nm

Die Substanz GM-95 der Erfindung kann durch Kultivieren eines Mikroorganismenstammes (nachstehend bezeichnet als Substanz GM-95-produzierender Mikroorganismus) erzeugt werden, der in der Lage ist, die Substanz der Erfindung unter geeigneten Bedingungen herzustellen, die üblicherweise nachfolgende sind. Die Erfindung umfasst auch die Substanz GM-95-produzierende Mikroorganismen.
Beispiele der Substanz GM-95-produzierenden Mikroorganismen schließen Mikroorganismenstämme ein, die zum Stamm Streptomyces gehören. Die Erfindung umfasst ebenso die Substanz GM-95, die durch Kultivieren eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces und Aufarbeiten der Kulturbrühe gewonnen werden kann.
Beispiele von Mikroorganismusstämmen, die zum Stamm Streptomyces gehören, sind der Stamm Streptomyces anulatus 3533-SV4 und Mutanten hiervon. Der Stamm Streptomyces anulatus 3533-SV4 ist ein Mikroorganismusstamm, der zur Gattung Streptomyces gehört und der durch die Erfinder neu aus Bodenproben bei Tensui-machi, Tamana-gun und Kumamoto-ken, Japan, isoliert wurde und am 12. August 1998 im National Institute of Bioscience and Human-Technology (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt worden ist unter der Mikroorganismusbezeichnung: Streptomyces anulatus 3533-SV4 (GM95) (Kennziffer vergeben durch den Hinterleger) und der Hinterlegungsnummer FERM BP-6460.
Die Einordnung des Streptomyces anulatus 3533-SV4 sowie die Erforschung seiner mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach dem Verfahren des International Streptomyces Project (ISP) durchgeführt. Die mikrobiologischen Eigenschaften des Streptomyces anulatus 3533-SV4-Stammes sind folgende.
a) Morphologische Eigenschaften
Der Stamm wurde 14 Tage bei 27°C auf ISP-Medium (ISP, International Streptomyces Project) Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 angezüchtet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

1) Verzweigungen sporulierender Hyphen: Einfache Verzweigungen
2) Form der Sporulation: Spiralen, wobei die Sporenform zylindrisch ist
3) Anzahl der Sporen: 10 bis 50 oder mehr
4) Sporenoberfläche: Glatt
5) Sporengröße: 0,3–0,5 × 0,7–1,0 μm
6) Anwesenheit von Flagellaten: keine
7) Anwesenheit von Sporangien: keine
8) Anhaftungsstelle der Sporophoren: Luftmyzel
9) Vorliegen einer sklerotiumbildenden Fähigkeit: keine

b) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien
Die Kultureigenschaften der Stämme auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Farbtöne in Abhängigkeit von den Mediumeigenschaften siehe Tabelle 2 sind angegeben nach The Color Harmony Manual (Ausgabe 1958), dass durch die Container Corporation of America publiziert wurde.
Tabelle 2
c) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich: 20°C–32°C Optimaltemperatur: 20°C–30°C
2) Gelatineverflüssigung: +
3) Stärkehydrolyse: +
4) Gerinnung und Peptonisierung entrahmter Milch: +
5) Herstellung melanoider Pigmente: Tyrosin-Agar-Medium: – Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium: + Trypton-Hefe-Brühe-Medium: +
6) Nitratreduzierung: +
7) Aufnahme von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb-Agar-Medium, (ISP Nr. 9)) L-Arabinose + D-Xylose + D-Glucose + D-Fructose + Saccharose + Inositol + L-Rhamnose + Raffinose + D-Mannitol +

