DE4042156C2 - Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von Mitomycin CInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von
Mitomycin C aus der Kultur eines Mitomycin C-erzeugenden
Mikroorganismus.
Mitomycin C ist ein anti-Tumor-Antibiotikum, das durch
Züchtung eines zur Art Streptomyces caespitosus gehörenden
Mikroorganismus erhalten wird, und wird schon viele Jahre
klinisch verwendet.
Für die Reinigung von Mitomycin C aus der durch Züchtung des
vorstehend genannten Mikroorganismus erhaltenen Kultur, ist
die Aktivkohle-Adsorptionsmethode bekannt, die die Zugabe
von Aktivkohle zu dem durch Entfernen der Zellen erhaltenen
Kulturfiltrat für die Adsorption von Mitomycin C und die
Elution von Mitomycin C mit einem organischen Lösungsmittel
umfaßt; oder eine Reinigungsmethode, die die Extraktion von
im Kulturfiltrat enthaltenem Mitomycin C mit einem
organischen Lösungsmittel und eine Aluminat- oder
Gegenstromverteilungschromatographie des erhaltenen
Konzentrats von Mitomycin C umfaßt (Verfahren A: JP-A-
17897/60, US-A-3,660,578).
Als Verbesserung des vorstehend erwähnten Verfahrens ist
eine Methode bekannt, die Adsorption des Kulturfiltrats auf
ein Adsorptionsharz mit umgekehrter Phase, Elution von
Mitomycin C mit einem Lösungsmittel wie Aceton, Methanol
oder Ethanol, Konzentrierung des Eluats durch Entfernen des
Lösungsmittels, Sättigung des Konzentrats mit Natriumchlorid
zum Lösen des gesättigten Konzentrats in Chloroform,
Verwendung des Chloroformextraktes für die Aluminat-
Säulenchromatographie, Elution des adsorbierten Bereichs von
Mitomycin C mit Methanol, Konzentrierung des Eluats und
Zugabe von Ether, Petrolether, Benzin oder Ligroin zu dem
Konzentrat umfaßt, wobei kristallines Mitomycin C erhalten
wird (Verfahren B: JP-A-9094/61).
Das vorstehend beschriebene Verfahren A weist
Schwierigkeiten auf, da Verfahrensschritte wie die Elution
nach der Adsorption an Aktivkohle und die Extraktion mit
einem organischen Lösungsmittel, einen niedrigen
Wirkungsgrad aufweisen und daher die erhaltene Ausbeute an
Mitomycin C niedrig ist.
Auch bei Verfahren B hat z. B. Duolite S-30 (Duolite Co.,
Ltd.), das speziell als Adsorptionsharz mit reverser Phase
verwendet wird, eine geringe Adsorptionsfähigkeit von
Mitomycin C, so daß große Mengen des Harzes und
Lösungsmittels verwendet werden müssen. Die
Extraktionseffizienz ist bei der Extraktion mit Chloroform
niedrig, so daß eine große Menge Chloroform verwendet und
der Extraktionsschritt wiederholt werden muß. Weiter
umfassen die Schritte der Mitomycin C-Elution und -Isolation
aus dem Aluminat-Adsorptionsbereich nach der Chromatographie
komplizierte Verfahrensschritte und sind im Hinblick auf die
Bedingungen am Arbeitsplatz nicht wünschenswert. Zusätzlich
ist die Reinheit des erhaltenen Eluats nicht sehr hoch. Die
aus dem Eluat erhaltenen Kristalle sind von der Reinheit
ungenügend und müssen unkristallisiert werden. Dadurch wird
der für alle Reinigungsschritte benötigte Zeitraum
verlängert. Somit ergeben die bekannten Verfahren
verschiedene Schwierigkeiten.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein
verbessertes Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C
bereitzustellen, das in technischem Maßstab mit hoher
Produktivität durchgeführt werden kann. Diese Aufgabe wird
durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur
Reinigung von Mitomycin C, umfassend:
- a) Behandlung der Kultur eines Mitomycin C-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Adsorptionsharz mit reverser Phase zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- b) Elution des Mitomycin C mit Ethylacetat aus dem Harz,
- c) Zugabe eines Phosphatpuffers zum Eluat und dann Abziehen des Ethylacetats,
- d) Chromatographie des nach dem Abziehen verbleibenden Rückstandes unter Druck über eine Säule, die mit einem einen kleinen Partikeldurchmesser aufweisenden Adsorbens mit reverser Phase gepackt ist, zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- e) Elution des Mitomycin C mit wäßrigem Methanol unter Druck aus dem Harz,
- f) Behandlung des Eluats mit einem Adsorptionsharz mit reverser Phase zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- g) Elution des Mitomycin C mit Methanol aus dem Harz, und
- h) Konzentrierung des Methanoleluats zur Kristallisation des Mitomycin C.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur
Reinigung von Mitomycin C detailliert beschrieben.
