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Verfahren zur Extraktion von 6-Aminopenicillansäure
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weise mit einer wässerigen, ziemlich konzentrierten Lösung durchgeführt, die durch Einengen der Lösung in dem Lösungsmittel vor der Extraktion mit Wasser oder der wässerigen Lösung selbst unter vermindertem Druck erhalten wird ; es ist auch möglich, mehrere aufeinanderfolgende Extraktionen, zunächst eine Extraktion des Lösungsmittels mit Wasser bei einem PH-Wert zwischen 6 und 9, dann eine Extraktion der wässerigen Lösung mit einem Lösungsmittel in saurem Medium und erneut eine Extraktion mit Wasser bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 durchzuführen, wobei die Volumina bei jeder Stufe herabgesetzt werden. Die verschiedenen für die Extraktion des Imins angegebenen Methoden können auf verschiedene Weisen kombiniert werden, ohne aus dem Bereich der Erfindung zu gelangen.
Die Regeneration der 6-Aminopenicillansäure erfolgt durch Hydrolyse mittels einer verdünnten Säurelösung. Die Umsetzung kann zwischen 0 und 300C durchgeführt werden, doch ist es wegen der mittelmässigen Stabilität des behandelten Produktes vorzuziehen, das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur
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phorsäure, auf einen pH-Wert zwischen 1 und 2 angesäuert. Man setzt unter fortgesetztem Rühren ein mit
Wasser nicht mischbares Lösungsmittel zu, das den freigesetzten Aldehyd zu extrahieren vermag. Dieses Lösungsmittel kann aus der Gruppe der Alkohole, wie Butanol, pentanole oder Methylisobutylcarbinol, der Ester, wie Essigsäureäthyl-oder-amylester, der chlorierten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, oder der Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Hexan, stammen.
Im Falle eines unreinen Imins erlaubt die Verwendung guter Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol oder Methylisobutylcarbinol, die ausserdem gewisse Verunreinigungen extrahieren, eine reinere 6-AminopeniciIlansäuie zu erhalten. Nach einer Rührzeit zwischen 15 und 60 Minuten entfernt man gegebenenfalls einen unlöslichen Bestandteil durch Filtrieren und trennt die wässerige Phase ab. Die 6-Aminopenicillansäure kristallisiert aus der wässerigen Lösung durch Einstellen des pH-Wertes auf 3 - 5, vorzugsweise auf 3, 3-3, 6, mit einem alkalischen Mittel, wie beispielsweise Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Ammoniaklösung. Man isoliert sie durch Absaugen und Trocknen.
Eine zweite Fraktion kann durch Einengen der Mutterlauge unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur und erneutes Einstellen des PH auf den oben genannten Wert isoliert werden.
Die Behandlung der Fermentationsbrühen nach einer der oben beschriebenen Methoden führt im allgemeinen zu einer 6-Aminopenicillansäure, deren Reinheitsgrad zwischen 70 und 9fP/o beträgt. Das reine Produkt kann wie folgt durch eine Umkristallisation erhalten werden : Das zu reinigende Produkt wird in Wasser suspendiert und durch Einstellen des PH-Wertes auf etwa 7 mit Hilfe eines alkalischen Mittels, wie beispielsweise Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Ammoniaklösung, gelöst. Die Lösung wird filtriert und die Kristallisation der 6-Aminopenicillansäure durch Ansäuern auf einen pH-Wert zwischen 3 und 5 mit Hilfe einer Mineralsäure oder einer organischen Säure, wie beispielsweise Salzsäure" Phos- phorsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, bewirkt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Der Gehalt der Lösungen und Trockenprodukte an 6-Aminopenicillansäure wurde durch biologische Bestimmung nach Überführung in Penicillin V durch Behandlung mit Phenoxyessigsäurechlorid bestimmt.
Beispiel l : 425 1 Fermentationsbrühe mit einem PH von 6, 3 werden nach Zugabe von Filterhilfe filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Man erhält so 440 I Filtrat mit einem Gehalt von 445 mg/l an 6-Aminopenicillansäure. Das Filtrat, dessen Temperatur 23 C beträgt, wird mit 2, 1 kg Salicylaldehyd, gelöst in 6 1 Aceton, versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und dann auf+l C abgekühlt. Die Extraktion des erhaltenen Imins wird mit einer Apparatur durchgeführt, die eine Gruppe von Emulgier-Dekantierzentrifugen mit zwei Stufen enthält, die so angebracht sind, dass sie im Gegenstrom funktionieren.