c) Chemotaxonomie
Die Produkte der sauren Hydrolyse aller Zellen wurden mittels Dünnschichtchromatographie analysiert, beschrieben in The Society for Actinomycetes Japan (Hrsg.), [Experimental Method for Identifying Actinomycetes-6-2-70, 1985]. Das Resultat war der Nachweis der LL-Form von Diaminopimelinsäure.
Das Myzel-Substrat dieses Stammes ist nicht fragmentiert. Das Luftmyzel bildet eine gestreckte Hauptachse sowie eine spiralförmige Sporenkette aus, die aus 10 bis 50 oder mehr Sporen besteht, und weist 4 bis 9 Verdrehungen auf den Spitzen eines jeden Myzels auf, die sich unregelmäßig von der Hauptachse verzweigten. Die Sporen haben kein Bewegungsvermögen, eine säulenartige oder elliptische Form, eine Breite von 0,3 μm–0,5 μm, eine Länge von 0,7 μm–1,0 μm und eine glatte Oberfläche. Ein Sklerotium, Sporangien oder andere besondere Formen sind nicht festgestellt worden. Die Zellwände sind vom Chemotyp I.
Die Kulturbeschaffenheiten sind in Tabelle 2 dargestellt. Ein Farbton des Luftmyzels entspricht der gelben Farbreihe. Der Farbton des Substratmyzels ist unbestimmt und nicht durch Ändern des pH-Wertes beeinflusst. Insgesamt wurde kein lösliches Pigment beobachtet. Die physiologischen Eigenschaften entsprechen denen unter obigen Abschnitt c) beschriebenen. Dieser Stamm ist mesophil. Entsprechend der morphologischen Eigenschaften und dem Chemotyp der Zellwände dieses Stammes ist der Stamm der Gattung Streptomyces (nachstehend mit „S." abgekürzt) zuzurechnen.
Auf der Grundlage der oben genannten Eigenschaften wurden die Arten der Gattung S., beschrieben in [Approved Lists of Bacterial Names, 1980], und die nachfolgenden Listen verfügbarer Bakteriennomenklatur durchgesehen und verwandte Arten ausgewählt. Verglichen mit den diagnostischen Eigenschaften von S. spheroides sind die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes und die von S. spheroides nahezu gleich und unterscheiden sich nur in der Aufnahme der Kohlenstoffquellen.
Entsprechend ist der Stamm der Erfindung ein neuer Stamm, der S. spheroides weitgehend ähnelt. Jedoch wurde S. spheroides von Williams et al. in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 4, als Synonym des S. anulatus definiert. Folglich wurde der erfindungsgemäße Stamm 3533-SV4 als zu S. anulatus gehöriger Stamm identifiziert und Streptomyces anulatus 3533-SV4-Stamm benannt.
Es folgen die Vergleiche zwischen Stamm und verwandten Arten.
Tabelle 3
Die erfindungsgemäße Substanz GM-95 kann durch Kultivieren verschiedener Substanz GM-95-produzierender Mikroorganismen erzeugt werden, die zum Beispiel zur Gattung Streptomyces gehören, wie der 3533-SV4-Stamm oder eine Mutante hiervon mit den oben genannten mikrobiologischen Eigenschaften, und zwar in einem geeigneten Medium, indem man einen die erfindungsgemäße Substanz enthaltenden Rohextrakt von einer Kulturbrühe trennt und die Substanz GM-95 vom Rohextrakt isoliert und aufreinigt. Die Kulturbrühe enthält Kulturfiltrat und feste Zellfraktionen.
Die Anzucht der erfindungsgemäßen Mikroorganismen wird nach herkömmlichen Kulturverfahren ausgeführt und im Allgemeinen vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einem fluiden Medium mittels Schüttelkultur oder in einem aeroben Schleuderkulturverfahren und ähnlichen Verfahren durchgeführt. Als verwendbares Kulturmedium kann jedes Medium Anwendung finden, welches Nährstoffquellen enthält, die von den Substanz GM-95-produzierenden Mikroorganismen genutzt werden können. Es kann eine Vielzahl synthetischer und natürlicher Medien verwendet werden. Die dem Medium zugesetzte Kohlenstoffquelle umfasst Glucose, Saccharose, Fructose, Glycerin, Dextrin, Stärke, Melasse, in Wasser eingeweichten Mais sowie organische Säuren usw.; diese Quellen können einzeln oder kombiniert verwendet werden. Die Stickstoffquelle umfasst organische stickstoffhaltige Substanzen wie Pharma-Medien, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Aminosäuren, Harnstoff u. a. sowie anorganische stickstoffhaltige Substanzen wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat u. a. Diese Substanzen können einzeln oder kombiniert verwendet werden. Wo nötig kann das Medium mit Natriumsalzen, Kaliumsalzen, Magnesiumsalzen, Phosphaten und geeigneten Schwermetallsalzen ergänzt werden.
Tritt im Verlaufe der Kultivierung übermäßiges Schäumen auf, kann dem Medium ein Entschäumungsmittel zugesetzt werden. Beispiele für Entschäumungsmittel sind Pflanzenöle wie Sojaöl, Leinsamenöl u. a., höhere Alkohole wie Octadecanol, Tetradecanol, Heptadecanol u. a., sowie verschiedene Siliciumverbindungen.
Der pH-Wert wird vorzugsweise im neutralen Bereich eingestellt. Die Kultivierungstemperatur sollte im für das Wachstum der Substanz GM-95-produzierenden Mikroorganismen geeigneten Bereich – allgemein bei 20°C bis 32°C, vorzugsweise um 25°C bis 30°C – gehalten werden. Die Kultivierungszeit liegt bei beiden Verfahren – der Schüttelkultur sowie der aeroben Schleuderkultur – bei 2 bis 6 Tagen.
Die oben dargelegten, verschiedenen Inkubationsbedingungen können je nach Art und Eigenschaften des verwendeten Mikroorganismus, der äußeren Bedingungen und dergleichen entsprechend verändert und die optimalen Bedingungen hiervon ausgewählt und in den obigen Bereichen eingestellt werden.