- a) Das Kulturfiltrat, das durch Abtrennen der Zellen aus
der nach bekannten Methoden erhaltenen Kultur (z. B. JP-
A-17898/60) erhalten wird, wird gekühlt. Nachdem der pH-
Wert mit Phosphorsäure auf 6,8 bis 7,0 eingestellt
worden ist, wird das Kulturfiltrat über ein
Adsorptionsharz mit reverser Phase chromatographiert.
Hierbei wird vorzugsweise ein Polystyroldivinylbenzol als Adsorptionsharz mit reverser Phase verwendet, anstelle von Doulite S-30, einem phenolischen Harz, das bisher verwendet worden ist. Ein Beispiel des Harzes ist DIAION SP-207 (Produkt von Mitsubishi Kasei Corporation). Die verwendete Menge des Harzes ist im Bereich von 300 bis 500 ml, im allgemeinen 400 ml im Fall von DIAION SP-207, für 1 g Mitomycin C; dagegen werden von Duolite S-30 3 Liter benötigt. - b) Dann wird das Harz, an welches Mitomycin C adsorbiert
worden ist, gewaschen und danach wird Mitomycin C mit
Ethylacetat eluiert. Die Menge des verwendeten
Ethylacetats zur Elution ist im allgemeinen 1,5 bis 2
Liter pro 1 Liter Harz.
Durch die Verwendung von DIAION SP-207 als adsorbierendes Harz anstelle von Duolite S-30 wird die Adsorptionsfähigkeit von Mitomycin C an das Harz verbessert und die Menge des verwendeten Elutionsmittels wird stark reduziert. - c) Weiter wird die 1- bis 2-fache Menge Phosphatpuffer (0,01 Mol/Liter Natriumphosphat), der einen pH-Wert von 6,5 bis 8,0 aufweist, zu dem erhaltenen Ethylacetateluat gegeben. Das Ethylacetat wird unter verringertem Druck abgezogen, wobei Mitomycin C enthaltender Phosphatpuffer erhalten wird. Bei dieser Behandlung wird keine große Menge des organischen Lösungsmittel benötigt und die Durchführung ist einfach, verglichen mit der üblichen Chloroformextraktion. Ferner kann durch die Verwendung solcher Puffer auch ein möglicher Zerfall von Mitomycin C während der Konzentration verhindert werden.
- d) und e) Der so erhaltene, Mitomycin C enthaltende
Phosphatpuffer wird über eine Säule, die mit einem einen
kleinen Partikeldurchmesser aufweisenden Adsorbens mit
reverser Phase gepackt ist, chromatographiert. Nach dem
Waschen mit Wasser wird das adsorbierte Mitomycin C mit
wäßrigem Methanol eluiert. Um das Mitomycin C aus einer
großen Probenmenge in einer hohen Ausbeute mit guter
Trennung in einem kurzen Zeitraum abzutrennen, ist es im
allgemeinen vorteilhaft, diese Verfahrensschritte unter
Druck durchzuführen (sogenannte
Hochdruckflüssigkeitschromatographie, nachstehend als
HPLC-Methode bezeichnet).
Bei der HPLC-Methode wird als Adsorbens mit reverser Phase z. B. octadecyliertes Silicagel verwendet, das für die Behandlung einer großen Probenmenge in technischem Maßstab geeignet ist. Beispiele für das Silicagel sind ODS-AQ60 und ODS-AQ120 (Produkte von Yamamura Chemical).
Das Adsorbens hat im Hinblick auf die behandelte Probenmenge und Trenneigenschaft einen Partikeldurchmesser von 10 bis 200 µm, vorzugsweise etwa 50 µm. Das Adsorbens wird im allgemeinen in einer Menge von 200 bis 300 ml pro 1 g Mitomycin C verwendet. Der Druck bei der Adsorption und Elution von Mitomycin C ist (980 665 Pa bis 4 903 325 Pa). Die Konzentration des zur Elution verwendeten wäßrigen Methanols ist vorzugsweise 20 bis 40%. Die Raumgeschwindigkeit während der Elution ist 1 bis 5.
Die HPLC-Methode ist der üblichen Aluminat- Säulenchromatographie in Bezug auf Reinigung, Durchführbarkeit und die Bedingungen am Arbeitsplatz, überlegen. - e) Dann wird zur Konzentrierung des durch die chromatographische Trennung verdünnten Mitomycin C die Konzentration von Methanol in der die eluierte Mitomycin C-Fraktion enthaltenden wäßrigen Methanollösung auf 10% oder weniger eingestellt, die dann wieder über eine kleine Menge Adsorptionsharz mit reverser Phase chromatographiert wird. Als Adsorptionsharz wird das vorstehend beschriebene Polystyroldivinylbenzolharz bevorzugt, und z. B. DIAION SP-207 verwendet. Die Menge des verwendeten Harzes ist 80 bis 100 ml pro 1 g Mitomycin C.
