AT234267B - Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin aus aeroben, insbesondere submersen Kulturen von Streptomyces viridifaciens (ATCC Nr. 11989) oder dessen Tetracyclin erzeugenden Varianten oder Mutanten in einem üblichen Nährmedium. Bei einem solchen Verfahren werden die genannten Streptomycetenstämme zweckmässig bei Temperaturen von 24 bis 30 C, vorzugsweise bei PH-Werten zwischen 5,0 und 6,5 und in Gegenwart von Sojaproteosen und bzw. oder-peptonen, so lange gezüchtet, bis erhebliche Mengen an Tetracyclin gebildet worden sind, worauf das entstandene Tetracyclin aus dem Kulturfiltrat in üblicherweise isoliert und gegebenenfalls in seine Salze mit Metallen oder Säuren übergeführt wird. 



   Die Isolierung von Tetracyclin aus dem Kulturfiltrat erfolgt im allgemeinen nach Einstellung auf einen pH-Wert von ungefähr 8,5 mit geeigneten organischen Lösungsmitteln oder indem man die das Tetracyclin enthaltende Nährlösung auf einen PH-Wert zwischen 8,0 und 10, 1 und durch Zusatz einer Calciumverbindung, zweckmässig Calciumchlorid, auf einen dem Tetracyclingehalt äquivalenten Gehalt an Calcium, vorzugsweise auf eine Konzentration von 0,01 bis 2,   0%,   einstellt und mit Butanol extrahiert, worauf man gegebenenfalls aus dem Butanolextrakt   Tetracyclinhydrochlorid   durch Behandlung mit wässeriger Salzsäure isoliert. 



   Es wurde nun ein neues Verfahren zur Abtrennung von Tetracyclin aus der Gärflüssigkeit gefunden, welches darin besteht, dass man die Gärbrühe, gegebenenfalls nach Abscheidung des Mycels durch Ansäuern auf einen pH-Wert unter 3,0 und Filtration durch Zusatz starker Basen, insbesondere Ammoniak oder Natriumhydroxyd, auf einen pH-Wert zwischen 8 und 11, vorzugsweise zwischen 9 und 10, einstellt und das dadurch ausgefällte Tetracyclin bzw. Tetracyclin enthaltende Produkt gegebenenfalls einer weiteren Reinigung in an sich bekannter Weise unterwirft.

   Nach einer besonderen Ausbildungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das aus der   Gärbrühe   durch unmittelbare Alkalisierung abgeschiedene Gemisch von Tetracyclin und Mycel mit einer verdünnten wässerigen Säurelösung bei einem pH-Wert unter 3,0 extrahiert und aus dem Filtrat Tetracyclin durch Einstellung auf einen pH-Wert zwischen 4 und 10 ausgefällt.

   Zur Abtrennung von Chlortetracyclin aus dem Rohtetracyclin kann die wässerige Lösung des Tetracyclins bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 11,0 bei gewöhnlicher oder erhöhter Temperatur gehalten werden, bis das verunreinigende Chlortetracyclin im wesentlichen zersetzt ist, worauf praktisch chlortetracyclinfreies Tetracyclin aus der Lösung rückgewonnen wird, oder nach einer andern Arbeitsweise das unreine Tetracyclin oder seine Säuresalze in wässerigem Alkali, zweckmässig in Ammoniak, bei einem pH-Wert zwischen 7, 5 und 9, 0 bei gewöhnlicher Temperatur und zweckmässig in einer sauerstofffreien Atmosphäre so lange aufgeschlämmt werden, bis das Chlortetracyclin in Lösung gegangen ist, worauf das ungelöste, gereinigte, im wesentlichen chlortetracyclinfreie Tetracyclin aus der Alkalilösung abgetrennt wird. 



   Im folgenden wird das erfindungsgemässe Verfahren an Hand mehrerer Beispiele   näher erläutert:     Beispiel l :   Eine einfache und wirkungsvolle Methode der Isolierung von Tetracyclin aus der Gärbrühe ohne die Verwendung grosser Flüssigkeitsvolumina, wie sie bei den bereits beschriebenen Extraktionsverfahren notwendig ist, wird wie folgt durchgeführt : 

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Die Kulturflüssigkeit wird durch Zusatz von Natronlauge auf einen pH-Wert zwischen 9,0 und 10,0 eingestellt, wobei das bei der Gärung gebildete Tetracyclin ausgefällt und an das Mycel adsorbiert wird. 