Die Auftrennung eines Substanz GM-95-haltigen Rohextrakts aus der Kulturbrühe kann nach herkömmlichen Verfahren zur Isolierung von Fermentationsprodukten erfolgen. Zum Beispiel können Routineverfahren wie Lösungsmittelextraktion, Chromatographie, Kristallisation usw. für sich oder in geeigneter Reihenfolge und Kombination verwendet werden.
Insbesondere können folgende Verfahren angewandt werden. Da die im Verlauf der Kultur erzeugte Substanz GM-95 zumeist im Kulturfiltrat und im Zellkuchen vorliegt, wird die Kulturbrühe auf herkömmliche Art und Weise gefiltert und zentrifugiert, um die feste Zellfraktion vom Kulturfiltrat zu trennen. Anschließend wird Substanz GM-95 aus der festen Zellfraktion, die Substanz GM-95 enthält, unter Verwendung eines Lösungsmittels wie Methanol, Aceton usw. eluiert. Dann wird das Lösungsmittel bei Unterdruck abgezogen, um einen Rohextrakt zu ergeben, der Substanz GM-95 enthält. Zu dem Rohextrakt werden Essigester, Chloroform, Butanol oder ähnliche wasserunlösliche organische Lösungsmittel zugegeben, um Substanz GM-95 in die organische Lösungsmittelphase zu überführen, und anschließend die Lösungsmittelphase unter Zugabe von Mirabilit getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel bei Unterdruck abgezogen, um den Substanz GM-95-haltige Rohextrakt zu erhalten. Des weiteren kann die im Kulturfiltrat enthaltene Substanz GM-95 ebenso wie oben besprochen in die organische Lösungsmittelphase überführt werden, um so den Rohextrakt zu erhalten. Wahlweise können Schritte wie Einstellen des pH-Wertes mit Natriumhydroxid oder Salzsäure, Erhöhen der Extraktionsausbeute sowie Verhindern von Emulsionsbildung durch Zugabe von technischen Salzen usw. durchgeführt werden.
Die Substanz GM-95 kann aus dem oben genannten Rohextrakt durch herkömmliche Verfahren für die Isolation und Aufreinigung von lipophilen Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht wie Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, Kieselgel, Aluminiumoxid, nichtionische makroporöse Adsorptionsharze oder ähnlichen Adsorptionsmittel, Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung von ODS-modifiziertem Kieselgel oder ähnlichem isoliert und aufgereinigt werden. Unter diesen Techniken sind die Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von Chloroform oder einer Mischung von Chloroform/Methylacetat, Chloroform/Methanol, Chloroform/Aceton, Benzol/Aceton usw. als Laufmittel und die Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung von Acetonitril oder einer Mischung von Methanol/0,05% Trifluoressigsäure oder 10 mM Monokaliumphosphat usw. als Laufmittel besonders geeignet. Darüber hinaus kann, sollte eine weitere Aufreinigung vonnöten sein, obiges Chromatographieverfahren wiederholt werden oder in Kombination mit einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Pharmacia) und Chloroform, Methanol usw. als Laufmittel oder ähnlichen Techniken durchgeführt werden. Mit obigem Verfahren kann Substanz GM-95 von hohem Reinheitsgrad gewonnen werden.
Für die Identifizierung von Substanz GM-95 während des Aufreinigungsverfahrens kann der Nachweis mittels Dünnschichtchromatographie und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, vorteilhafterweise kombiniert, durchgeführt werden.
Substanz GM-95 der Erfindung verfügt über Antitumor-Wirkungen; ihre Wirksamkeit als Antitumormittel ist bestätigt worden.
Um Substanz GM-95, die wie oben aufgereinigt wurde, in Form einer pharmazeutischen Verbindung zu verwenden, wird sie in eine pharmazeutisch geeignete Darreichungsform gemäß der beabsichtigten Anwendung verarbeitet. Die Darreichungsform schließt orale Darreichungsformen wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Feingranulate, Flüssigkeiten und Lösungen, Pillen, Emulsionen, Suspensionen usw., und parenterale Darreichungsformen wie Injektionen, Zäpfchen, Salben, Pflaster, Cataplasmen, Aerosole, Augentropfen usw. ein. Diese Darreichungsformen können von einem Fachmann mittels bekannter und allgemein verwendeter Verfahren hergestellt werden.
Bei der Herstellung fester Zubereitungen für die orale Verabreichung werden ein Arzneistoffträger und optional ein Bindemittel, ein Zerfallsmittel, ein Gleitmittel, ein Farbmittel, ein Korrigens, ein Geschmackskorrigens usw. dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zugegeben. Die Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Feingranulate usw. können dann routinemäßig hergestellt werden. Beispiele von Arzneistoffträgern umfassen Lactose, Saccharose, Stärke, Talkum, Magnesiumstearat, kristalline Cellulose, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Glycerin, Natriumalginat, Akaziengummi usw.; Beispiele von Bindemitteln umfassen Polyvinylalkohol, Polyvinylether, Ethylcellulose, Akaziengummi, Schelllack, weißen Zucker usw.; Beispiele von Zerfallsmitteln umfassen getrocknete Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Natriumlaurylsulfat, Glycerylmonostearat, Lactose usw.; Beispiele von Gleitmitteln umfassen Magnesiumstearat, Talkum usw.; und Beispiele von Korrigentien umfassen Weißzucker, Bitterorangenschale, Citronensäure, Weinsäure usw. Das Farbmittel, das Geschmackskorrigens und andere im Stand der Technik bekannte Zusätze können verwendet werden. Wo nötig können solche Tabletten mittels eines bekannten Verfahrens in Dragees durch Bilden eines gebräuchlichen Filmüberzugs weiterverarbeitet werden, beispielsweise in Tabletten mit Zuckerüberzug, in Tabletten mit Gelatineüberzug, in Tabletten mit säureresistentem Überzug, in Filmtabletten usw., und sie können Zweischichttabletten, Mehrschichttabletten usw. sein.
