DE2501958C2

DE2501958C2 - Verfahren zur Gewinnung von Bicyclomycin

Info

Publication number: DE2501958C2
Application number: DE2501958A
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Daiwahigashi Kawanishi Jomon; Tadaaki Takatsuki Komori; Masaru Takatsuki Kurita; Isami Ikeda Nakatani
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-01-21
Filing date: 1975-01-18
Publication date: 1985-06-05
Also published as: GB1484776A; AU497610B2; DE2501958A1; SE423719B; DK683774A; FR2258449B1; DK140698B; CA1041497A; JPS50101586A; NL182157C; NL7500693A; NL182157B; DK140698C; ES433975A1; BE824515A; SE7500598L; FR2258449A1; JPS579799B2; US4018772A; AU7698174A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Bicyciomycin aus einer Bicyciomycin zusammen mit Verunreinigungen enthaltenden Lösung.

Bicyciomycin ist ein bekanntes Antibiotikum, das aus der Fermentationsbrühe eines Mikroorganismenstamms des Genus Streptomyces isoliert wird; bezüglich näherer Einzelheiten vgl. »The journal of Antibiotics«, Band XXV, Nr. 10,569-575, und die deutsche Offenlegungsschrift 21 50 593, worin Bicyciomycin als Substanz WS-4545 bezeichnet wird. In den genannten Literaturstellen sind Verfahren beschrieben, bei denen zum Isolieren und Reinigen von Bicyciomycin aus einer Fermentationsbrühe eine mit Aktivkohle, Cellulose, Kieselsäure oder Diatomeenerde gefüllte Säule verwendet wird. Es hat sich in der Praxis jedoch nicht als zufriedenstellend erwiesen, diese bekannten Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Bicyciomycin anzuwenden, weil sie verhältnismäßig viele Stufen für die Isolierung und Reinigung von Bicyciomycin umfassen und die Ausbeute an Bicyciomycin verhältnismäßig gering ist

Auf der Suche nach einem technisch brauchbaren Verfahren zur Gewinnung von Bicyciomycin wurde nun ein neues Verfahren zur Reinigung von Bicyciomycin als eine Stufe der Gewinnung gefunden, bei dem Bicyciomycin in höherer Ausbeute als nach den bekannten Verfahren gewonnen werden kann. Außerdem ist dieses neue Verfahren einfacher und für die praktische Durchführung bequemer und in großtechnischem Maßstabe wirtschaftlicher, weil das dabei verbrauchte Harz für die Wiederverwendung regeneriert werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Reinigung von Bicyciomycin zu finden, mit dem das Bicyciomycin in höherer Ausbeute als nach den bekannten Verfahren erhalten wird, und das einfach, bequem und wirtschaftlich durchgeführt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist unter Lösung dieser Aufgabe demgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von Bicyciomycin aus einer Bicyciomycin zusammen mit Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Lösung mit einem nicht-ionischen, mit Divinylbenzol vernetzten makroporösen Styrolpolymerisat bei einem pH-Wert von 2 bis 8 in Konta ' bringt und das adsorbierte Bicyciomycin mit einem hydrophilen Lösungsmittelsystem aus dem Polymerisat eluiert.

Die erfindungsgemäß verwendeten Adsorptionsharze sind bekannt. Beispiele für solche Harze sind Amberlite XAD-!. XAD-2. XAD-4. XAD-7 und XAD-8. Diaion HP 10, HP 20, HP 30, HP 40 und HP 50 und Hitachigel Nr. 3010.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von Bicyciomycin unter Verwendung eines iuakroporösen nicht-ionischen Adsorptionsharzes ist auf jede beliebige wäßrige Lösung anwendbar, die Bicyciomycin zusammen mit Verunreinigungen enthält Geeignete Beispiele sind ein Filtrat einer Kulturbrühe selbst, das durch Kultivieren von Bicyclomycin-bildenden Mikroorganismen

ίο in einem Nährmedium erhalten worden ist, und eine vorextrahierte Kulturlösung sowie eine wäßrige Lösung, die rohes, festes, Bicyciomycin enthaltendes -Material enthält, das vorher isoliert und bis zu einem gewissen Grade gereinigt worden ist aus einem Filtrat der Kulturbrühe auf konventionelle Weise, beispielsweise eine gegebenenfalls durchgeführte Behandlung des FiI-trats mit einem geeigneten Extraktionslösungsmittel und/oder mit einer mit Aktivkohle, Cellulose, Kieselsäure oder Diatomeenerde gefüllten Säule.

