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Verfahren zur Rückgewinnung eines Tetracyclin-Antibiotikums
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Wenn in dieser Formel R eine OH-Gruppe und R Wasserstoff ist, so ist die Verbindung Oxytetracyclin. Wenn R Wasserstoff und il Chlor ist, so handelt es sich um Chlortetracyclin. Sind R undR Was- serstoff, so entspricht die Formel dem Tetracyclin. Diese Verbindungen haben vielfach ganz ähnliche biologische und physikalische Eigenschaften, sie zeigen aber auch einige individuelle Unterschiede.
Die Tetracyclin-Antibiotika werden häufig durch Fermentation hergestellt. Dabei entstehen verdünnte, wässerige Lösungen, die mit verschiedenen organischen und anorganischen Stoffen stark verunreinigt sind. Für die Gewinnung pharmazeutisch brauchbarer Präparate müssen die Antibiotika von diesen Verunreinigungen abgetrennt werden. Selbst wenn die Tetracyclin-Antibiotika als Tierfutterzusatz od. dgl. verwendet werden sollen, ist es häufig erwünscht, sie wenigstens von einem Teil der Verunreinigungen zu befreien.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht nun im wesentlichen darin, dass die mehrwertige Metallionen, wie insbesondere Ca-, Mg-, Zn- und Fe-Ionen, enthaltende Fermentationsbrühe oder die mit diesen Ionen versetzte wässerige Lösung mit einem wenigstens 8 Kohlenstoffatome enthaltenden Amin versetzt wird, wobei sich ein pH-Wert von wenigstens etwa 5,5 ergibt, worauf der gebildete, Metallionen, die organische Base und das Tetracyclin-Antibiotikum enthaltende komplexe Niederschlag abgetrennt und gegebenenfalls weiterverarbeitet wird.
Die Ausfällung des Tetracyclin-Antibiotikums in Form eines begrenzt wasserlöslichen Produktes wird iomit durch Behandlung seiner wässerigen Lösung mit organischen Basen erreicht, die wenigstens etwas in Wasser löslich sind. Durch die Anwesenheit mehrwertiger Metallionen in der wässerigen Lösung des Anti- biotikums wird dessen weitgehende Ausfällung wesentlich gefördert.
Der ausgefällte, Tetracyclin-Antibiotikum, organische Base und mehrwertige Metallionen enthal- : ende Komplex kann als solcher für verschiedene Zwecke gebraucht werden, z. B. als ruttermittelzusatz, als Therapeutikum, als industrielles Bakterizid, als Pflanzenbakterizid usw.
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Das Tetracyclin-Antibiotikum kann aber auch durch verschiedene Methoden aus dem ausgefällten Komplex regeneriert werden. Dieses regenerierte Antibiotikum kann als amphotere-Verbindung oder als Salz einer Säure, z. B. als Hydrochlorid, erhalten werden. In besonders einfacher Weise wird das gefällte Produkt in einem Lösungsmittel mit einer starken Säure, vorzugsweise einer Mineralsäure, behandelt.
Das amphotere Tetracyclin-Antibiotikum kann aus der so erhaltenen Lösung ausgefällt werden. Als Lösungsmittel besonders brauchbar sind niedere, aliphatische Alkohole, z. B. Methanol oder Äthanol, und niedere Ketone, z. B. Aceton. Nach einem andern Weg zur Rückgewinnung des Antibiotikums wird der mit der organischen Base gebildete Komplex in einem niederen, aliphatischen Alkohol mit Salzsäure oder Calciumchlorid behandelt, um das gefällte Produkt wieder in Lösung zu bringen. Diese Lösung kann dann durch Zusatz entfärbend wirkender Absorptionsmittel geklärt werden. Bei weiterem Zusatz von Salzsäure scheidet sich ein sehr reines, gewöhnlich kristallisiertes Säuresalz des Tetracyclin-Antibiotikums aus.
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enthalten bereits polyvalente Metallionen als Verunreinigungen, die aus dem Nährmedium stammen.
