DE2418088B2 - Verfahren zur abtrennung von cephalosporin c aus seinen waessrigen loesungen in form von urethan-derivaten - Google Patents
Verfahren zur abtrennung von cephalosporin c aus seinen waessrigen loesungen in form von urethan-derivatenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C in Form von Urethan-Derivaten in
verbessertei" Ausbeute aus wäßrigen Lösungen, insbesondere
einer Cephalosporin C enthaltenden Gürbrühe oder deren Filtrat.
Es ist bekannt, daß das Cephalosporin C ein wertvolles Antibiotikum ist, welches sich als Rohmaterial
für die Herstellung anderer Cephem-Derivate eignet; es läßt sich gewinnen durch Züchtung eines
Mikroorganismus Cephalosporin acrcmonium in
einem flüssigen Kulturmedium und anschließende Abtrennung des Antibiotikums aus der es enthaltenden
Gärbrühe. In der so gewonnenen Gürbrühe ist das Cephalosporin C normalerweise nur in sehr geringen
Konzentrationen in einer Größenordnung von etwa 0.2 bis etwa 0,5 Gew.-°/o enthalten.
Die Abtrennung von Cephalosporin C aus der Gärbriihe wurde bisher auf verschiedene Weise
vorgenommen; alle bisher bekannten Methoden zur Abtrennung des Cephalosporin C aus seinen wäßrigen
Lösung'.'ii, /.. 15. dem Gärbriihenfiltrut, erbrachten nur
Ausbeuten, die für technische Produktionsmethoden unzureichend waren. Dies ist hauptsächlich ilarauf
zurückzuführen, daß das Cephalosporin C eine amphotcre Verbindung ist, welche eine freie Aminogruppe und
zwei freie Carboxylgruppen im Molekül enthält, so daß es in der Praxis außerordentlich schwierig ist, eine
Adsorption des Cephalosporin C-Moleküls aus der wäßrigen Lösung (Gürbriihe) an einem lonenaustaiischei'li.irz
zu erreichen und das Cephalosporin C-MoIekiil
na Ii der Adsorption aus dem lonenaustausiherhar/
IK)OC CU (CILi1C(INlI
/.. eluieren. Darüber hinaus ist Cephalosporin C kaum in
üblichen organischen Lösungsmittel.-, löslich, während
es andererseits infolge seiner amphoteren Natur in
Wasser löslich ist. Infolgedessen läßt sich Cephalosporin
C itis der Gärbrühe nur in extrem niedrigen Ausbeulen
gewinnen, wenn man eine Extraktion der Gärbrühe mit einem organischen Lösungsmittel vornimmt. Man hat
daher bisher die Gewinnung des Cephalosporin C aus
der Gärbrühe im allgemeinen durch Behandlung der letzteren mit einer großen Menge eines Absorptionsmittel*
wie Aktivkohle, einem Anionenaustauscherharz, einem Kationenaustauscherharz oder Aluminiumoxid
vorgenommen. Anschließend wurde das Cephalosporin C welches von dem Adsorptionsmittel adsorbiert
worden ist, mit Hilfe großer Mengen wäßrigen Acetons oder wäßrigen Methanols eluiert. Diese bekannte
Adsorptions-Eluieningsmethodc ist wenig vorte.lhafi
weil sie eine sehr große Menge an Adsorptionsmittel und/oder sehr große Mengen an wäßrigem organischem
Lösungsmittel erfordert und weil sie das Cephalosporin C nur in sehr geringen Mengen ,eiern
kann die im besten Fall bei etwa 40 bis 50% hegen, bezogen auf die ursprünglich in der Garbruhe
enthaltene Cephalosporin-C-Menge.
Es ist auch schon beschrieben worden, das in der Gärbrühe vorhandene Cephalosporin C mit 2,4,6-Tnnitrobenzolsulfonsäure.
einem niederen Alkoxycarbonvlchlorid, einem Aralkoxycarbonylchlor.d, lsobornyloxvcarbonylchlorid.
einem cycloaliphatisch Alkoxy-, carbonylchlorid, Benzoylchlorid, einem Aryl.socyanat
oder Arylisothiocyanat zu behandeln, so daß sich ein
Urethanderivat des Cephalosporins C bildet, welches in
einem organischen Lösungsmittel löslich ist Anschließend
wird das Urethanderivat mit Hilfe eines -, organischen Lösungsmittels aus der Gärbrühe extrahiert
(vergleiche z. B. deutsche Offenlegungsschriften
19 33 187 und 22 08 631 sowie die Vorveröffenthchuneen
der japanischen Patentanmeldungen 16 692/72,
20 189/72 10 077/73 und 68 595/73). Die gemäß den in
„ den vorstehend genannten Veröffentlichungen beschriebenen Methoden hergestellten Urethanderivate
besitzen jedoch ebenfalls keine sehr hohe Löslichkeit in
organischen Lösungsmitteln und erlauben nur eine Abtrennung des Cephalosporins C in einer Menge von
,, höchstens etwa 60 %. bezogen auf den ursprünglichen
Gehalt an Cephalosporin C in der Gärbrühe.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Weg zu finden, auf welchem das Cephalosporin C aus
der Gärbrühe oder ganz allgemein aus seinen wäßrigen .„ 1 ösungen in technisch befriedigender Weise abgetrennt
werden kann, d.h. in einer wirtschaftlichen und einfachen Weise, bei welcher das Cephalosporin C
außerdem in höheren Ausbeuten anfällt.
Die gestellte Aufgabe wird erl'indungsgemaß gelost ,, durch das im Patentanspruch angegebene Verfahren.