Bei der Herstellung von Flüssigzubereitungen zur oralen Verabreichung werden ein Korrigens, ein Puffer, ein Stabilisator, ein Geschmackskorrigens usw. dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zugesetzt; Lösungen, Zuckersäfte und Elixiere können dann routinemäßig hergestellt werden. Geeignete Korrigentien sind oben aufgeführt. Der Puffer, der verwendet werden kann, umfasst Natriumcitrat usw. und der Stabilisator umfasst Tragantgummi, Akaziengummi sowie Gelatine usw.
Bei der Herstellung der Injektionslösungen werden ein Verdünnungsmittel, ein pH-Stabilisierungsmittel, ein Puffer, ein Stabilisator, ein isotonisches Mittel, ein Lokalanästhetikum usw. dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zugesetzt; Injektionen zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intradermalen oder intraperitonealen Verabreichung können dann routinemäßig hergestellt werden. Das Verdünnungsmittel, das verwendet werden kann, umfasst Wasser, Ethylalkohol, Macrogol, Propylenglycol, ethoxylierten Isostearylalkohol, polyoxylierten Isostearylalkohol, Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester usw. Das pH-Stabilisierungsmittel oder der Puffer umfassen Natriumcitrat, Natriumacetat und Natriumphosphat. Der Stabilisator umfasst neben anderen Substanzen Natriumpyrosulfit, Ethylendiamintetraessigsäure, Thioglycolsäure und Thiomilchsäure. Das isotonische Mittel, das verwendet werden kann, umfasst Natriumchlorid, Glucose usw., und das Lokalanästhetikum umfasst Procainhydrochlorid, Lidocain-hydrochlorid usw.
Bei der Herstellung von Suppositorien wird eine Zäpfchengrundlage, optional ein Tensid usw., dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zugesetzt; die Suppositorien können dann routinemäßig hergestellt werden. Die verwendbare Grundlage umfasst fettige Basen wie Macrogole, Lanolin, Kakaobutter, Triglyceride von Fettsäuren, Witepsol^® (Dynamit Nobel) usw.
Bei der Herstellung von Salben werden eine Grundlage, ein Stabilisator, ein Feuchthaltemittel, ein Konservierungsmittel usw. nach Bedarf dem erfindungsgemäßen Wirkstoff zugesetzt und die Mixtur und Formulierung routinemäßig verarbeitet. Die Grundlage umfasst flüssiges Paraffin, weißes Weichparaffin, weißes Bienenwachs, Octyldodecylalkohol und Paraffin; das Konservierungsmittel umfasst Methyl-p-hydroxybenzoat, Ethyl-p-hydroxybenzoat, Propyl-p-hydroxybenzoat usw.
Bei der Herstellung von Cataplasmen können diese mittels Beschichten eines herkömmlichen Trägermaterials mit besagter Salbe, mit Creme, Gel, Paste usw. routinemäßig hergestellt werden. Die Trägermaterialien schließen gewobene oder nichtgewobene Baumwollfasern, gesponnenes Nylongarn oder Kunstfasern, Filme oder flexibles Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polyurethan usw. sowie geschäumte Folien aus diesen Materialien ein.
Wo nötig kann die oben beschriebene Darreichungsform mit andern Zusätzen wie Farbstoffen, Konservierungsmitteln, Duftstoffen, Geschmacksstoffen, Süßstoffen usw. oder anderen medizinischen Wirkstoffen ergänzt werden.
Der Anteil der erfindungsgemäßen Substanz in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung ist keine kritische Größe und kann frei aus einer großen Spannbreite gewählt werden, liegt jedoch allgemein gesagt in der pharmazeutischen Zusammensetzung bei vorzugsweise 1 bis 70 Gewichtsprozent.
Es gibt keine Begrenzung bei der Art der Verabreichung der erfindungsgemäßen, nach obigen Verfahren hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzung. Folglich kann eine geeignete Darreichungsform entsprechend dem Alter des Patienten, dem Geschlecht und anderen Faktoren sowie dem Schweregrad der Erkrankung gewählt werden. Die Zubereitungen in Form einer Injektionslösung können intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal oder intraperitoneal verabreicht werden. Wenn nötig können die Injektionslösungen unter Beigabe von üblichen Infusionsflüssigkeiten wie eine Glucoselösung oder eine Aminosäurelösung verabreicht werden. Feste Zubereitungen wie Tabletten, Pillen, Granulate, Kapseln usw. und Flüssigzubereitungen für die orale Verabreichung der Erfindung können oral oder enteral verabreicht werden. Suppositorien können rektal verabreicht werden.
Die Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffs, die in jeder Dosierungseinheit der oben genannten Formen zu formulieren ist, kann nicht allgemein festgelegt werden, da dies vom klinischen Zustand des Patienten und der Darreichungsform abhängig ist. Allgemein beträgt die Menge in jeder einzelnen Darreichungsform vorzugsweise 1 mg bis 1000 mg für die oralen Präparate, ungefähr 0,1 mg bis 500 mg für Injektionslösungen und ungefähr 5 mg bis 1000 mg für Suppositorien.
Die Tagesdosierung des Wirkstoffs in jeder der obigen Darreichungsformen kann entsprechend dem Allgemeinzustand des Patienten, dem Körpergewicht, dem Alter, dem Geschlecht und anderen Umständen passend gewählt werden. Gewöhnlich liegt die Tagesdosierung für einen erwachsenen Patienten bei ungefähr 0,1 mg/kg bis 1000 mg/kg und vorzugsweise bei 1 mg/kg bis 100 mg/kg. Diese Dosierung kann auf einmal oder in etwa 2 bis 4 aufgeteilten Tagesdosierungen verabreicht werden.