- f) Die Elution wird mit Methanol durchgeführt. Im allgemeinen werden 2 bis 3 Liter Methanol pro 1 Liter Harz verwendet.
- g) Die Mitomycin C-Fraktion enthaltende, mit Methanol
eluierte Lösung wird unter reduziertem Druck auf 200 bis
250 g/Liter konzentriert. Durch Stehenlassen des
Konzentrats bei 5 bis 10°C für 5 bis 10 Stunden wird das
Mitomycin C kristallisiert. Die Kristalle werden
filtriert und getrocknet, wobei das erhaltene Mitomycin
C eine hohe Reinheit aufweist.
Die Kristalle werden in bekannter Weise weiter umkristallisiert und anschließend chromatographisch behandelt, wobei ein Produkt hoher Reinheit erhalten wird. Im vorliegenden Kristallisationsverfahren kann Mitomycin C von hoher Reinheit, verglichen mit den bekannten Produkten, ohne Umkristallisation erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C
zeichnet sich ferner durch eine verbesserte Ausbeute bei der
Reinigung und verkürzte Durchführung aus.
Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden unter
Bezugnahme auf das folgende Beispiel und Referenzbeispiel
erklärt.
In dem Beispiel und Referenzbeispiel wurde die Reinheit von
Mitomycin C durch HPLC unter den im nachfolgenden
beschriebenen Bedingungen analysiert.
Säule: YMC AM-312 ODS, 6ø × 150 mmL
Elutionsmittel: 20% Methanol: 80% 0,01 M Ammoniumacetat, pH 6,5
Elutionsrate: 1 ml/min
Temperatur: 35°C
Detektion: UV (254 nm)
Elutionsmittel: 20% Methanol: 80% 0,01 M Ammoniumacetat, pH 6,5
Elutionsrate: 1 ml/min
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Detektion: UV (254 nm)
4500 Liter einer 500 g Mitomycin C enthaltenden Kultur
werden mit 300 kg Radiolite #500 (Showa Chemical Industry)
als Filterhilfe versetzt. Das Gemisch wird durch eine
Filterpresse filtriert. Nachdem Phosphorsäure zur
Einstellung des pH-Wertes auf 7 zu 5000 Liter des erhaltenen
Filtrats gegeben worden ist, wird das Gemisch, mit einer
Geschwindigkeit von 1000 Liter /Std. über eine mit 2000
Liter DIAION SP-207 gepackte Säule chromatographiert. Nach
dem Waschen der Säule mit Wasser werden 400 Liter
Ethylacetat mit einer Geschwindigkeit von 200 Liter/Std.
aufgegeben, wobei 400 Liter Eluat erhalten werden. Das Eluat
enthält 436 g Mitomycin C. Nachdem 400 Liter Phosphatpuffer
mit pH-Wert 7,5 zu dem Eluat gegeben worden sind, wird das
Gemisch durch Abziehen des Ethylacetats unter reduziertem
Druck konzentriert. Unter einem Druck von 1961 330 Pa werden
300 Liter der so erhaltenen wäßrigen Lösung über eine
technische HPLC-Säule, die mit 80 Liter ODS-A120-S50 gepackt
ist, bei einer Geschwindigkeit von 200 Liter/Std.
chromatographiert. Nach dem Waschen mit 80 Liter 10%
methanolischer, wäßriger Lösung wird die Elution mit 600
Liter 30% methanolischer, wäßriger Lösung bei einer
Raumgeschwindigkeit von 3 durchgeführt. Zu 80 Liter der 406 g
Mitomycin C enthaltenden Fraktion werden 160 Liter Wasser
gegeben. Das Gemisch wird mit einer Geschwindigkeit von 150
Liter/Std. über eine mit 30 Litern DIAION SP-207 gepackte
Säule chromatographiert. Nachdem das Wasser aus dem Harz
eluiert ist, wird die Elution mit Methanol durchgeführt,
wobei 60 Liter der 380 g Mitomycin C (Reinheit 97,6%)
enthaltenden, methanolischen Lösung erhalten werden. Die
Lösung wird unter reduziertem Druck auf 1,9 Liter
konzentriert und danach bei 5°C für 10 Stunden stehen
gelassen. Die erhaltenen Kristalle werden filtriert und im
Vakuum getrocknet, wobei 350 g Mitomycin C (Reinheit 99,7%)
erhalten werden.