Das gebildete Reaktionsprodukt der allgemeinen Formel
NIIC
OCII CII R1
ClI,OC OCH,
R' cm Chlor- oder llromalom oiler eine
Alkoxygruppe mit 1 bi*. 4 Kohlenstoffatomen
oder eine Phenoxygnippe,
C< K Mi
,. K-'und R' Wasscrsiofl'atoine. I lalogcnalonn- oder
Meihylgruppen
bedeuten, wird aus der wäßrigen Lösung (lurch
Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, ζ. U.
»inem Ester, einem Keton oder einem Alkohol, insbesondere Methylisobulylkcton oder n-Buianol gewonnen.
In dem substituierten Alkoxycarbonyl-Cepv
losporin C der allgemeinen Formel (1) ist , Aminogruppe durch den Acylrest
— CO — O —CH-CH-R1
R1 R2
R1 R2
blockiert, so daß das substituierte Cephalosporin C stärker lipophil ist als das Cephalosporin C selbst, was
dazu führt, daß das Cephem-Derivat der allgemeinen Formel (I) eine höhere Löslichkeit in organischen
Lösungsmitteln aufweist und infolgedessen aus seinen wäßrigen Lösungen besser mit Hilfe eines organischen
Lösungsmittels, in welchem das Cephem-Derivat der allgemeinen Formel (1) löslich ist, welches aber mit
Wasser nicht mischbar ist, extrahierbar ist. Weiterhin konnte gefunden werden, daß das Cephem-Derivat der
allgemeinen Formel (I) aus seinen wäßrigen Lösungen leicht zur Adsorption an einem Anionenaustauscherharz
oder an Cellulose-Gel gebracht werden kann, so
daß auch eine Isolierung aus der wäßrigen Lösung mit Hilfe einer Adsorptionsmethode möglich ist. Die
Isolierung und Reinigung des Cephem-Derivates der allgemeinen Formel (1) kann also leicht in wirksamer
Weise erreicht werden, so daß dieses Cephem-Derivat ein wertvolles Mittel darstellt, mit dessen Hilfe die
Gewinnung von Cephalosporin C aus seinen wäßrigen Lösungen ermöglicht werden kann.
Beispiele für geeignete Chloroformiatdcrivate der allgemeinen Formel (2), d. h. für substituierte Alkoxycarbonylchloride,
sind:
2-Methoxy-äthoxy-, 2-Äthoxy-äthoxy-,
2-Propoxyäthoxy-, 2-lsopropoxyäthoxy-,
2-n-Butoxyäthoxyy-,2-lsobutoxyäthoxy-,
2-sek.-Butoxyäthoxy-,2-tert.-Butoxyäthoxy-,
T-Methoxypropoxy-^-Äthoxypropoxy-,
2-Propoxyäthoxy-, 2-lsopropoxyäthoxy-,
2-n-Butoxyäthoxyy-,2-lsobutoxyäthoxy-,
2-sek.-Butoxyäthoxy-,2-tert.-Butoxyäthoxy-,
T-Methoxypropoxy-^-Äthoxypropoxy-,
yPpyyPpy
2-sek.-Butoxypropoxy-,2-tert.-Butoxypropoxy-,
2-Phenoxyäthoxy-, 2-Chloräthoxy- und
2-Bromäthoxycarbonylchlorid.
2-sek.-Butoxypropoxy-,2-tert.-Butoxypropoxy-,
2-Phenoxyäthoxy-, 2-Chloräthoxy- und
2-Bromäthoxycarbonylchlorid.
Es wurde gefunden, daß die Verbindung der allgemeinen Formel (1) in hoher Ausbeute erzeugt und auch mit
hoher Ausbeute aus der wäßrigen Reaktionslösung extrahiert werden kanu, wobei die F.xtraktionsausbeutc
bei wenigstens 72 % liegt. Ionenaustauscherharze, die für eine Abtrennung mittels Adsorption geeignet sind,
sind beispielsweise Anioneiiaustauscherharze mit vernetziem
Polystyrolgerüst, welches quaternäre Ammoniumgruppen
aufweist, sowie Produkte, die in einem Polyalkylenamingerüst tertiäre und qualernäre Aminogruppen
enthalten. Geeignete Adsorber, die außerdem verwendet werden können, sind die wasserlöslichen
Hydrochloride der Diäthylaminoälhyläther von Dextraiien
sowie Diälhylaniinoiitlwlcelliilose. Die Verbindung tier allgemeinen Formel (I), die von einem solchen
Anioiienauslausclierhaiv. adsorbiert worden ist , kann
isoliert werden, indem man das Harz mil einer gepufferten Lösung von Natriumchlorid und Chlorwas
sersloll in Wasser mit einem ρί! Wer! von 3,0 eluiert.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (1). die aiii diese Wo im.· adsorbiert worden ist, kann durch Linieren
mit einer wäßrigen Natriiimchloi id-Lösung abgetrennt
Die vorstehend beschriebene Methode zur Herstellung eines Cephem-Derivates der allgemeinen Formel
(l)kann wie folgt durchgeführt werden:
Eine Gärbrühe, die man durch Züchten eines Cephalosporin C erzeugenden Stammes wie Cephulosporium
acremonium (vergleiche japanisches Patent Nr. 190/1960) gewonnen hat, wird filtriert und das so
gewonnene ßrühenfiltrat wird mit Aceton, Acetonitril oder Tetrahydrofuran vermischt. Anschließend wird
eine Lösung eines substituierten Alkoxyearbonylchlorides der allgemeinen Formel (2) in trockenem Aceton,
Acetonitril oder Tetrahydrofuran unter Rühren zu dem Brühenfiltrat gegeben. Die Mischung wird vorzugsweise
bei einer Reaktionstemperatur von O bis 30 C 1 bis 5 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wird dann unter
weiterem Rühren fongesetzt, wobei man eine alkalische
Lösung (/. B. wäßriges Natriumhydroxid oder eine wäßrige Natriumphosphatlösung) zusetzt, um den
pH-Wert der Reakiionslösung bei 8,0 bis 8,r>
zu hallen. Das Reaktionsgemisch wird dann eine weitere Stunde bei einer Temperatur von O bis 3O0C bei einem pH-Wert
von 8,0 bis 8,5 gerührt. Anschließend wird eine Mineralsäure oder eine organische Sulfonsäure wie
p-Toluolsulfonsäure zugesetzt, um den pH-Wert der
Reaktionslösung auf 4,0 bis 7,0 einzustellen; das Aceton wird durch Destillieren unter vermindertem Druck
anschließend entfernt. Als nächstes wird ein geeignetes, nichtsaures anorganisches Salz wie Natriumchlorid in
das entstandene Konzentrat gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Mineralsäure (z. Ii.