Bei Verwendung eines Kulturfiltrats ist es vorteilhaft, eine gegebenenfalls vorextrahierte Kulturlösung zu verwenden, und die gegebenenfalls vorextrahierte Kulturlösung wird mit einem makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharz auf übliche Weise, vorzugsweise unter Verwendung einer das Karzbett enthaltenden Säule, in Kontakt gebracht Bei dieser Vorbehandlung ist es von Vorteil, die Fermentationsbrühe vor ihrem Filtrieren anzusäuern und sie dann auf übliche Weise, zweckmäßig in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, zu filtrieren. Die Bicyciomycin in Mischung mit Verunreinigungen enthaltende wäßrige Lösung wird auf konventionelle Weise, beispielsweise ansatzweise oder portionsweise (säulenweise), mit dem makroporösen, nichtionischen Adsorptionsharz in Kontakt gebracht Das adsorbierte Bicyciomycin kann mit einem hydrophilen Lösungsmittelsystem aus dem Harz eluiert werden.

Zum Eluiercn von Bicyciomycin aus dem Harz können verschiedene hydrophile Lösungsmittelsysteme verwendet werden, z. B. ein niederes Dialkylketon, wie Aceton, Methyläthylketon und Methyjisobutylketon, und ein niederes Alkanol, wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol und Isobutanol. Es können auch Mischungen aus dem oben genannten niederen Dialkylketon und niederen Alkanol verwendet wer-' den. Ferner können Mischungen aus Wasser oder einem niederen Alkylester einer niederen Alkansäure (z.B.

Methylacetat, Äthylacetat und Butylacetat) und dem

oben erwähnten niederen Alkanol verwendet werden.

Die Behandlung der Bicyciomycin in Mischung mit

Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Lösung mit dem nicht-ionischen Adsorptionsharz wird zweckmäßig bei einem pH-Wert von 4 bis 7 durchgeführt, und die gewünschten sauren pH-Werte können unter Verwendung jeder beliebigen Säure, beispielsweise einer organischen Säure, wie Oxalsäure, oder vorzugsweise einer Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder vorzugsweise Schwefelsäure, erzielt werden. Das verbrauchte Harz kann auf übliche Weise regeneriert werden, beispielsweise durch Waschen des Harzes mit einer wäßrigen alkalischen Lösung oder mit einer wäßrig-alkoholischen alkalischen Lösung.

Das auf diese Weise erhaltene Eluat wird auf übliche Weise, beispielsweise durch Einengen, Lynphilisieren und Kristallisieren, behandelt unter Bildung von reinen Kristallen von Bicyciomycin, das in diesem Zustand für die Verwendung als Medikament geeignet ist.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

25 Ol

3

Beispiel 1 methanolische Lösung wurde eingeengt und man erhielt

einen sirupartigen Rückstand. Der Rückstand wurde

Zu einer durch Kultivieren von Streptomyces sappo- über eine Silicagelsäule laufen gelassen und dann wurde ronensis ATCC 21 532 bei 30⁰C für einen Zeitraum von die Säule mit einer Chloroform/Methanol (10/I)-Mi-120 Stunden in 201 eines 5% Kartoffelstärke, 3% Baum- s schung entwickelt Es wurde die aktive Fraktion gesamwollsamenmehl, 1% MgSO₄ · 7 H2O, 1,09% KH₂PO₄, melt und die Lösung wurde unter vermindertem Druck 0,74% Na₂HPO₄ · 12 H₂O enthaltenden Nährmediums eingeengt und anschließend getrocknet unter Bildung hergestellten Kulturbrühe wurde 1% Radiolite (Han- eines weißen Pulvers. Das Pulver wurde in Aceton krideäsbeseichnung für ein Filterhilfsmaterial) zugegeben stallisier*. und man erhielt 1,5 g Kristalle von Bicyclomy- und dann wurde die Mischung filtriert 11 des erhaltenen 10 ein (Reinheit fast 100%), Ausbeute 75%. Filtrats (Bicyclomycin-Gehalt 2^5 g) wurde über eine

