DE3410180C2

DE3410180C2 -

Info

Publication number: DE3410180C2
Application number: DE3410180A
Authority: DE
Inventors: Ernesto Mailand/Milano It Oppici; Onorino San Raffaela Cimema Turin/Torino It Giacoma Rosa; Carlo Turin/Torino It Varesio; Giovanni Lazzari; Danillo Settimo Torinese Turin/Torino It Fabris
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1983-03-30
Filing date: 1984-03-20
Publication date: 1989-03-16
Also published as: FR2543554A1; DK146984D0; HUT36137A; NL8400979A; GR79900B; ATA93784A; AT383613B; CA1211434A; JPH031957B2; FR2543554B1; AU558243B2; IE840694L; GB2137201A; JPS59187793A; FI841124A; DK146984A; HU194903B; SE8401664L; FI841124A0; BE899254A

Description

Zum Reinigen von Tylosin wird Tylosin aus einer Fermentationsbrühe mit einem Lösungsmittel extrahiert und auf einen pH-Wert von 8 bis 9,5 eingestellt, und die so gebildete Tylosinbase wird dann als solche abgetrennt, nachdem man sie in ein Salz überführt hat.

Bei den üblichen Reinigungsverfahren zur Gewinnung von reinem Tylosin ist es sehr schwierig, eine vollständige Eliminierung der Verunreinigungen zu bewirken. Infolgedessen ist auch die Qualität der auf dem Markt befindlichen Produkte häufig unbefriedigend, weil die Gewinnung des Tylosins aus Fermentationsbrühen mit niedrigem Gehalt an Verunreinigungen im großtechnischen Maße mit einem vernünftigen Aufwand bisher nicht möglich war. Entweder der Titer des Tylosins stimmte nicht oder die analytischen und organoleptischen Eigenschaften des Produktes waren unbefriedigend.

Es liegt somit ein Bedürfnis vor, ein effizientes und großtechnisch durchführbares Verfahren zur Gewinnung von reinem Tylosin zur Verfügung zu stellen. Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein großtechnisch durchführbares Verfahren zur Gewinnung von reinem Tylosin zu zeigen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch gelöst.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die das Tylosin enthaltende Fermentationsbrühe filtriert und dann wird der pH-Wert des Filtrates mit wäßriger NaOH-Lösung auf 7,5 bis 10 eingestellt. Anschließend erfolgt die Adsorption des Tylosins aus der Lösung an einem adsorbierenden Polymerharz. Geeignete Polymerharze sind solche vom Typ Amberlite^(R) (XAD₂ und XAD₄); Daion^(R) (HP 20, HP 21, HP 30, HP 40, HP 50); Dulite^(R) (S 861, S 862, S 863, S 866); Kastel^(R) (S 112) oder Lewatit^(R) (OC 1031).

In dieser Stufe wird bei den angegebenen pH-Werten der Großteil der in der Fermentationsbrühe vorhandenen gefärbten Verunreinigungen mit dem Effluenz entfernt und die Tylosinbase wird an das adsorbierende Polymerharz adsorbiert. Dabei erfolgt die Adsorption der Base an das Harz in einer Menge von 40 bis 50 g/l. Das adsorbierende Polymerharz kann für eine nachfolgende Reaktion nach Durchführung des Desorptionsschrittes wiederverwendet werden. Nach 20 bis 30 Arbeitszyklen, natürlich in Abhängigkeit von der Art der in der Fermentationsbrühe vorhandenen Verunreinigungen, ist es notwendig, das Harz zu regenerieren. Dies ist möglich, indem man das Harz mit einer Mischung aus Wasser : Isopropylalkohol (70 : 30) mit einem Gehalt von 4% NaOH wäscht.

Das Eluieren der Tylosinbase von dem Harz erfolgt mit einer Mischung von Wasser : Isopropanol oder Wasser : Aceton im Verhältnis 1 : 1.

Das nach dem Eluieren erhaltene Eluat wird dann über einem makroretikulären, schwach anionischen Harz filtriert. Geeignete makroretikuläre, schwach anionische Harze sind solche vom Typ IRA 35^(R), Lewatit^(R) (Ca 9222) oder Kastel^(R) (A-105). Nach dem Konzentrieren des Filtrates, was gewöhnlich durch Eindampfen im Vakuum erfolgt, wird der pH-Wert des konzentrierten Filtrates auf 8,5 eingestellt. Beim Aussalzen des Tylosins aus der Lösung mit Natriumchlorid erhält man die Tylosinbase in einer Ausbeute von etwa 80%.