  Danach wird filtriert. Das Filtrat enthält weniger als   100 gag   Tetracyclin je cm und kann erforderlichenfalls konzentriert und weiter aufgearbeitet werden, da es grosse Mengen an wertvollen Nährstoffen, wie   Proteine, Kohlehydrate, Mineralsalze, Vitamine, vor allem Vitamin B12 und den das tierische Wachstum   fördernden   A. P. A.-Faktor   enthält und entweder als solches oder nach vorherigem Konzentrieren oder Trocknen dem Tierfutter, vor allem solchem vegetabilischen Ursprungs, beigemischt werden kann. Der Filterrückstand mit dem ausgefällten und adsorbierten Tetracyclin kann ebenfalls als solcher oder nach erfolgtem Trocknen als Tierfutter Verwendung finden oder diesem beigemischt werden. 



   Zur Gewinnung von Tetracyclin wird der feste Filterrückstand bei einem pH-Wert von ungefähr 1, 5 
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 und daraus Tetracyclin isoliert und durch Einstellung auf einen pH-Wert von 4,0 bis 10,0, vorzugsweise auf 6,0, in Form der Base oder als Calciumsalz mit einer Wirksamkeit von mindestens   100 lig   je mg aus- gefällt wird. Ein reineres Produkt wird erhalten, wenn der saure Extrakt auf einen pH-Wert von 9,0 bis
10,0 eingestellt und daraus das Tetracyclin mit ungefähr 1/3 des Volumens an n-Butanol extrahiert wird. 



  Der abgetrennte Butanolextrakt wird auf ungefähr 1/20 seines Volumens eingedampft, wobei Tetracyclin in Form der Base oder als Calciumsalz mit einer Wirksamkeit von   mindestens'200/lg   je cm3 ausfällt. 



   Beispiel 2 : Zur Abscheidung von Tetracyclin aus der   Gärbrühe wird   diese mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 bis 2,5 eingestellt und filtriert. Das klare, Tetracyclin enthaltende Filtrat wird danach mit Natronlauge oder Ammoniak auf einen pH-Wert von 9,0 bis   10,   0 eingestellt, wobei die endgültige Einstellung zweckmässig mit Natriumcarbonat erfolgt, wodurch etwa vorhandene Calciumionen als Calciumcarbonat, welches das ebenfalls ausgefällte Tetracyclin adsorbiert, abgeschieden werden. Das ausgefällte Rohtetracyclin hat eine Wirksamkeit von mindestens 200   gg   je mg. Es wird abfiltriert und nach einer der nachstehend angegebenen Methoden gereinigt. 



   So wird z. B. Rohtetracyclin in wässeriger    Salpetersäurelösung   bei einem pH-Wert von 2, 0 gelöst und der Lösung Natriumnitrat hinzugesetzt ; aus der sauren Lösung wird Tetracyclin mit n-Butanol extrahiert. 



  Die Butanollösung wird von der wässerigen Schicht abgetrennt und neutralisiert, wobei Tetracyclin als Base   ausfällt,  
Das Rohprodukt kann auch direkt in n-Butanol suspendiert, durch Zusatz von Salzsäure in das Hydrochlorid übergeführt und   beim Eindampfen der Butanollösung   als reines Tetracyclinhydrochlorid abgeschieden werden. 



   Nach einem andern einfachen Verfahren wird das Rohprodukt direkt in verdünnter Schwefelsäure suspendiert, die Lösung filtriert und das Filtrat durch Zusatz einer Base auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, wobei festes, gereinigtes Tetracyclin ausfällt. 



   Das saure Gärfiltratoder das alkalische Filtrat, das bei der Ausfällung des Tetracyclins anfällt, lassen sich ebenso wie das nach Beispiel 1 erhaltene Filtrat vorteilhaft als Viehfutter oder Zusatz zu Viehfutter verwenden. 



   Kristallisiertes Tetracyclin wird erhalten, wenn eine filtrierte Lösung von 100'g Rohtetracyclin in 1   l   verdünnter Schwefelsäure vom pH-Wert 1, 5 mit   10 - 50   g Aktivkohle, gegebenenfalls unter Zusatz von ungefähr 10 g Äthylendiamin-Tetraessigsäure oder anderer mit Calcium Komplexverbindungen bildender Mittel, z. B. Zitronensäure, Weinsäure, Natriumphytat, Gluconsäure, Natriummetaphosphat (s. auch "Journal Chemical Education", Band 25 [1948], S. 482 - 488) behandelt wird. Der pH-Wert der filtrierten wässerigen Lösung wird dann z. B. mit Ammoniak auf einen pH-Wert von ungefähr 3,5 eingestellt. Beim Stehenlassen kristallisiert reine Tetracyclinbase aus, die abfiltriert wird. 



   Weitere Mengen an weniger reinem Tetracyclin, das zur erneuten Reinigung wieder in den Kreislauf zurückgeführt wird, werden aus dem zuletzt erhaltenen Filtrat durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6,0 ausgefällt. 