mit dem makroporösen, nicht-ionischen Adsorptions- Beispiel 5

harz Amberlite XAD-4 gefüllte Säule (Innendurchmesser der Säule 5 cm. Höhe 32 cm) laufen gelassen. Nach- IV₂I des Filtrats (Bicyclomycingehalt 3,37 g) der dem die Säule mit Wasser gewaschen worden war, wur- 15 praktisch nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 de das Bicyclomycin mit 1150%igem wäßrigem Aceton hergestellten Kulturbrühe wurden über eine mit dem eluiert, wobei man 800 ml Eluat erhielt Das E'uat wurde makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharz Diaion zur Entfernung von Aceton und Walser eingeengt Zu HP 20 gefüllte Säule (Innendurchmesser der Säule 5 cm, dem dabei erhaltenen Rückstand wurden 150 ml einer Höhe 32 cm) laufen gelassen. Nachdem die Säule mit Isopropanol/Äthylacetat (l/2)-Mischung unter Rühren 20 500 ml Wasser gewaschen worden war, wurde das Bicyzugegeben und dann wurde die Lösung filtriert Das clomycin mit 600 ml 50%igem wäßrigem Aceton eluiert Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und Die aktive Fraktion wurde gesammelt und dann wurde man erhielt 1,65 g Kristalle von Bicyclomycin (Reinheit die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt fast 100%), Ausbeute 73%. Nachdem der erhaltene Rückstand mit n-Butano! gewa-

25 sehen wurden war, wurde er unter verminderten Druck

Beispiel 2 weiter eingeengt Es wurde eine IsopropanolAÄthylace-

tat (1/2-Mischung zu dem Rückstand zugegeben und

1,8 g Kristalle von Bicyclomycin (Reinheit fast 100%) nachdem die unlöslichen Materialien entfernt worden wurden im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren waren, wurde die Lösung unter vermindertem Druck wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei diesmal jedoch als 30 eingeengt unter Bildung von 2,52 g Kristallen von Bicy-Lösungsmittel zum Eluieren anstelle des in Beispiel 1 clomycin (Reinheit fast 100%), Ausbeute 75%. verwendeten 50%igen wäßrigen Acetons. 1,21 einer 50%igen wäßrigen Methanollösung verwendet wurden, Ausbeute 80%.

35 Beispiel 3

21 der 10 g rohe Kristalle von Bicyclomycin (Reinheit 90%) enthaltenden wäßrigen Lösung wurden über eine mit dem makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharz Amberlite XAD-4 gefüllte Säule (Innendurchmesser der Säule 5 cm, Höhe 32 cm) laufen gelassen. Nachdem die Säule mit Wasser gewaschen worden war, wurde das Bicyclomycin mit 11 einer 50%igen wäßrigen Isopropanollösung eluiert wobei man 600 ml Eluat erhielt Das Eluat. wurde unter vermindertem Druck eingeengt und man erhielt 8,6 g Kristalle von Bicyclomycin (Reinheit fast 100%), Ausbeute 96%.

Beispiel 4

201 des Filtrats (Bicyclomycingehalt 2 g) der Kulturbrühe, die durch Kultivieren von Streptomyces griseoflavus var. bicyclomyceticus für eine Dauer von 120 Stunden bei 30⁰C in 201 eines 2% Kartoffelstärke, 1% Baumwollsamenmehl, 1% Glutenmehl, 1% Sojabohnenmehl, 1 % getrocknete Stärke, 2,1 % KH₂PO₄ und 1,4% Na₂HPO₄ · 12 H₂O enthaltenden Nährrnediums hergestellt worden war, wurden durch eine mit dem makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharz Amberlite XAD-4 gefüllte Säule (Innendurchmesser der Säule 5 cm, Höhe 32 cm) laufen gelassen. Nachdem die Säule mit Wasser gewaschen worden war, wurde das aktive Material mit 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann lyophilisiert unter Bildung eines amorphen Pulvers. Zu dem Pulver wurden 50 ml Methanol zugegeben. um die unlöslichen Materialien zu entfernen. Die

Claims

25 Ol 958

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Bicyciomycin aus einer Bicyciomycin zusammen mit Verunreinigungen enthaltenden wäJrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Lösung mit einem nicht-ionischen mit Divinylbenzol vernetzten makroporösen Styrolpolymerisat bei einem pH-Wert von 2 bis 8 in Kontakt bringt und das adsorbierte Bicyciomycin mit einem hydrophilen Lösungsmittelsystem aus dem Polymerisat eluiert