Phosphorsäure) einer organischen Säure (/.. B. Zitronensäure) oder einer organischen Sulfonsäure (/.. IV
Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure oder Naphthalinsulfonsäure)
auf 2,0 gehalten wird. Anschließend wird das Reaktionsprodukt aus der konzentrierten Lösung
mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, welches mil Wasser nicht mischbar ist und in dem die Verbindung
der allgemeinen Formel (1) löslich ist, extrahiert. Beispiele für organische Lösungsmittel, die für eine
Extraktion geeignet sind, sind Ester, Ketone und Alkohole, insbesondere Methyläthylkcton, Meihylisobutylketon,
Me:hylisopropylketon, Essigester und iiBu
tanol.
Der so gewonnene organische LösungsmitteleMiakt,
in welchen die Verbindung der allgemeinen Formel (I) aus dem Gärbrühenfiltrat überführt worden ist, wird
dann von der wäßrigen Phase der Brühe abgetrennt und mit einer Phosphatpuffer-Lösung mit pH 7 extrahiert,
so daß die Verbindung der allgemeinen Formel (1) wieder in die Phosphatpufler-I.ösung ubergeiühri wmi.
Diese Phosphatpuffer-Lösung, die die gewünschte Verbindung enthält, wird dann mil Äthylacetal gewä
sehen, um Verunreinigungen zu entfernen. Die verbleibende wäßrige Phosphatlösung, die die gewünschte
, Verbindung enthält, wird dann auf einen pi I-Wen von _'
eingestellt und weiter mit ·;ίηοιη geeigneten, nichlsauren
anorganischen Salz wie Natriumchlorid gesättigt und mehrmals mit Allylacetat extrahiert. Die voisieheiul
genannte Prozedur der I'Alraklion der Phor-phatpullcr
ι Lösung mil Allylacetat und die Sättigung der Pufferlösung mit dem Aussalzmiltel wird nochmals
wiederholt. Die schließlich gewonnenen AtInI.icetatex
Irakte, die die gew-i'inschie Verbindung der allgemeinen
Formel (I) einhalten, werden vereinij'i mn einer
, gesättigten Lösung eines nichts.mien .mm iv.m-u !ηίι
Salzes wie NaCI in Wasser gewaschen, über wasserhvi
ein Magnesiuinsuli.il getrocknet und dann im Vakuum
destilliert, um iKis Allylacetat zu eulleinen Die
verbleibende konzentrierte Lösung wird mit Petroläthcr
vermischt, so dull die Verbindung der allgemeinen
Formel (1) ausfällt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Cephalosporin
C aus seinen wäßrigen Lösungen in ausgezeichneten Ausbeuten von wenigstens 90 %, bezogen auf die
Gärbrühe oder das Filtrat derselbe, gewonnen, wenn man ein Chloroformiat-Dcrivat der allgemeinen Formel
(2), in welcher R1 ein Chlor- oder Bromatom oder eine niedere Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
insbesondere eine Butoxy- oder eine Phenoxygruppc bedeutet und R: und R1 Wasserstoffatome sind, mit
Cephalosporin C umsetzt und das entstandene Cephem-Dcrivat aus der Lösung durch Extraktion mit einem
organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Mcthyläthylkcton, Methylisopropyiketon, Methyiisobutylkeion
oder n-Butanol oder durch Adsorption an ein Anionenaustauscherharz,
welches Aminogruppen als funktionel-Ie, Anionen austauschende Gruppen enthält, abtrennt.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
in den Beispielen werden, insbesondere im Zusammenhang
mit den am Ende der Beispiele aufgeführten Analysenwerten der Einfachheit halber für sich stets
wiederholende Angaben Abkürzungen verwendet, und zwar folgende:
Uilraviolett-Absorptionsspektrum
= UV
= e*
= L*
= e*
= L*
Infrarot-Absorptionsspektrum
(unter Verwendung einer Kfir-Tablettc) = IR
Eine Gärbrühe. welche Cephalosporin C enthält und welche durch Züchtung eines Stammes von Cephalosporium
acremonium erhalten worden ist, wurde durch Zugabe von wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf einen
pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt und anschließend filtriert, um die Zellen zu entfernen.
Das auf diese Weise gewonnene Brülienfiltrat enthielt
Cephalosporin C in einer Menge von 2000 j'/ml.