   Die Überführung der Tetracyclinbase in kristallisierte Säuresalze erfolgt in an sich bekannter Weise durch Neutralisation mit Säuren, gegebenenfalls in Gegenwart organischer Lösungsmittel. So erhält man 
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   Man kann auch die Gesamtmenge an Butanol auf einmal hinzugeben. Das zunächst aufgelöste Tetracycli. 1 kristallisiert dann spontan als Tetracyclinhydrochlorid aus. lu ähnlicher Weise erhält man Tetracyclinformiat, indem man 10,0 g (0,0225 Mol) wasserfreies Tetracyclin in 100   cn   n-Propanol und 1, 1 g (0, 0244 Mol)   980/0iger Ameisensäure   wenige Minuten auf 50 bis   55 C   erhitzt und dann abkühlt. Dabei setzt reichliche kristalline Ausfällung ein. Man lässt die Mischung 15 h lang bei 0-50C stehen und filtriert die Kristalle ab. Das gebildete kristalline gelbe Tetra-   cyclinformiat   wird erst mit n-Propanol und dann mit wasserfreiem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute : 9,8 g entsprechend 89% d. Th.

   Schmelzpunkt : 176, 5-177, 0 C (sintert bei 1730C). 
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<tb> C <SEP> H, <SEP> N <SEP> 0. <SEP> HCOOH <SEP> :Berechnet <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 56, <SEP> 3% <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 35%
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 56, <SEP> 60/0 <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 59%.
<tb> 
 



   Beim Trocknen im Vakuum bei 600C tritt kein Wasserverlust ein. 



   Wie bereits angegeben, kann man Rohtetracyclin von dem bei der Fermentation gleichfalls gebildeten Chlortetracyclin trennen. Dies gelingt z. B. durch Aufschlämmen der freien Base in Methanol, wobei die Chlortetracyclinbase nicht in Lösung geht, während man die gelöste Tetracyclinbase in gereinigter Form aus der Methanollösung durch Verdampfung des Lösungsmittels oder durch Eingiessen der Methanollösung in Wasser gewinnen kann. 



   Rohtetracyclin kann ferner vom Chlortetracyclin befreit werden, indem man es in einer wässerigen Säurelösung bei einem pH-Wert von ungefähr 2, 5 suspendiert. Dabei wird nur das Chlortetracyclin gelöst. 



  Eine zweckmässige Ausführungsform dieses Reinigungsverfahrens besteht darin, die rohe Tetracyclinbase oder ihre Salze, z. B. ihr Hydrochlorid, in verdünnter Salzsäure bei einem pH-Wert von 1, 5 oder darunter 
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 erreichen. Durch einfache Vorversuche können die geeigneten Konzentrationen und die notwendige Lösungsdauer leicht ermittelt werden. Die gereinigte, feste Tetracyclinbase, die dabei ungelöst zurückbleibt, wird durch Filtration von der Lösung abgetrennt. 



   Besonders günstige Ergebnisse werden beim Arbeiten unter Stickstoff   erzielt: 92%   der Tetracyclinbase mit einem Gehalt von 0 bis   30/0   Chlortetracyclin und einer Wirksamkeit von 929   lig   je mg werden bei dieser Arbeitsweise zurückgewonnen. 



   Zu ähnlichen Ergebnissen gelangt man, wenn man Rohtetracyclin in einer wässerigen Lösung einer Base bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,0 suspendiert. Dabei geht nur das Chlortetracyclin in Lösung. 



   Schliesslich kann Rohtetracyclin von seinem Gehalt an Chlortetracyclin und Oxytetracyclin befreit werden, indem man seine wässerige Lösung bei einem pH-Wert von etwa 8,0 aufbewahrt, bis das unbeständige Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin zersetzt ist. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin aus aeroben, insbesondere submersen Kulturen von Streptomyces viridifaciens oder dessen Tetracyclin erzeugenden Varianten oder Mutanten in einem üblichen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man die   Gärbrühe,   gegebenenfalls nach Abscheidung des Mycels durch   Ansäuern   auf einen pH-Wert unter 3,0 und Filtration durch Zusatz starker Basen, insbesondere Ammoniak oder Natriumhydroxyd, auf einen pH-Wert zwischen 8 und   11,   vorzugsweise zwischen 9 und 10, einstellt und das dadurch ausgefällte Tetracyclin bzw. Tetracyclin enthaltende Produkt gegebenenfalls einer weiteren Reinigung in an sich bekannter Weise unterwirft.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das aus der Gärbrühe durch unmittelbare Alkalisierung abgeschiedene Gemisch von Tetracyclin und Mycel mit einer verdünnten wässerigen Säurelösung bei einem pH-Wert unter 3,0 extrahiert und aus dem Filtrat Tetracyclin durch Einstellung auf einen pH-Wert zwischen 4 und 10 ausfällt.