Zu solchen Brühen wird ein organisches Amin zugesetzt, welches zur Unterstützung der Reaktion wenigstens teilweise in der Brühe löslich sein soll. Die Brtihe ist zweckmässig alkalisch oder sie wird auf einem zwi- schen neutral und basisch liegenden PH-Wert gehalten. Der entstehende Niederschlag wird abgetrennt. Es wird ein komplexes Salz des Tetracyclin-Antibiotikums gewonnen, das sowohl Metallkomponenten als auch die zugesetzte organische Base enthält und eine Tetracyclin-Antibiotikum-Aktivität von etwa 300 bis 500 y/mg zeigt. Auf diese Weise wird also das Antibiotikum in einem einstufigen Verfahren konzentriert und gereinigt. Das Komplexsalz kann zur Rückgewinnung des reinen Tetracyclin-Antibiotikums oder seines einfachen Säuresalzes leicht zerlegt werden.
Es kann aber auch therapeutisch oder für Fütte- rungszwecke direkt verwendet werden.
Wie bereits erwähnt wurde, werden die komplexen metallorganischen Salze für die Regenerierung des Tetracyclin-Antibiotikums, zweckmässig nach Entfernung überschüssiger Feuchtigkeit, in niederen Alkoholen und Ketonen gelöst. Für diesen Vorgang ist Methanol das zweckmässigste Lösungsmittel, weil es billig ist, leicht zurückgewonnen werden kann und zu einem sehr reinen Produkt führt. Im allgemeinen wird eine Lösung hergestellt, die etwa 4 - 8 I Methanol je kg Tetracyclin-Antibiotikum-Aktivität besitzt. Diese Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure behandelt. Dabei kann, noch bevor sich das Hydrochlorid gebildet hat, freies amphoteres Antibiotikum ausfallen. Ein weiterer Säurezusatz löst zwar den grössten Teil davon wieder auf, aber ein kleiner Rückstand kann doch bleiben.
Um auch diese Verlustquelle auszuschalten, wird zweckmässig beim Zusatz des getrockneten Organbase-Tetracyclin-Antibioti- kums zum Methylalkohol der pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäure dauernd auf etwa 2-2, 5 gehalten. Auf diese Weise wird eine klare Lösung erhalten. Calciumchlorid kann ebenfalls dazu verwendet werden, die Löslichkeit des Antibiotikumkomplexes in Methanol zu erhöhen und eine vorzeitige Ausscheidung zu verhindern. Ein Zusatz konzentrierter Säure, z. B. einer weiteren Menge Salzsäure, zu der einmal hergestellten Lösung bewirkt die Bildung des einfachen Säuresalzes des Tetracyclin-Antibiotikums.
Wird Salzsäure zur Unterstützung der Auflösung des Komplexsalzes verwendet, so sind davon etwa 0, 4 bis 0,'7cm3 (konzentrierte, 36% ige Säure) erforderlich, um die Komplexverbindung in einer Menge zu lö- sen, die 1 g Tetracyclin-Antibiotikum-Aktivität entspricht. Auf diese Weise werden Lösungen mit einer Stärke von 60 000 bis 150 000 y Tetracyclin-Antibiotikum je ems oder noch höher hergestellt. Diese klare Lösung kann mit einem Adsorbens, z. B. mit entfärbend wirkender Kohle, behandelt werden, um verschiedene Verunreinigungen zu entfernen.
Je Gramm Tetracyclin-Antibiotikum-Aktivität in der Lösung werden gewöhnlich etwa 0, 5 - 1, 5 g Kohle verwendet, wobei eine grössere Menge Kohle zu einem reineren Produkt führt, ohne dass grössere Verluste durch Adsorption des Antibiotikums eintreten. Das Adsorptionsmittel wird nach Zusatz einer Filtrierhilfe abfiltriert und der Filterrückstand mit angesäuertem Lösungsmittel ausgewaschen, um zurückgehaltenes Material zu entfernen.