10 Liter des Filtrates wurden dreimal mit je 3 Liter Äthylacetal gewaschen, um lösliche Fettanteile zu
entfernen. Anschließend wurden 1 Liter Aceton sowie 20%ige Natriumhydrogcnphosphatiösung zu dem wäßrigen
Brühcnfiltrat gegeben; letztere zur Eins'.ellung des
pH-Wertes auf 8 bis 8.5. Die entstandene Lösung (das l'iltrat) wurde .'ropfenweisc unter Rühren mit einer
Lösung versetzt, welche 26g 2-n-ßutoxyäthoxycarbonylchlorid
enthielt, welches in 0,5 I trockenem Aceton gelöst war. Die Zugabe erfolgte bei einer Temperatur
von 15 bis 25"C im Verlauf von 2 Stunden, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von
20%igein Natriumhydrogcnphosphat bei 8 bis 8,5
gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Lösung beständig eine weitere Stunde bei 15 bis
25' C und einem pH-Wert von 8 bis 8,5 gerührt.
Nach Abschluß der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch (die Reaktionsiösung) auf einen pH-Wert von
6,5 bis 7,0 eingestellt; Das Aceton wurde bei
Raumtemperatur im Vakuum abdestilliert. Die konzentrierte Lösung wurde mit einem Kilogramm Natriumchlorid
vermischt und anschließend mit einer wäßrigen lO'Voigcn Phosphorsiiurelösung auf einen pH-Wert von
2.0 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung nacheinander mit 1,5 Liter, 1 Liter und nochmals 1 Liter
n-Dutanol extrahiert; man erhielt auf diese Weise mehrere n-Butanolextrakte, in denen N-(2-n-Butoxyäthoxycarbonyl)-cepha!osporin
C gelöst war.
Die gewonnenen n-Butanolextrakte wurden vereinigt und ihrerseits dreimal mit je 0.6 I iter einer 0,2-m-Phosphatpufferlösung
mit einem p\^ von 6.0 extrahiert, um
das Cephalosporin C-Derivat in die Pho.sphatpufferiösung zu überführen, die anschließend mit 0,5 Liter
Äthylacetat gewaschen wurde. Die verbleibende wäßrige Phase (der wäßrige Phosphatpufferlösungsanteil)
wurde durch Zugabe von 10%igcr wäßriger Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2.0 eingestellt, mit
Natriumchlorid gesättigt und anschließend dreimal zunächst mit 0,5 Liter, dann mit 0,3 Liter und nochmals
mit 0,3 Liter Äthylacetat extrahiert. Die so gewonnenen Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit 0,5 Liter
einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet. Der getrocknete Athylacetatextrakt wurde im Vakuum destilliert, um das Äthylacetat zu entfernen.
Die konzentrierte Lösung wurde mit Petroläther vermischt, wodurch man 37,2 g des Rohproduktes von
N-(2-n-Butoxyäthoxycarbonyl)-cephalosporin C erhielt (66%ige Reinheil).
Die Abtrennungsausbeute der Cephalosporin C-Komponente betrug 91,2 %, berechnet auf der Basis
des Anfangsgehaltes an Cephalosporin C, der in dem Gärbrühenfiltrat vorhanden war.
10 g des rohen Cephalosporin C-Dcrivates (66%ige Reinheit) wurden in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung
wurde mit Natriumchlorid gesättigt und durch Zugabe von 10%iger Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,0
eingestellt. Die entstandene Lösung wurde dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte
wurden vereinigt und ihrerseits dreimal mit je 40 ml 0,2 m wäßriger Phosphalpufferlösung (bei einem
pH-Wert von 6,5) extrahiert.
Die erhaltenen Extrakte in der Phosphatpufferlösung wurden mit Natriumchlorid gesättigt, durch Zugabe von
10%iger wäßriger Phosphorsäure auf einen pH von 2.0 eingestellt und dann dreimal mit je 50 ml Äthyiacetat
extrahiert. Die entstandene Äthylacetatlösung wurde mit 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen,
anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich unter vermindertem Druck von
dem Lösungsmittel befreit. Das entstandene Konzentrat wurde mit einer Mischung aus Äther+Petroläther
versetzt, wodurch man einen Niederschlag von 6,4 g N-(2-n:Butoxyäthoxycarbonyl)-cephalosporin C-Monohydrat
(91 %ige Reinheit) erhielt.
Ein Silikagel-Dünnschichtchromatogramm (unter Verwendung von einem 1 : 2-Gemisch von Aceton-Methanol
als Entwicklungslösungsmiltcl) zeigte einen Fleck von N-(2-n-Buloxyäthoxycarbonyl)-cephalosporinCbeiR[
= 0,56.
Dieses Cephalosporin C-Derivat konnte durch Silikagel-Chromatographie weiter gereinigt werden,
wobei eine Mischung von Chloroform-Methanol im Verhältnis 9:1 als Entwicklungslösungsmittel verwendet
wurde.
Wurde die vorstehend beschriebene Arbeitsweise zur Extraktion des Cephalosporin C-Dcrivates mit Magnesiumsulfat
an Stelle von Natriumchlorid als Aussalzmittel wiederholt, so konnte das Cephalosporin C in einer
Ausbeute von 89,6 % gewonnen werden.
Das Cephalosporin C-Derivat wies folgende Charakteristika
auf:
F.: 76bis79°C
UV: L· = 263 Γημ und e* = 7500
IR: 1790 cm '
Elementaranalyse für C2jHiiNjOnS · HiO:
Berechnet: C47.82, H 6,10, N 7,27 o/o;
gefunden: C 47,56, H 5,97, N 7,12%.
gefunden: C 47,56, H 5,97, N 7,12%.