Die Tumoren, die durch die Verabreichungen von Zubereitungen, welche die erfindungsgemäße Substanz GM-95 enthalten, behandelt werden können, unterliegen keiner Beschränkung und schließen einen soliden malignen Tumor wie Kopf- und Nackenkarzinom, Ösophaguskarzinom, Magenkarzinom, Kolonkarzinom, Rektumkarzinom, Leberkarzinom, Gallenblasenkarzinom oder Cholanginom, Pankreaskarzinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom, Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Blasenkarzinom, Prostatakarzinom, Hodenkarzinom, Osteosarkom, Weichgewebetumoren, Zervixkarzinom, Hautkarzinom, Gehirntumoren usw., ein malignes Lymphom sowie Leukämie, vorzugsweise einen malignen soliden Tumor, ein.
Beispiele
Die Erfindung wird anhand der folgenden Arbeits- und Versuchsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung der Substanz GM-95
a) Kulturverfahren
Ein Reagenzglas (50 ml) wurde mit 15 ml Vorkulturmedium (pH 7,2), das 1,0% lösliche Stärke, 1,0% Polypepton, 1,0% Melasse und 1,0% Fleischextrakt enthält, angesetzt. Nach der Sterilisation wurde das Medium mit einer Impföse mit Streptomyces anulatus 3533-SV4-Stamm (FERM BP-6460) geimpft. Die geimpfte Kultur im Reagenzglas wurde anschließend für 2 Tage bei 27°C einer Schüttel-Kultivierung auf einem Reziprokschüttler unterworfen.
Anschließend wurden 100 ml Produktionsmedium, das 2,0% Glycerin, 1,0% Melasse, 0,5% Casein, 0,1% Polypepton und 0,4% Calciumcarbonat enthielt, in Erlenmeyerkolben von 500 ml Fassungsvermögen pro Kolben gegeben und nach Sterilisation (15 min, 121°C) obige Impfkultur in einem Verhältnis von 2% (v/v) in jeden Kolben eingetragen. Die Kultur in den Kolben wurde einer Schüttelkultivierung für drei Tage bei 27°C auf einem Rotationsschüttler (220 Umdrehungen pro Minute, 7 cm Neigung) unterworfen.
Anschließend wurde jeder der drei Glasfermenter (Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) von 50 Liter Fassungsvermögen mit 30 000 ml des obigen Produktionsmediums gefüllt. Den Glasfermentern wurde ein Entschäumer zugegeben (15 ml Disfoam (CC-118, Nippon Oil and Fats Co., Ltd.), 15 ml Shin-Etsu-Silikon (KM-68-2F, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) und 15 ml Salatöl (Ajinomoto Co., Inc.)); nach der Sterilisation (20 min, 120°C) wurde jedem Glasfermenter die Impfkultur siehe oben in einem Verhältnis von 2% (v/v) zugegeben. Die Kultur wurde 3 Tage bei 27°C kultiviert (aerobe Schleuderapparatur: 400 U/min (Rühren/Gärung), 30 L/min (Sauerstoffzugabe)).
b) Separationsverfahren
Die im obigen Verfahren gewonnene Kulturbrühe wurde in einer Menge von 84,0 l geerntet und zur Abtrennung der Zellpellets zentrifugiert. Nach Verwerfen des flüssigen Überstandes wurden die Zellpellets unter ständigem Rühren einer zweistündigen Extraktion durch Aceton (10,0 l) unterzogen. Durch Filtration wurde das Extrakt abgetrennt, die Extraktion und Trennung wurde anschließend mit zusätzlich 0,5 l Aceton wiederholt. Diese Acetonextrakte wurden vereinigt, anschließend destilliert und auf ein Endvolumen von 2 l eingeengt. Das Lösungsmittel wurde bei Unterdruck abdestilliert, bis Wasser und Aceton vollständig verdampft worden sind. Der so gewonnene ölige Rückstand wurde mit 450 ml Methanol aufgenommen und nach anschließender Filtration bei Unterdruck zur Trockne eingedampft.
c) Isolation und Aufreinigungsverfahren
Der so gewonnene ölige Rückstand wurde in 400 ml eines Chloroform- und Methanol-haltigen Lösungsmittelgemisches (20 : 1) (v/v) gelöst. Die Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (Wakogel C-200 (Korngröße 75 μm–150 μm), 6 cm I. D. × 45 cm) aufgetragen und mit 5 l eines siehe oben hergestellten Chloroform/Methanol-Lösungsmittelgemisches (10 : 1) (v/v) eluiert. Die wirkstoffhaltigen Fraktionen wurden gesammelt und bei Unterdruck zur Trockne eingedampft. Die aufgereinigte Rohsubstanz wurde auf eine Kieselgelsäule (Korngröße 75 μm–150 μm), 3,6 cm I. D. × 30 cm) aufgetragen und mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol/29%iger wässriger Ammoniaklösung (700 : 100 : 1) (v/v/v) eluiert.
Ein wirkstoffhaltiges Eluat wurde gesammelt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml der mobilen Phase siehe oben gelöst und anschließend Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von PEGASIL-ODS-Säulen (Senshu Scientific Co., 20 mm I. D. × 250 mm) (mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (70 : 0,1 : 30, v/v/v), Flussrate: 10,0 ml/min, 254 nm (Detektion in 0,5 mm UV-Küvette)) aufgetrennt. Das Extrakt wurde jedes Mal in einer Menge von 0,8 ml injiziert. Die Substanz GM-95-haltigen Fraktionen wurden gesammelt und bei Unterdruck zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde in 10%igem Methanol/Wasser suspendiert und anschließend auf PEGASIL-ODS-Säulen (Senshu Scientific Co., 1,0 cm I. D. × 3 cm) appliziert. Nach Waschen der Säule mit 10%igem Methanol/Wasser erfolgte die Elution mit 70%igem Methanol/Wasser. Das Eluat wurde bei Unterdruck abdestilliert, um so 3,2 mg Substanz GM-95 zu ergeben.
Die Substanz GM-95 enthaltenden Fraktionen wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von PEGASIL-ODS-Säulen (Senshu Scientific Co., 4,6 mm I. D. × 250 mm) (mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (70 : 0,1 : 30, v/v/v), Flussrate: 1,0 ml/min) detektiert.
Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz GM-95 sind folgende.