Die Gesamtanlage wird mit folgenden Zuführungsgeschwindigkeiten verwendet : Die das Imin enthaltende wässerige Lösung : 200 l/Stunde, Essigsäureäthylester : 80 l/Stunde, wässerige 2nSchwefelsäure : in einer Menge, die die Einstellung des pH-Wertes auf 2, 5 ermöglicht. Man gewinnt nach der Extraktion 160 l Essigsäureäthylester-Extrakt, der durch Filtrieren über einer Schicht Filterhilfe geklärt wird. Der Extrakt wird dann unter vermindertem Druck in einer Konzentriervorrichtung mit kontinuierlicher Rückführung bei einer 200C nicht übersteigenden Temperatur eingeengt und sein Volumen so auf 10 l eingestellt. Das Konzentrat wird dann mit 2, 5 I Wasser versetzt.
Das so erhaltene Gemisch wird gerührt und sein pH-Wert mit einer 2n-Ammoniaklösung auf 7 eingestellt und das Gemisch wird nach 15minütigem Rühren stehen gelassen. Dann wird die wässerige Schicht abgetrennt. Die organische Schicht wird erneut mit 2 l und dann mit 1, 5 I Wasser bei pH 7 extrahiert. Die wässerigen Extrakte werden vereinigt und die so erhaltene Lösung wird unter Rühren mit 1, 5 1 einer wässerigen lOigen Dibenzyl- äthylendiamindiacetatlösung versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen
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und im Vakuum getrocknet.
Man erhält so 370 g rohes Dibenzyläthylendiaminsalz des Salicylaldehydimins der 6-Aminopenicillansäure mit einem Gehalt von 121 g reiner 6-Aminopenicillansäure, was einem Gehalt von 60% an Iminsalz entspricht. Dieses Rohprodukt besitzt die folgenden Kennzahlen : F (Kofler) 100 - 1050C (Zers. )
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pension wird mit Hilfe eines Eisbades auf OOC abgekühlt. Man setzt 1,11 Methylisobutylcarbinol zu und säuert mit 0, 45 I 3n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1, 5 an.
Nach 10minütigem Rühren wird Unlösliches abfiltriert (48 g inaktives Produkt) und die beiden Phasen werden getrennt : Die wässerige Lösung wird mit 0,9 l Methylisobutylcarbinol gewaschen und dann mit 0,3 12, 5n-Ammoniaklösung auf einen PHWert von 3, 3 eingestellt. Man erhält eine erste Fraktion kristallisierter 6-Aminopenicillansäure, die nach 15 Minuten abgesaugt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Diese erste Fraktion besteht aus 60 g 6-Aminopenicillansäure mit einer Reinheit von 89%. Die beiden Lösungen in Methylisobutylcarbinol werden vereinigt und zweimal mit je 0,45 1 Waser bei PH 1,5 extrahiert.
Die wässerigen Lösungen werden mit den Mutterlaugen der Kristallisation vereinigt und das so erhaltene Gemisch wird mit 2,5n-Ammoniaklösung bis zu PH 6 neutralisiert und dann unter vermindertem Druck auf 0,28 l eingeengt. Das Konzentrat wird filtriert und mit 3n-Salzsäure auf PH 3,3 angesäuert. Man erhält so eine zweite Fraktion, die nach Absaugen, Waschen und Trocknen 12 g 6-Aminopenicillansäure mit einem Reinheitsgrad von 44% liefert.
Die beiden vereinigten Fraktionen werden gemeinsam umkristallisiert : Das Gemisch wird in 0, 15 I destilliertem Wasser unter Einstellen des pH-Wertes auf 7 mit 0, 0812, 5n-Ammoniaklösung gelöst. Die Lösung wird filtriert und dann mit 0,05 1 n-Butylalkohol gewaschen. Die wässerige Phase wird mit 0,07 1 3n-Salzsäure auf PH 3, 3 angesäuert und 30 Minuten langsam gerührt. Die umkristallisierte 6-Aminopeni- cillansäure wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet.