Die Isolierung des Tylosins erfolgt dann in üblicher Weise. Durch Zugabe einer stöchiometrischen Menge an Weinsäure oder Phosphorsäure, wobei die Tylosinbase dann in die entsprechenden Salze überführt wird, kann man diese dann in reiner Form durch Sprühtrocknen aus der diese Salze enthaltenden Lösung gewinnen.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1 Reinigung von Tylosinbase

440 kg Fermentationsbrühe wurden mit einem Filtrierhilfsmittel versetzt und dann auf einem Rotationsfilter filtriert. Die so erhaltene filtrierte Brühe (615 l) mit einer 94%igen Ausgangsaktivität wurde durch Zugabe von 20% NaOH auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und über eine Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 l/h (Volumen des Harzes 100 l; Durchmesser der Säule 22,5 cm, mit einem extrahierenden Polymerharz ER-180^(R) gefüllt) geschickt. Die ablaufende Brühe zeigte beim Titrieren keinerlei Aktivität. Die Säule wurde dann mit 200 l Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 l/h gewaschen; das Wasser dieses Waschvorganges wies keinerlei Aktivität auf. Danach wurde die Säule mit einer Mischung von Wasser : Isopropylalkohol oder Wasser : Aceton im Verhältnis 1 : 1 eluiert und nach Entfernung von 50 l Vorlauf, der keine Aktivität aufwies, wurden schließlich 100 l mittleres Eluat, das 90% der Anfangsaktivität aufwies, gesammelt.

Dieses Eluat wurde konzentriert und anschließend in einer Säule an einem makroretikulären, schwach anionischen Harz (IRA 35^(R)), welches vorher mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 l/h in ein Salz überführt worden war, adsorbiert.

Das so erhaltene entfärbte Eluat wurde auf +10°C erwärmt und durch Zugabe einer wäßrigen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von etwa 8,5 gebracht; anschließend wurden 4,5 kg Natriumchlorid zugegeben.

Nach Rühren während 2 h bei 35°C wurde die ausgefällte Tylosinbase durch ein Büchner-Filter filtriert und mit 8 l Wasser mit einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 45°C gewaschen. Die gewaschene Schicht wurde im Vakuum 8 h bei 45°C und anschließend im Hochvakuum 6 h getrocknet.

Die Ausbeuten, bezogen auf die nützliche Anfangsaktivität, betragen etwa 80% Tylosinbase entsprechend den üblichen Spezifikationen.

Beispiel 2 Herstellung von Tylosintartrat (neutral)

1 kg gereinigte Tylosinbase, erhalten gemäß Beispiel 1, wurde in 3,0 l Methylalkohol suspendiert und mit 0,066 kg Weinsäure und 0,05 kg Aktivkohle versetzt. Nach Rühren während 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung über einem Filtrierhilfsmittel (Dicalcite, 0,10 kg) filtriert, mit 1,0 l Methanol gewaschen und das Filtrat im Vakuum (Temperatur der Dämpfe 20 bis 25°C) zur Trockne konzentriert.

Der so erhaltene trockene, bröckelige Rückstand wurde im Heizschrank im Vakuum 3 h bei 50°C weiter getrocknet und dann gesiebt. Es wurden 911,5 g Tylosintartrat mit 98,5% nützlicher Aktivität erhalten.

Beispiel 3

520 kg Fermentationsbrühe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, um das entfärbte und gereinigte Eluat zu erhalten. Das Eluat wurde mit 396 g Weinsäure versetzt und auf den pH-Wert 6,0 bis 6,4 gebracht. Danach wurden der Reaktionsmischung 300 g Aktivkohle zugegeben, wobei die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren gehalten wurde. Nach Filtrieren mit einem Filtrierhilfsmittel (Dicalcite) wurde die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von etwa 25 l eingeengt und dann sprühgetrocknet. Es wurden 4400 g Tylosintartrat mit 98% nützlicher Aktivität erhalten.

Beispiel 4

490 kg Fermentationsbrühe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei die Adsorption an 100 l Kastel^(R)-Harz erfolgt.

Nach Waschen des Harzes mit entionisiertem Wasser wurde die Tylosinbase mit 300 l einer Mischung von Aceton : Wasser im Verhältnis 2,3 : 1 eluiert.

100 l mittleres Eluat wurden gesammelt und mit einer 12%igen H₃PO₄-Lösung bis zu pH 5,5 in Salzform überführt und anschließend im Vakuum bis auf 10 l eingeengt, wobei eine konzentrierte Lösung entsprechend 500 g Tylosinphosphat erhalten wurde.

Claims

Verfahren zur Gewinnung von reinem Tylosin oder dem Tartrat oder Phosphat davon, dadurch gekenn zeichnet, daß man die folgenden Stufen durch führt:
Filtrieren der Tylosin enthaltenden Fermentationsbrühe;
Einstellen des pH-Wertes des Filtrats durch Zugabe von wäßriger NaOH-Lösung auf 7,5 bis 10;
Adsorbieren des Tylosins aus der Lösung an ein adsorbie rendes Polymerharz;
Eluieren der Tylosinbase von dem Harz mit einer Mischung von Wasser : Isopropanol oder Wasser : Aceton im Verhält nis 1 : 1;
Filtrieren des Eluats über ein makroretikuläres schwach anionisches Harz;
Konzentrieren des Filtrats;
Einstellen des pH-Wertes des konzentrierten Filtrats auf 8,5;
Aussalzen des Tylosins aus der Lösung mit Natriumchlorid; und
Isolieren des gereinigten Tylosins als solches oder durch Zugabe einer stöchiometrischen Menge an Weinsäure oder Phosphorsäure und Überführung der Tylosinbase in die ent sprechenden Salze, die dann in reiner Form durch Sprüh trocknen der sie enthaltenden Lösungen isoliert werden.