1) Molekularformel: Wird die Messung mittels hochauflösender Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie durchgeführt, entspricht der gemessene Wert von (M + H)⁺ von 583,0790 der Molekularformel C₂₆H₁₅N₈O₇S.
2) Molekulargewicht: Wird die Messung mittels hochauflösender Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie durchgeführt, lautet der gemessene Wert 582,0712.
3) Schmelzpunkt: 138°C–143°C (Zersetzung)
4) Spezifischer Drehwert: [α]_D ²⁰ = –9,38°, bestimmt bei einer Konzentration von C = 0,129 g/100 ml (Methanol).
5) UV-Absorptionsspektrum: siehe 1. Die Messung wurde in Methanol (in einer 7,39 μM Lösung) durchgeführt. Die maximale Absorption lag bei einer Wellenlänge von 259,5 nm und die Extinktion bei dieser Wellenlänge betrug 0,288. Der molare Extinktionskoeffizient (ε) betrug 38982.
6) Infrarot-Absorptionsspektrum (FT-IR): siehe 2. νmax (cm^–1): 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914, 883, 798
7) Löslichkeiten in Lösungsmitteln: In Wasser und in Aceton unlöslich. Löslich in einer Mischung aus Chloroform : Methanol = 1 : 1
8) Farbe der Substanz: gelblich-weiße Pulver
9) Kernresonanzspektrum Die chemischen Verschiebungen im 500 MHz ¹H-NMR-Spektrum (3) und im 125 MHz ¹³C-NMR-Spektrum (4) gemessen in Lösung in einer Mischung aus deuteriertem Chloroform : deuteriertem Methanol = 1 : 1 bei 25°C sind unten aufgeführt. Tabelle 4
10) Retentionszeit (Rt) bei Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Bei der Analyse wurde bei 6,1 min ein Peak unter folgenden Bedingungen gemessen: Analytische Bedingungen: Säule: PEGASIL ODS (4,6 mm ID × 250 mm, Senshu Scientific Co.) Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (70 : 0.1 : 30, v/v/v) Flussrate: 1 ml/min Detektion: 254 nm