Man erhält so 54, 4 greine 6-Aminopenicillan- säure, deren Hauptmerkmale den nachfolgenden Werten entsprechen : F = 208-210 C.
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(c = 0, 3% in n/10-Salzsäure)Beispiel 2 : 100 1 Filtrat einer produktionskultur von 6-Aminopenicillansäure mit einem Gehalt von 305 mg/l an dieser Verbindung werden mit 0,51 kg Salicylaldehyd, gelöst in 2 l Aceton, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Die erhaltene wässerige Lösung wird auf +5 C abgekühlt und mit 50 l Essigsäureäthylester unter Rühren versetzt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 2n-Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Nach 15minütigem Rühren wird das Gemisch stehen gelassen und der Essigsäureäthylester wird abgetrennt.
Man führt eine zweite Extraktion mit 50 l Essigsäureäthylester durch. Die vereinigten und geklärten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck in einer Apparatur mit kontinuierlicher Rückführung eingeengt, ohne dass die Temperatur 200C übersteigt. Wenn das Volumen 2 I erreicht hat, bringt man in die Apparatur kontinuierlich 4 I Methylisobutylketon so ein, dass ein konstantes Volumen aufrechterhalten wird und die Temperatur 250C nicht übersteigt. Das Konzentrat wird unter Rühren mit
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gebildete Niederschlag wird abgesaugt, mit Hexan gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man erhält so 97 g rohes Natriumsalz des Salicylaldehydimins der 6-aminopenicillansäure mit einem Gehalt von 18% reiner 6-Aminopenicillansäure, was einem Gehalt von 300/0 an Iminsalz entspricht. Dieses Rohprodukt weist die folgenden Kennzahlen auf : F (Kofler) = 155-1650C (Zers.)
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50 g des rohen Natriumsalzes des Imins werden in 11 Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf +50C säuert
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7Man gewinnt schliesslich 490 g rohes Dibenzyläthylendiaminsalz des Salicylaldehydimins der 6-Amino- penicillansäure mit einem Gehalt von 74 g reiner 6-Aminopenicillansäure. 311 g des isolierten Rohproi duktes werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und liefern eine erste Fraktion von 23,3 g reiner
6-Aminopenicillansäure vom F = 2100C (Zers.) und eine zweite Fraktion von 18,5 g mit einer Reinheit von 65ale.
Beispiel 4 : 440 l Filtrat mit einem Gehalt von 480 mg/l an 6-Aminopenicillansäure werden, wie in Beispiel 3 beschrieben, jedoch unter Ersatz des Methylisobutylketons durch Dichloräthan behandelt.
Man gewinnt so 273 g rohes Dibenzyläthylendiaminsalz des Salicylaldehydimins der 6-Aminopenicillan- säure mit einem Gehalt von 67 g reiner 6-Aminopenicillansäure.
Man kann dieses rohe Salz durch Umkristallisation reinigen :
Man löst 4 g des Salzes in 130 cm3 Chloroform, filtriert die erhaltene Lösung und kühlt sie dann in einem Eisbad. Dann setzt man tropfenweise 130 cm3 Äther zu. Nach 15minütigem Reifenlassen werden die Kristalle abgesaugt, mit Äther gewaschen und getrocknet.
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mit Hilfe von 2, 5n-Ammoniaklösung auf 3,3 eingestellt wird. Nach 15minütigem Reifenlassen wird die kristallisierte 6-Aminopenicillansäure abgesaugt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 16,3 g 6-Aminopenicillansäure mit einem Reinheitsgrad von 81%.
Die Butanollösungen werden vereinigt und mit 600 cms auf pH 1,5 angesäuertem Wasser extrahiert.
Die wässerige Phase wird zu den Mutterlaugen der Kristallisation der ersten Fraktion zugegeben und der
PH-Wert des Gemisches mit 2, 5n-Ammoniaklösung auf 6 eingestellt. Nach Einengen unter vermindertem
Druck bei einer Temperatur unter 200C auf 1/3 des Volumens wird der pH-Wert erneut mit verdünnter Salzsäure auf 3, 3 eingestellt. Man isoliert dann eine zweite Fraktion von 15, 1 g kristallisierter 6-Amino- penicillansäure von 64%oiger Reinheit.