10 Liter eines wie in Beispiel 1 behandelten Brühenfiltrates wurden dreimal mit je 1 Liter Äthylacetat
gewaschen, um die löslichen Fettanteile zu entfernen. Das Filtrat wurde dann mit 3 Liter Aceton sowie mit
1 n-Natriumhydroxidlösung versetzt, um den pH-Wert auf 8 bis 8,5 einzustellen. Als nächstes wurde eine
Lösung aus 13,6 g 2-Methoxyäthoxy-carbonylchlorid in
0,5 1 trockenem Aceton tropfenweise unter Rühren zu dem Filtrat gegeben, und zwar bei 10 bis 20°C im
Verlauf von 2 Stunden, wobei der pH-Wert durch weitere Zugabe von 1 n-Natriumhydroxidlösung bei 8
bis 8,5 gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Filtrat weiterhin kontinuierlich eine Stunde
bei 10 bis 20° C und einem pH von 8 bis 8,5 gerührt, um die Umsetzung zu beenden.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Reaktionslösung auf 6,5 bis 7,0 eingestellt; das
Aceton wurde durch Destillation bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck entfernt. Anschließend
wurden 1 kg Natriumchlorid und 10%ige Phosphorsäurelösung zur Einstellung des pH-Wertes auf 2,0
zugegeben. Die entstandene Lösung wurde nacheinander mit 1,5 1, 11 und nochmals 1 1 n-Butanol extrahiert,
um das gewünschte Reaktionsprodukt abzuscheiden.
Die gewonnenen n-Butanolextrakte wurden ihrerseits dreimal mit je 0,6 1 0,2-m Phosphatpufferlösung
(pH = 6,5) extrahiert. Die das gewünschte Reaktionsprodukt enthaltende Phosphatpufferlösung wurde mit
0,5 1 Äthylacetat gewaschen. Die abgetrennte wäßrige Phase wurde mit Natriumchlorid gesättigt, mit 10%iger
Phosphorsäurelösung versetzt, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen, und nochmals nacheinander mit 0,5 1, 0,3 1
und nochmals 0,3 1 Äthylacetat extrahiert. Die entstandenen Lösungen (Extrakte) des Cephem-Derivates in
Äthylacetat wurden vereinigt; die Lösung wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen
und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel durch Destillation
unter vermindertem Druck entfernt. Der entstandene Rückstand wurde mit Petroläther behandelt, wobei man
25,3 g des rohen N-(2-Methoxyäthoxycarbonyl)-cephalosporin C (65%ige Reinheit) erhielt. Die Abtrennungsausbeute an Cephalosporin C betrug 73,2%, bezogen auf
die im Gärbrühenfiltrat ursprünglich vorhandene Menge.
10 g des rohen Cephalosporin C-Derivates (66% Reinheit) wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1
beschrieben behandelt, so daß man 6,1 g N-(2-Methoxyäthoxycarbonyl)-cephalosporin
C (Derivat 2) in 96%iger Reinheit erhielt.
Im DSC (im folgenden als Abkürzung für Dünnschichtchromatogramm
an Silikagel gebraucht) unter Verwendung einer 1 :2-Mischung von Aceton/Methanol
zum Entwickeln zeigte das Derivat 2 einen Fleck bei Rf von 0,50.
Wurde die vorstehend beschriebene Arbeitsweise mit Kaliumchlorid als Aussalzmittel wiederholt, so betrug
die Abtrennungsausbeute 75,8%, bezogen auf den Cephalosporin C-Gehalt im Gärbrühenfiltrat.
Analysendaten des Derivates 2:
UV: L* = 262 πιμ und e* = 7450
IR: 1790 cm'
UV: L* = 262 πιμ und e* = 7450
IR: 1790 cm'
in 101 eines Brühenfiltrates, welches in der im Beispiel 1
beschriebenen Weise erhalten worden war, wurde 3mal mit je 3 1 Äthylacetat gewaschen, dann mit 1 1 Aceton
vermischt und durch Zugabe von 1 n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8 bis 8,5 eingestellt. Zu
ι, der entstandenen Lösung wurde dann tropfenweise
unter Rühren eine Lösung von 29 g 2-Phenoxyäthoxycarbonylchlorid in 0,5 1 trockenem Aceton gegeben, und
zwar bei einer Temperatur von 10 bis 2O0C im Verlauf von etwa 2 Stunden, wobei der pH-Wert durch weitere
:i) Zugabe von 1 n-Natriumhydroxidlösung bei 8 bis 8,5
gehalten wurde.
Nach Beendigung der Zugabe des Chloridreagenz wurde die Mischung eine weitere Stunde bei der
gleichen Temperatur und dem gleichen pH-Wert
y, kontinuierlich gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung
wurde die Reaktionslösung durch Zugabe von 10%iger wäßriger Phosphorsäure auf pH 6,5 bis 7,0
eingestellt und das Aceton wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abdestilliert. Danach wurde
in 1 kg Natriumchlorid zugesetzt und der pH-Wert durch
Zugabe von 10%iger Phosphorsäurelösung auf 2,0 eingestellt. Die entstandene Mischung wurde nacheinander
mit 1,5 1,1 1 und nochmals 11 n-Butanol extrahiert.