Gemäß den obigen physikochemischen Daten wurde die Struktur von Substanz GM-95 wie unten identifiziert.
Pharmakologischer Versuch (Antitumorwirkungen)
In Tabelle 5 beschriebene Tumorzellen wurden in 10%igem fetalem Kälberserum-haltigem RPM11640-Medium suspendiert, in Kulturplatten (38 mm) bei einer Dichte von 2 × 10³ Zellen pro Platte plattiert und über Nacht bei 37°C im Inkubator bei 5% CO₂ kultiviert. Anschließend wurden die Wirkstoffe des Versuches (die erfindungsgemäße Verbindung und 5-Fluoruracil), die in verschiedenen Konzentrationen unter der Verwendung von 10%igem fetalem Kälberserum-haltigem RPM11640-Medium gelöst wurden, in jede Platte eingetragen und weitere 72 Stunden kultiviert. Nach Fertigstellung der Zellkultur wurden diese Zellen 15 min mit 25%igem Glutaraldehyd fixiert und dreimal mit Wasser gewaschen. Danach wurden die Zellen mit in 20%iger wässriger Methanollösung gelöstem 0,05%igem Kristallviolett eingefärbt, drei mal mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet. Das Kristallviolett wurde mit 100 μl 0,05 M Natriumdihydrogenphosphat/Ethanol (1/1 (v/v)) extrahiert und dessen Extinktion bei 540 nm mit einem automatischen Spektroskop gemessen. Die „IC₅₀" wurde als die erforderliche Konzentration für eine 50%ige Reduktion beim Wachstum im Vergleich zur Kontrollextinktion definiert. Die Ergebnisse sind wie folgt.
Konzentrationen für 50%ige Wachstumshemmung verschiedener Tumorzellen (IC₅₀ μM)
Die erfindungsgemäße Verbindung konnte daher das in vitro-Wachstum verschiedener Tumorzellen gehemmt haben.
Pharmakologischer Versuch (Telomerase-inhibierende Wirkungen)
Die erfindungsgemäße Verbindung wurde auf eine Telomerase-inhibierende Wirkung hin untersucht, indem Telomerase-haltige Zellextrakte auf herkömmliche Art und Weise verwendet wurden, um die Konzentration zur Hemmung der Telomerase-Aktivität in den Zellextrakten auf 50% (IC₅₀) zu ermitteln. Für die erfindungsgemäße Verbindung wurde ein IC₅₀-Wert von 50 nM ermittelt und weist damit eine äußerst starke Telomerase-hemmende Wirkung auf.
Telomerase kommt in normalen Zellen kaum vor, ist jedoch in verschiedenen malignen Tumoren verbreitet vorhanden (nachgewiesen in 85% und mehr aller maligner Tumoren einschließlich derer, die im Bereich Haut, Brust, Lunge, Magen, Bauchspeicheldrüse, Eierstöcke, Nacken, Gebärmutter, Niere, Blase, Colon und Prostata entstehen sowie im Zentralnervensystem (ZNS), in der Netzhaut und im System der Blutkörperchen). Die erfindungsgemäße Verbindung hemmt die Wirkung des besagten Enzyms und empfiehlt sich dadurch als ein wertvolles Antitumormittel mit einem breiten Einsatzspektrum. Formulierungsbeispiel 1, Kapseln