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säure setzt man 4, 2 g Zimtaldehyd zu, nachdem der PH-Wert auf 7 eingestellt worden war. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 30 Minuten kräftig gerührt und dann mit 90 cm3 einer wässerigen 10% gen Dibenzyläthylendiamindiacetatlösung versetzt.
Nach 15minütigem langsamemRühren werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Man gewinnt so 14,2 g Dibenzyläthylendiaminsalz des Zimtaldehydimins der 6-Aminopenicillansäure vom F = 105 - 1150C (Zers.) mit einem Gehalt von 4, 3 g reiner 6-Aminopenicillansäure.
2, 5 g des rohen Salzes werden durch Auflösen in 20 cm3 Chloroform, Filtrieren und langsamer Zugabe von 40 cm3 Äther unter Rühren umkristallisiert. Nach Absaugen, Waschen und Trocknen wird das Dibenzyläthylendiaminsalz des Zimtaldehydimins der 6-Aminopenicillansäure (1 g) in Form eines mikro-
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wonnen. Die Substanz ist in Wasser, Aceton und dem Wasser-Aceton-Gemisch (50-50 Volumina) unlöslich und in Chloroform, Methanol, Pyridin und Dimethylformamid löslich.
Durch Behandlung von 11 g rohem Dibenzyläthylendiaminsalz des Zimtaldehydimins der 6-Amino- penicillansäure zur Regenerierung der 6-Aminopenicillansäure in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise erhält man 1, 6 g weisser Kristalle vom F=210 C, die 1, 1 g reine 6-Aminopenicillansäure enthalten.
Beispiel 6 : Das Dibenzyläthylendiaminsalz des Benzaldehydimins der 6 - Arninopenicillansäure kann nach der in Beispiel 5 für das Zimtaldehydiminderivat angegebenen Methode hergestellt und umkristallisiert werden.
Es weist in reinem Zustand die folgenden Merkmale auf : Weisse Mikronadeln, die bei etwa I10 C schmelzen und gelb werden, sich wieder verfestigen und bei 1650C zersetzen ;
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unlöslich in Wässer, löslich zu weniger als 0, 5% in Chloroform, löslich zu 0, 5% in Aceton und löslich zu mehr als l% in Methanol, Pyridin, Dimethylformamid und einem Aceton-Wasser-Gemisch (50-50 Volumina).
Beispiel 7 : Man arbeitet wie in Beispiel 5 beschrieben und kann so das Dibenzyläthylendiaminsalz des Anisaldehydimins der 6-Aminopenicillansäure herstellen.
Die Merkmale des gereinigten Produktes sind die folgenden :
Weisse Mikronadeln, die unter Gelbwerden bei 90 - 105 C schmelzen, sich dann wieder verfestigen und bei 1400C zersetzen :
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3% in Methanol) ;Volumina), löslich zu mehr als 1% in Chloroform, Methanol, Pyridin und Dimethylformamid.
Beispiel 8 : Eine wässerige Lösung mit einem Gehalt von 1 g 6-Aminopenicillansäure wird auf PH 7 eingestellt und dann mit 0, 6 g 2-Äthylbutyraldehyd versetzt. Nach 30minütigem Rühren bei Zimmertemperatur setzt man 15 cm3 einer wässerigen 10% igen Dibenzyläthylendiamindiacetatlösung zu.
Der gebildete Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
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Volumina) unlöslich, zu 0,55 in Aceton löslich und zu mehr als 1% in Chloroform, Methanol, Pyridin und Dimethylformamid löslich.
Beispiel 9 : Eine wässerige Lösung mit einem Gehalt von 5 g 6-Aminopenicillansäure wird auf PH 7 eingestellt und mit 10 cm3 einer wässerigen neutralisierten 30% igen Formaldehydiösung versetzt.
Nach 30minütigem Rühren bei Zimmertemperatur sinkt der pH-Wert von selbst auf 4, 1. Die Lösung wird auf +4 C abgekühlt. Dann setzt man 40 cm3 Essigsäureäthylester zu und stellt den pH-Wert mit 3n-Salzsäure auf 2, 5 ein. Nach Rühren wird die wässerige Phase dekantiert und zweimal mit je 40 cm3 Essigsäure- äthylester extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei etwa 0 C eingedampft.
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