Der n-Butanolextrakt, der die Cephemverbindung
ji enthielt, wurde seinerseits 3mal mit je 0,6 1 einer 0,2-m
Phosphatpufferlösung (pH 6,5) extrahiert. Die wäßrige Phase der Phosphatpufferlösung wurde mit 0,51
Äthylacetat gewaschen und mit Natriumchlorid gesättigt, worauf erneut der pH-Wert durch Zugabe von
in 10%iger Phosphorsäurelösung auf 2,0 eingestellt wurde;
schließlich wurde 3mal, und zwar mit 0,5 1, 0,3 1 und nochmals 0,3 1 Äthylacetat extrahiert.
Der gewonnene Extrakt, der die Cephemverbindung enthielt, wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung
ι. gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck durch Destillation
vom Lösungsmittel befreit. Bei der Behandlung des verbleibenden Rückstandes mit Petroläther erhielt man
40,2 g rohes N-(2-Phenoxyäthoxycarbonyl)-cephalospo-
.Ii rin C (Derivat 5) in 64%iger Reinheit. Die Abtrennungsausbeute an Cephemderivat betrug 92,3%, bezogen auf
den Gehalt an Cephalosporin C in dem als Ausgangsmaterial benutzten Gärbrühenfiltrat.
10 g des rohen Derivates 5 wurden in der im Beispiel 1
Vi beschriebenen Weise behandelt, wodurch man 6,1 g des
Derivates 5 in 94%iger Reinheit erhielt.
Im DSC (Aceton/Methanol 1 : 2) ergab das Derivat 5 einen Fleck bei R1 = 0,69.
Bei Anwendung der vorstehenden Arbeitsweise mit
mi Magnesiumsulfat als Aussalzmittcl betrug die Abtrennungsausbeute
90,7%, bezogen auf den Cephalosporingehalt im Gärbrühenfiltrat.
Das Derivat 5 wies folgende charakteristische Eigenschaften auf:
F.: 97 bis 100°C(unter Zersetzung)
UV.: L* = 264 mn und 270 πιμ
IR.: 1790cm1
UV.: L* = 264 mn und 270 πιμ
IR.: 1790cm1
709 546/332
Elementaranalyse fürC25H2qNjOnS:
Berechnet: C 51,80, H 5,05, N 7,25%;
gefunden: C 51,61, H 5,20, N 6,95%.
gefunden: C 51,61, H 5,20, N 6,95%.
1 1 des Gärbrühenfiltrates, welches 2000 y/ml
Cephalosporin C enthielt und gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure
auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht und gut mit 200 ml Äthylacetat gewaschen, um alle fettigen
Anteile zu entfernen. Das gewaschene Brühenfiltrat wurde auf einen pH von 8,0 bis 8,5 gebracht, und zwar
durch Zugabe von wäßrigem Natriumhydroxid. Anschließend wurde die Lösung mit einer Lösung von 4 g
2-n-Butoxyäthoxycarbonylchlorid in 40 ml trockenem Aceton bei 15 bis 25°C im Verlauf von etwa 20 Minuten
und unter Rühren versetzt. Während der tropfenweisen Zugabe des Chloridreagenz wurde die Reaktionsmischung
durch gelegentliche Zugabe von 5 n-wäßrigem Natriumhydroxid auf einem pH-Wert von 8 bis 8,5
gehalten. Die Mischung wurde dann noch weitere 30 Minuten bei 15 bis 25°C und demselben pH-Wert
gerührt.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung erneut durch Zugabe
von 5 n-Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt, worauf die Lösung durch eine Kolonne geleitet wurde,
welche 200 ml eines schwach basischen Anionen-Austauscherharzes in Acetatform enthielt, wobei das
Cephemderivat an dem Harz adsorbiert wurde. Die Harzkolonne wurde anschließend mit 1 I Wasser
gewaschen und dann mit einer 0,5-m-Natriumchlorid-Chlorwasserstoffsäure-Lösung
bei einem pH-Wert von 3,0 entwickelt, so daß das N-(2-n-Butoxyäthoxycarbonyl)-cephalosporin
C aus der Kolonne eluiert wurde. Die Fraktionen des Eluates, die das gewünschte Cephemprodukt
enthielten, wurden vereinigt (500 ml) und die Lösung wurde auf einen pH von 2,0 gebracht.
Anschließend wurde 2mal mit je 300 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt mit dem Cephemprodukt
wurde seinerseits mit 300 ml Wasser mit pH 5,5 extrahiert. Die so gewonnene wäßrige Lösung wurde
der Gefriertrocknung unterworfen; man erhielt 4,3 g an rohem N-(2-n-Butoxyäthoxycarbonyl)cephalosporin C
(Derivat 6) in 56%iger Reinheit. Die Abtrennungsausbeute lag in diesem Fall bei 89,4%, bezogen auf den
Cephalosporin C-Gchalt in dem benutzten Gärbriihenfiltrat.
Eine Cephalosporin C enthaltende Gärbrühe wurde auf einen pH-Wert von 6 bis 7 gebracht und durch
Filtrieren von den Zellen befreit. Das so gewonnene Fiitrat enthielt 2000 y/ml Cephalosporin C.