Aus der klaren Lösung kann durch Zusatz einer Säure, z. B. von konzentrierter Salzsäure, ein kristallisiertes Salz des Tetracyclin-Antibiotikums, z. B. das Hydrochlorid, in guter Qualität gewonnen werden. Das Säuresalz, z. B. das Hydrochlorid, kristallisiert aus der Lösung aus ; diese kann vor der Kristallisation eingeengt werden. Im allgemeinen sind wenigstens etwa 200 cm3 konzentrierte Salzsäure je kg in der Lösung vorhandenes Antibiotikum erforderlich. Etwas grössere Säuremengen können die Kristallausbeute verbessern.
Es werden daher vorzugsweise 0, 95 l Säure je kg Tetracyclin-Antibiotikum-Akti-
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Auskristallisieren der Säuresalzeenthält zumindest so viel polyvalente Metallionen, dass bei Zusatz einer geeigneten organischen Base zur filtrierten Brühe und Einstellung eines im alkalischen Bereich liegenden pH-Wertes die Ausfällung sicher eintritt. Häufig enthält die Brühe sogar mehr Metallionen, als notwendig ist. In diesem Falle kann der Überschuss vorerst entfernt werden, z.
B. durch die in der USA-Patentschrift Nr. 2, 658, 078 beschriebene
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sind schwach ionisierte, hydroxylierte saure Verbindungen, wie Zitronensäure, Gluconsäure, Natriumtetraphosphat usw., und Aminosäuren, wie Äthylendiamin-Tetraessigsäure und Salze von Polyaminocar- oonsäuren, z. B. das unter der Bezeichnung"Perma-Kleers"im Handel befindliche Produkt. Wenn die
Tetracyclin-Antibiotikum-Brühe nicht genügend Metallionen enthält, so können Eisen, Zink, Magnesium u. dgl. zugesetzt werden, um die Ausfällung zu begünstigen. Solche Zusätze müssen selbstverständlich bei der Behandlung wässeriger Tetracyclin-Antfbiotikalösungen gegeben werden, die von keiner Brühe stammen bzw. keinen natürlichen Metallgehalt aufweisen.
Die verschiedenen organischen Basen sprechen erwartungsgemäss verschieden an. Die Menge des Antibiotikums in den gefällten Salzen ist also für verschiedene Fällungsmittel verschieden. Die Zusammensetzung der Niederschläge variiert auch einigermassen mit dem pH-Wert.
Obwohl mit Lösungen oder Brtihen gearbeitet werden kann, die eine antibiotische Aktivität von 500 (/1 oder niedriger besitzen, ist es zweckmässig, von Lösungen bzw. Brühen etwas höherer Aktivität auszugehen, um gute Ausbeuten zu erhalten. Gewöhnlich wird im Niederschlag nur ein Bruchteil des Amins gefunden. Es muss davon ein Überschuss angewendet werden, um das Antibiotikum möglichst weitgehend zurückzugewinnen. Zumeist ist ein etwas über dreifach molar liegender Überschuss zweckentsprechend.
Bei der Gewinnung des reinen Tetracyclin-Antibiotikums oder seiner einfachen Salze, wie Tetracyclin-Hydrochlorid aus Lösungen der metallo-organischen Komplexe, bleiben die organische Base und ein Teil des Antibiotikums selbst in der Mutterlauge und gehen so verloren. Es kann erwünscht sein, auch dieses Material zurückzugewinnen und wieder nutzbar zu machen. Wenn z. B. die Mutterlauge wieder in den Prozess zurückgeführt wird, indem man sie der zur Behandlung nächstfolgenden Lösung oder Brühe zusetzt, so kann die erforderliche Menge organischer Base wesentlich geringer sein, ohne dass die Ausbeute merklich kleiner wird. Das Lösungsmittel der Mutterlauge kann vor ihrem Zusatz zur nächstfolgenden Brühe ganz oder teilweise entfernt werden, jedoch ist dies nicht wesentlich.