Phosphorsäure wird zu 5000 Litern der in ähnlicher Weise wie
im vorstehenden Beispiel erhaltenen Kultur gegeben, wobei
der pH-Wert auf 7 eingestellt wird, und das Gemisch wird mit
einer Geschwindigkeit von 2000 Liter/Std. über eine mit 1500
Liter Duolite S-30 gepackte Säule chromatographiert. Nach
dem Waschen der Säule mit Wasser wird Aceton mit einer
Geschwindigkeit von 2000 Liter/Std. aufgegeben, wobei 2000
Liter Eluat erhalten werden. Das Eluat enthält 434 g
Mitomycin C. Nachdem 500 Liter Wasser zugegeben worden sind,
wird das Gemisch durch Abziehen des Acetons unter
reduziertem Druck konzentriert. Damit werden 300 Liter
wäßrige Lösung erhalten. 35 kg Natriumchlorid werden in der
wäßrigen Lösung gelöst. Dann werden 3 Liter Chloroform zu
der Lösung gegeben und diese anschließend gerührt. Nachdem
die Chloroformphase abgetrennt worden ist, wird wieder
Chloroform zu der wäßrigen Phase zugegeben. Nach dem Rühren
wird die Chloroformphase abgetrennt. Dieser Schritt wird 5
mal wiederholt, wobei 1500 Liter Chloroformextrakt erhalten
werden. Danach beträgt der Gehalt an Mitomycin C 415 g.
Nachdem der Extrakt in 10 Portionen zu 150 Liter aufgeteilt
worden ist, wird jede Portion über 10 mit 3 Litern Aluminat,
das zuvor bei 120°C für 20 Stunden zur Aktivierung
getrocknet worden ist, gepackten Säulen chromatographiert.
Dann werden 4 Liter 3% Methanol enthaltendes Chloroform
über die Säule gegeben. Nachdem das Lösungsmittel entfernt
worden ist, wird die Aluminatschicht aus der Säule entfernt
und die Bereiche, in denen Mitomycin C adsorbiert ist,
werden aus den 10 Säulen herausgeschnitten. Durch 30 Minuten
Rühren in 50 Liter Methanol und anschließendes Filtrieren
werden 336 g Mitomycin C (Reinheit 80,4%) enthaltendes
Filtrat erhalten. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck
auf 1,7 Liter konzentriert und bei 5°C für 10 Stunden
stehengelassen. Die erhaltenen Kristalle werden filtriert
und im Vakuum getrocknet, wobei 296 g Mitomycin C (Reinheit
97,4%) erhalten werden.
Die Kristalle werden in 90 Liter Methanol gelöst, und die
Lösung wird unter vermindertem Druck auf 1,5 Liter
konzentriert und bei 5°C für 10 Stunden stehengelassen. Die
umkristallisierten Kristalle werden filtriert und im Vakuum
getrocknet, wobei 272 g Mitomycin C (Reinheit 99,7%)
erhalten werden.
Claims (7)
1. Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C, umfassend die
Schritte:
- a) Behandlung der Kultur eines Mitomycin C-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Adsorptionsharz mit reverser Phase zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- b) Elution des Mitomycin C mit Ethylacetat aus dem Harz,
- c) Zugabe von Phosphatpuffer zu dem Eluat und dann Abziehen des Ethylacetats,
- d) Chromatographie des nach dem Abziehen verbleibenden Rückstandes unter Druck über eine Säule, die mit einem einen kleinen Partikeldurchmesser aufweisenden Adsorbens mit reverser Phase gepackt ist, zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- e) Elution des Mitomycin C mit wäßrigem Methanol unter Druck aus dem Harz,
- f) Behandlung des Eluats mit einem Adsorptionsharz mit reverser Phase zur Adsorption des Mitomycin C an das Harz,
- g) Elution des Mitomycin C mit Methanol aus dem Harz, und
- h) Konzentrierung des Methanoleluats zur Kristallisation des Mitomycin C.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adsorptionsharz mit reverser Phase in den Schritten
a) und f) ein Polystyroldivinylbenzolharz ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der pH-Wert des Phosphatpuffers in Schritt c) 6,5 bis
8,0 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das einen kleinen Partikeldurchmesser aufweisende
Adsorbens mit reverser Phase in Schritt d) ein
octadecyliertes Silicagel ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
das octadecylierte Silicagel einen Partikeldurchmesser
von 10 bis 200 µm aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Druck in den Schritten d) und e) 980 665 Pa bis 4 903 325 Pa
beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Konzentration des wäßrigen Methanols für die Elution
in Schritt e) 20 bis 40% beträgt.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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| DE4042156A DE4042156C2 (de) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | Verfahren zur Reinigung von Mitomycin C |
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Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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1990
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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