DE1061482B - Verfahren zur Reinigung des Antibiotikums 899 - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung eines bekannten, durch Biosynthese hergestellten und nachstehend als »Antibiotikum 899« bezeichneten Produktes.

Das Ausgangsprodukt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, das Antibiotikum 899, wird durch Biosynthese unter submersen Bedingungen aus einem Mikroorganismus der Species Streptomyces Virginiae erhalten und ist in Antibiotics and Chemotherapy, HeftV, November 1955, S. 632 bis 639, beschrieben.

Nach der Fermentationsstufe wird das Kulturmedium filtriert und das Filtrat im Gegenstrom mit einem polaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon oder Amylacetat, extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und das Filtrat bei verringertem Druck und Temperaturen unter 50° C eingedampft, bis ein Konzentrat erhalten wird. Dieses Konzentrat wird dann mit einem Überschuß einer organischen aliphatischen nichtpolaren Flüssigkeit, wie Hexan, aufgenommen, der vorzugsweise das 10- bis 12fache der Volumenmenge des Konzentrats beträgt. Der sich bildende Niederschlag des Antibiotikums wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Man erhält auf diese Weise ein braunes Pulver, das getrocknet und anschließend durch Extrahieren mit einer Flüssigkeit, in der das Antibiotikum nicht löslich ist, z. B. Tetrachlorkohlenstoff, von den fetten Bestandteilen befreit. Das rohe Antibiotikum 899 wird anschließend erneut getrocknet.

Gemäß der Erfindung wird das rohe Antibiotikum dann in einem polaren, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. wenigstens SO^fVoiger Essigsäure, gelöst und das gereinigte Produkt mit einem Überschuß von 20 Volumteilen Wasser je Volumteil organisches Lösungsmittel ausgefällt. Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach dem Filtrieren der Niederschlag in einem Lösungsmittel, wie Chloroform oder Met'hylendhlorid, gelöst und mit einem Adsorptionsmittel, wie aktivierter Tonerde oder Magnesiumsilikat, z. B. dem unter dem Handelsnamen »Magnesol« auf den Markt gebrachten Produkt, gereinigt.

Zur Ausfällung des gereinigten Produktes wird die Chloroformlösung mit einem Überschuß einer nichtpolaren organischen Flüssigkeit, wie Hexan, aufgenommen.

Das in der verdünnten Essigsäurelösung zurückbleibende Antibiotikum 899 kann durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, gewonnen und anschließend in der vorstehend beschriebenen Weise gereinigt werden.

Zur Extraktion des Antibiotikums aus dem Kulturmedium kann auch nach dem Filtrieren der vorher mit einem Nichtlösungsmitrel für das Antibiotikum, Verfahren zur Reinigung
des Antibiotikums 899

Anmelder:
R. I. T. Recherche et Industrie
Therapeutiques S.A.,
Genval (Belgien)

Vertreter:

Dr.-Ing. A. ν. Kreisler, Dr.-Ing. Κ. Schönwald,
Dipl.-Chem. Dr. phil. H. Siebeneicher
und Dr.-Ing. Th. Meyer, Patentanwälte,
Köln 1, Deichmannhaus

Pierre de Somer, Louvain,
Hubert Vanderhaeghe₁ Brüssel,
Paul van Dijck, Kessel-Lo₁
Guido Parmentier, Heverle_r
und Herman van de Voorde, Louvain (Belgien),
sind als Erfinder genannt worden

wie Hexan oder Tetrachlorkohlenstoff, entfettete unlösliche Teil des Kulturmediums in der vorstehend beschriebenen Weise behandelt werden.

Das in der beschriebenen Weise durch Biosynthese und Reinigung erhaltene »Antibiotikum 899« ist ein beige bis hellbraunes Pulver mit schwachem Geruch und bitterem Geschmack.

Das Pulver ist in Chloroform gut löslich, in Alkohol und Aceton löslich, in Wasser praktisch unlöslich und in Petroläther und in aliphatischen nicht polaren Lösungsmitteln vollständig unlöslich. Um festzustellen, ob es sich um das gewünschte Produkt handelt, kann man mit p-Dimethyl-amina-benzaldehyd eine saure Lösung des Pulvers erhitzen, die sich dabei rosa färbt. Eine alkalische Lösung wird durch das Pulver in Gegenwart von Diazobenzolsulfonsäure rot gefärbt. Mit Bromwasser erhält man in einer Lösung des Pulvers, in Alkohol und Wasser einen Niederschlag.
Das Antibiotikum 899 ist von besonderem Interesse zur Behandlung von durch Staphylokokken hervorgerufenen Erkrankungen, vor allen in den Fällen, in denen die handelsüblichen Antibiotika auf Grund der Bildung von krankheitserregenden Mikroorganismen, die diesen Antibiotika gegenüber beständig sind,