101 des Filtrates wurden 3mal gut mit je 3 1 Älhylacetat gewaschen, um fetthaltiges Material zu
entfernen. Danach wurden zunächst 1 I Aceton und dann 20%ige Natriumhydrogenphosphatlösung oder
I n-Natriumhydroxidlösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 8 bis 8,5 einzustellen. Als nächstes wurde die Lösung
tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 27 g 2-Bromäthoxycarbonylchlorid in 0,51 trockenem
Aceton versetzt, und zwar bei einer Temperatur von 10 bis 200C im Verlauf von etwa 2 Stunden, wobei der
pH-Wert durch Zugabe von 20%iger Natriumhydrogenphosphatlösung bei 8 bis 8,5 gehalten wurde; nach
Beendigung der Zugabe wurde die Mischung noch 1 Stunde bei der gleichen Temperatur und dem gleichen
pH-Wert kontinuierlich weitergerührt.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von
10%iger Phosphorsäurelösung auf 6,5 bis 7,0 eingestellt; das Aceton wurde unter vermindertem Druck bei
Raumtemperatur abdestilliert. Danach versetzte man mit 1 kg Natriumchlorid und brachte den pH-Wert
durch Zugabe von 10%iger Phosphorsäurelösung auf 2,0. Die so gewonnene Lösung wurde nacheinander mit
1,51, 1 1 und nochmals 1 1 n-Butanol extrahiert. Der
n-Butanol-Extrakt wurde seinerseits 3mal mit je 0,61 0,2 m Phosphatpufferlösung (bei pH 6,5) extrahiert. Die
Phosphatpufferlösung, die das Cephemderivat enthielt, wurde mit 0,5 1 Äthylacetat gewaschen; die wäßrige
Schicht wurde durch Zugabe von 10%iger Phosphorsäurelösung auf pH 2,0 angesäuert, mit Natriumchlorid
gesättigt und mit 0,51, 0,31 und nochmals 0,31
Äthylacetat extrahiert. Dicso gewonnenen Äthylacetatextrakte wurden mit 0,5 I einer gesättigten wäßrigen
Natriumchioridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Destillieren
vom Lösungsmittel befreit. Zu dem verbleibender Rückstand wurde Petroläther gegeben; man erhielt se
38 g rohes 2-Bromäthoxycarbonylcephalosporin C (Derivat
7) in 63%iger Reinheit. Die Abtrennungsausbeute an Cephemderivat betrug 92%, bezogen auf den Gehall
an Cephalosporin C im Gärbrühenfiltrat.
10 g des rohen Cephemproduktes, welches 63% dei
Cephalosporin C-Komponente enthielt, wurden ir 100 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde mit Natrium
chlorid gesättigt und durch Zugabe von 10%igei Phosphorsäurelösung auf einen pH-Wert von 2,(
gebracht. Die entstandene Lösung wurde 3mal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrak
seinerseits wurde dann 3mal mit je 20 ml 0,2-rr Phosphatpufferlösung (mit einem pH-Wert von 6,5
extrahiert. Der entstandene Extrakt in der Phosphatpuf ferlösung wurde mit Natriumchlorid gesättigt und durcl·
Zugabe von 10%iger Phosphorsäurelösung auf pH 2,1 gebracht. Die so behandelte Extraktlösung wurde 3ma
mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die entstandene Athylacetatextraktlösung wurde mit 50 ml einer gesät
tigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, übei
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durcl· Destillieren unter vermindertem Druck vom Lösungs
mittel befreit. Der verbleibende Rückstand wurde mi einer Mischung aus Äther und Petroläther versetzt; dei
Niederschlag bestand aus 5,8 g N-(2-Bromäthoxycarbo nyl)cephalosporin C (Derivat 7) in einer Reinheit vor
95%.
Im DSC (Äthylacetat/Methanol 3:2) zeigte da:
Derivat 7 einen Fleck bei R1 = 0,51.
Das Derivat 7 konnte durch Chromatographierer über Silikagel (unter Verwendung einer I :3-Mischunj
von Methanol und Äthylacetat zum Entwickeln) weite: gereinigt werden. Das Derivat 7 wies folgende
charakteristische Eigenschaften auf:
F.: 83 bis 85°C (unter Zersetzung)
UV: L* = 262tT^unde* = 7500
IR: 1790 cm'
UV: L* = 262tT^unde* = 7500
IR: 1790 cm'
Elementaranalyse für CmH^N1Oi11SBr:
Berechnet: C 40,29, H 4,27, N 7 42%·
gefunden: C 40,21. H 4.56. N 7 400/,,.
Berechnet: C 40,29, H 4,27, N 7 42%·
gefunden: C 40,21. H 4.56. N 7 400/,,.
Der pH-Wert einer Cephalosporin C enthaltenden Gärbrühe wurde auf 6 bis 7 eingestellt und die Zellen
wurden abfiltriert. Das Filtrat enthielt 2000 y/ml Cephalosporine.