In der Mutterlauge können gewisse gefärbte Verbindungen verbleiben, die ein etwas dünkleres Salz des Tetracyclin-Antibioti- kums ergeben. Wenn die Mutterlauge immer wieder zurückgeführt wird, so stört nach einiger Zeit die zunehmende Dunkelfärbung des Produktes und die Ausbeute kann abnehmen. Immerhin ist eine etwa fünfmalige Rückführung der Mutterlauge durchaus möglich und beeinträchtigt die Qualität des Produktes nicht.
Das Verfahren gemäss der Erfindung bietet eine Reihe von Vorteilen. Es ist billig, die Reagenzien sind leicht beschaffbar und nur wenig giftig, es wird ein kristallines Salz hoher Qualität aus sehr verdünnten und/oder rohen Tetracyclin-Antibiotika-Lösungen gewonnen, das Verfahren umschliesst nur wenige Arbeitsstufen und gibt gute Ausbeuten an Antibiotikum.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Verfahrens gemäss der Erfindung, ohne dass dieses auf die gegebenen Beispiele beschränkt wäre.
Beispiel 1 : Eine geklärte Oxytetracyclin-Fermentationsbrühe wird je Liter mit 5 g Zitronensäure versetzt. Je 1 l dieser Brühe wird mit 5, 0 g-Portionen (5 cm3 Flüssigkeit) der in der folgenden Tabelle angeführten Reagenzien behandelt. In jedem Falle wird die Lösung dann durch Zusatz von verdünntem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8, 5 bis 9, 0 gebracht. Die Oxytetracyclin enthaltenden Fällungen werden unter Zusatz einer kleinen Menge Filtrierhilfe durch Filtrieren abgetrennt. Die einzelnen Filtrate werden mit Hilfe einer biologischen Standardmethode auf noch vorhandenes Antibiotikum geprüft.
In der folgenden Tabelle sind die Reagenzien und fallweise (in Klammer) ihre Handelsnamen angegeben und ferner die aus der Fermentationsbrühe ausgeschiedene Menge Oxytetracyclin in Prozenten.
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<tb>
<tb>
Reagenz <SEP> % <SEP> Oxytetracyclin, <SEP> aus
<tb> der <SEP> FermentationsbrUhe
<tb> ausgeschieden.
<tb>
Decylamin <SEP> 93%
<tb> Nonylamin <SEP> 78%
<tb> Octylamin <SEP> 90%
<tb> Heterocyclisches, <SEP> alkylsubstituiertes,
<tb> tertiäres <SEP> Amin <SEP> mit <SEP> hohem <SEP> Molekulargewicht <SEP> (Amine-0 <SEP> *) <SEP> 96% <SEP>
<tb> Heterocyclisches <SEP> alkylsubstituiertes
<tb> tertiäres <SEP> Amin <SEP> mit <SEP> hohem <SEP> Molekulargewicht <SEP> (Amine-C <SEP> *) <SEP> 88% <SEP>
<tb>
* Handelsname des käuflichen Produktes.
Bei s pie I 2 : Aus Streptomyces aureofaciens wird in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen eine Chlortetracyclin-Fermentationsbrühe erzeugt. Die Brühe wird filtriert und für die Ausfällung von Chlortetracyclin dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unterworfen. Das schliesslich isolierte, gereinigte, feste Produkt kann auf Grund seiner charakteristischen Eigenschaften als Chlortetracyclin identifiziert werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Rückgewinnung eines Tetracyclin-Antibiotikums wie Tetracyclin, Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin aus seiner Fermentationsbruhe oder aus einer sonstigen verdünnten wässerigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrwertige Metallionen, wie insbesondere Ca-, Mg-, Zn- und FeIonen, enthaltende Fermentationsbrühe oder die mit diesen Ionen versetzte wässerige Lösung mit einem wenigstens 8 Kohlenstoffatome enthaltenden Amin versetzt wird, wobei sich ein pH-Wert von wenigstens etwa 5, 5 ergibt, worauf der gebildete, Metallionen, die organische Base und das Tetracyclin-Antibioti- kum enthaltende komplexe Niederschlag abgetrennt und gegebenenfalls weiterverarbeitet wird.