909 577/395

Claims (5)

gebildet haben. Besonders interessante Ergebnisse wurden mit dem »Antibiotikum 899« bei der Behandlung solcher Krankheiteni wie Osteomyeliten, Angina, Ohrenentzündungen, Brustfellentzündungen, und bei Krankheiten,- die durch grampositive Mikroorganis- 5· men hervorgerufen werden, erzielt. Obgleich- die durch Lokalbehandlung erzielten Ergebnisse besonders aufsehenerregend sind, können aber auch Infektionskrankheiten, die durch krankheitserregende Mikroorganismen- erzeugt werden, die auf das »Antibiotikum899« ansprechen, durch eine allgemeine Behandlung geheilt werden. Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte »Antibiotikum 899« führt nicht zum Auftreten von widerstandsfähigen krankheitserregenden Stämmen, die sich aus Mikroorganismen bilden, die ursprünglich auf das Antibiotikum ansprechen. DieErfindungwird in den nachstehenden Beispielen erläutert: Beispiel 1 10 0001 einer filtrierten Kulturflüssigkeit mit einer antibiotischen Wirksamkeit entsprechend 108 //ecm Standardprodukt werden in einer Gegenstromvorrichtung mit 17001 Methylisobutylketon extrahiert, anschließend filtriert und auf ein A7Olumen von 40 1 eingeengt. Das antibiotische Produkt wird aus der konzentrierten Lösung durch Zusatz von 4801 Hexan ausgefällt. Nach dem Filtrieren werden in dieser Weise 1145 g eines braunen Produktes erhalten, dessen Wirksamkeit 83 % des Standardproduktes beträgt. Dieses ungereinigte Produkt wird in 141 Tetrachlorkohlenstoff suspendiert und erneut filtriert. Der Filterkuchen wird in 23 1 wäßriger 80% Essigsäure gelöst. Nach dem Filtrieren der essigsauren Lösung wird diese zu 450 1 Wasser gegeben und bewegt. Die essigsaure Flüssigkeit, in der noch merkliche Mengen des Antibiotikums enthalten sind, wird von dem Niederschlag abgetrennt. Der Niederschlag wiegt 412 g und hat eine antibiotische Wirksamkeit, die 88% des Standardproduktes entspricht. Dieser Niederschlag wird in 41 Chloroform gelöst und die Lösung zu 85 g »Magnesol« (s. o.) gegeben, bewegt und filtriert. Das antibiotische Produkt wird durch Zusatz von 801 Hexan ausgefällt. Nach dem Filtrieren und Trocknen wiegt das so erhaltene Produkt 336 g und hat eine mikrobiologische Wirksamkeit entsprechend 97% der Wirksamkeit des Standardproduktes. Die im Verlauf der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufen erhaltene essigsaure Flüssigkeit wird mit 101 Chloroform extrahiert. Die von der wäßrigen Phase abgetrennte Chloroformlösung wird filtriert und unter verringertem Druck auf ein Volumen von 3 1 eingeengt und zu 25 g »Magnesol« gegeben. Nach Bewegen und Filtrieren des »Magnesols« wird das antibiotische Produkt durch Zusatz von 401 Hexan aus der Chloroformlösung ausgefällt. Auf diese Weise werden 365 g eines Produktes erhalten, dessen antibiotische Wirksamkeit 91,4% der Wirksamkeit des Standardproduktes entspricht. Die Endausbeute an gereinigtem Antibiotikum beträgt also 60%, bezogen auf die angegebene Wirksamkeit der zu Beginn filtrierten Ausgangskulturflüssigkeit. Beispiel 2 In diesem Beispiel ist gleichfalls ein Verfahren zur Reinigung des rohen Antibiotikums 899 beschrieben, das in dem unlöslichen Teil eines Kulturmediums enthalten ist. Der unlösliche Teil einer Kulturflüssigkeit mit einer antibiotischen Wirksamkeit entsprechend 127 y/ccm des Standardproduktes vor dem Filtrieren und 114 y/ccm nach dem Filtrieren hat eine Wirksamkeit von 13 y/cem des Standardproduktes der nicht filtrierten Kulturbrühe. Der durch Filtrieren der vorstehend erwähnten 10 000 1 Kulturflüssigkeit erhaltene Filterkuchen wird mit 500 1 Hexan vermischt. Nach Abtrennung des Hexans wird das Antibiotikum mit 5001 Methylisobutylketon extrahiert. Die Ketonlösung wird auf ein Volumen von 121 eingeengt und das Antibiotikum durch Zusatz von 140 1 Hexan ausgefällt. Nach dem Filtrieren und Trocknen des Niederschlages werden 255 g eines braunen Pulvers mit einer Wirksamkeit von 62% der Wirksamkeit des Standardproduktes erhalten. Das in dieser Stufe erhaltene Produkt wird anschließend nach dem Verfahren des Beispiels 1 weiterbehandelt. Auf diese Weise werden 76 g Produkt mit einer antibiotischen Wirksamkeit von 91% der Wirksamkeit des Standardproduktes erhalten, was einer Ausbeute von 53%, bezogen auf die Wirksamkeit des unlöslichen Teiles der Kulturflüssigkeit entspricht. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung des bekannten,, biosynthetisch hergestellten Antibiotikums 899, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum in einem mit Wasser mischbaren polaren organischen Lösungsmittel auflöst und das Antibiotikum aus dieser Lösung durch Zusatz von Wasser ausfällt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Auflösung des Antibiotikums 899 wenigstens 80%.ige Essigsäure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Ausfällung des Antibiotikums etwa 20 Volumteile Wasser auf 1 Volumteil des polaren organischen Lösungsmittels zusetzt.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum 899, gegebenenfalls nach Abtrennung des Niederschlages, in einem organischen Lösungsmittel löst und mit Hilfe von Adsorptionsmitteln reinigt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn. zeichnet, daß man als Absorbens aktive Tonerde, wie Bentonit oder Magneskimsilicat, verwendet.

© 909 577/395 7.59