10 1 des Filtrates wurden 3mal mit je 1 1 Äthylacetat gewaschen, um Fettsubstanzen zu entfernen. Zu der
gewaschenen wäßrigen Phase wurden 31 Aceton gegeben sowie eine ausreichende Menge 1 n-Natriumhydroxidlösung,
um den pH-Wert auf 8 bis 8,5 einzustellen. Die wäßrige Lösung wurde dann tropfenweise
unter Rühren mit einer Lösung von 20,6 g 2-Chloräthoxycarbonylchlorid in 0,5 1 trockenem Aceton
versetzt, und zwar bei einer Temperatur von 10 bis 2O0C im Verlauf von etwa 2 Stunden, wobei der
pH-Wert durch Zugabe von wäßrigem 1 n-Natriumhydroxid auf 8 bis 8,5 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch
wurde kontinuierlich eine weitere Stunde bei 10 bis 200C bei pH 8 bis 8,5 gerührt. Danach wurde der
pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von l0%iger Phosphorsäurelösung auf 6,5 bis 7,0 verringert;
das Aceton wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abdestilliert. Die entstandene konzentrierte
Lösung wurde mit 1 kg Natriumchlorid versetzt und mit 10%iger Phosphorsäurelösung auf pH 2
eingestellt. Danach wurde die Lösung mit 1,51, 1 1 und nochmals 1 1 n-Butanol extrahiert. Die Extraktlösung in
n-Butanol wurde ihrerseits 3mal mit je 0,61 0,2-m Phosphatpufferlösung (deren pH-Wert 6,5 betrug)
extrahiert. Der gewonnene wäßrige Extrakt (die Pufferlösung) wurde mit 0,5 1 Äthylacetat gewaschen,
mit 10%iger Phosphorsäurelösung vermischt, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen, mit Natriumchlorid
gesättigt und nacheinander mit 0,5 1, 0,3 1 und nochmals 0.3 1 Äthylacetat extrahiert. Der gewonnene Äthylacetatextrakt
wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmitte! befreit. Der verbleibende Rückstand
wurde mit Petroläther versetzt und ergab 35 g rohes N-(2-Chloräthoxycarbonyl)cephalosporin C (Derivat 8)
in einer Reinheit vun Go1G0Zo. Die Abircr.nursgsaiisbeute
an Derivat 8 betrug 96%, bezogen auf den Gehalt an Cephalosporin C im Brühenfiltrat.
10 g des Rohproduktes, welches 68,6% des Derivates
8 enthielt, wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 angegeben behandelt, wodurch man 6,6 g gereinigtes
Derivat 8 (97%ige Reinheit) erhielt.
Im DSC (Äthylacetat/Methanol 3 :2) ergab das
Derivat 8 einen Fleck bei Rf = 0,50.
Das Derivat 8 konnte weiter gereinigt werden, wenn man es der Silikagelchromatographie unter Verwendung
einer ! : 3-Mischung von Methanol/Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel unterwarf. Das Derivat 8
wies folgende weitere charakteristische Eigenschaften auf:
ill 104 bis 108°C(unter Zersetzung)
L* - 261 mnunde* = 7500
1790cm-1
L* - 261 mnunde* = 7500
1790cm-1
F.:
UV:
IR:
Elementaranalyse
Berechnet: C 43,72, H 4,63, N 8,05%;
gefundene 43,51, H 4,52, N 7,92%.
gefundene 43,51, H 4,52, N 7,92%.
Vergleichsversuche
In den vorliegenden Vergleichsversuchen soll gezeigt werden, daß die gemäß Erfindung durchgeführte
Abtrennung des Cephalosporin C aus der Gärbrühe mit höheren Ausbeuten möglich ist als bei Anwendung der
Arbeitsweise nach den Verfahren des Standes der Technik.
So wurden beispielsweise 750 ml eines Gärbrühenfiltrates, welches 2000 mcg/ml Cephalosporin C enthielt,
durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und dann mit 225 ml Äthylacetat
gewaschen.
Nach dem Waschen zeigte das Gärbrühenfiltrat eine antibakterielle Aktivität von 1735 mcg/ml. 100 ml des
gewaschenen Gärbrühenfiltrates wurden abgenommen und mit den in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten
Reagentien umgesetzt, so daß die entsprechenden N-geschützten Cephalosporin C-Derivate gebildet wurden.
Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat extrahiert, der Äthylacetatextrakt
wurde dann seinerseits mit Wasser extrahiert, um das N-geschützte Cephalosporin C-Derivat in die wäßrige
Phase zu überführen, die dann ihrerseits wiederum mit Äthylacetat extrahiert wurde. Der schließlich erhaltene
Äthylacelatextrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei das N-geschütztc
Cephalosporin C-Derival zurückblieb. Die Ausbeute wurde in mg gemessen und der Abtrennungsgrad (%]
wurde auf der Basis der in dem Gärbrühenfiltrai ursprünglich vorhandenen Cephalosporin C-Mengc
berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Reagenz
N-geschiilz.les Cephalosporin C-I)erival
Ausbeute Ahtrcnnungsgriul
Ausbeute Ahtrcnnungsgriul
Absorption in
UV ,V1'""
UV ,V1'""
2-Chloriithoxyciirbonylchlarid gemäß Erfindung
2 n-Butoxyäthoxyearbonylchlorid gemäß Erfindung
Isobutoxycarbonylchlorid (Vergleich) gcmiiU 139,5
I)T-OS 19 33 187
Isobornyloxycarbonylchlorid (Vergleich) gemäß DT-OS 22 08 631
89
78
65
78
65
68
260 πιμ
260 ηιμ
260 ηιμ
260 ηιμ
262 ηιμ
262 ηιμ
Die Ergebnisse in der vorstehenden Tabelle zeigen, daß es mil HiIIc der Erfindung möglich ist, du
Cephalosporin C aus dem Giirbrühenfiltrat mit einem höheren Abtrennungsgrad zu gewinnen, als dies mit Hill
der zum Stand der Technik gehörenden Verfahren und Arbeitsweisen möglich ist.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus seinen wäßrigen Lösungen in Form von Urethan-Derivaten durch Umsetzung der wäßrigen Lösung mit einem Chloroforniiat und Isolierung des gebildeten Urethan-Derivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel oder durch Adsorption an einem festen Adsorptionsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man ein ChIoroformiat der allgemeinen FormelR1—CH-CH - OC-CI (2)R1 R1in welcherR1 ein Chlor- oder Bromatom oder eine Alkoxygruppe mit t bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenoxygruppe und R-und R1 Wasserstoffalome, Halogenatome oder Methylgruppenbedeuten, verwendet.
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|---|---|---|---|
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