Substanz GM-95 10 mg

Lactose 50 mg

Maisstärke 47 mg

Kristalline Cellulose 50 mg

Talkum 2 mg

Magnesiumstearat 1 mg

Pro Kapsel 160 mg
Gemäß obiger Rezeptur wurden die Kapseln auf herkömmliche Art und Weise hergestellt. Formulierungsbeispiel 2, Injektionslösung

Substanz GM-95 5 mg

Destilliertes Wasser für die Injektion geeignete Menge

Pro Ampulle 5 ml
Gemäß obiger Rezeptur wurde eine Injektionslösung auf herkömmliche Art und Weise hergestellt. Formulierungsbeispiel 3, Suppositorien

Substanz GM-95 20 mg

Witepsol W-35 (Handelsname Dynamit Nobel Co., Ltd.) 1380 mg

Pro Suppositorium 1400 mg
Gemäß obiger Rezeptur wurden Suppositorien auf herkömmliche Art und Weise hergestellt.
Industrielle Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäße Substanz GM-95 verfügt über ausgezeichnete Antitumoreffekte und ist als therapeutisches Arzneimittel gegen maligne Tumoren einsetzbar. Des weiteren ist der Substanz GM-95-produzierende Mikroorganismus wertvoll, da er in der Lage ist, Substanz GM-95 mit ausgezeichneten Antitumoreffekten zu produzieren.

Claims

Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (1)
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, welches umfasst das Kultivieren eines Mikroorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört und in der Lage ist, die Verbindung von Anspruch 1 in einem Kulturmedium zu produzieren, und Gewinnen der Verbindung aus einer Kulturbrühe.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Mikroorganismus ein Streptomyces anulatus 3533-SV4-Stamm oder eine Mutante davon ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Hinterlegungsnummer des Mikroorganismus FERM BP-6460 ist.
Arzneimittel umfassend die Verbindung von Anspruch 1 als einen Wirkstoff.
Antiumormittel umfassend die Verbindung von Anspruch 1 als einen Wirkstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche für die Tumortherapie ist.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Tumortherapie.
Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Verbindung von Anspruch 1 zu produzieren, welcher ein Streptomyces anulatus 3533-SV4-Stamm oder eine Mutante davon ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 10 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6460.