CH660012A5

CH660012A5 - Procedimento per la purificazione della tilosina.

Info

Publication number: CH660012A5
Application number: CH1516/84A
Authority: CH
Inventors: Ernesto Oppici; Rosa Onorino Giacoma; Carlo Varesio; Giovanni Lazzari; Danillo Fabris
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1983-03-30
Filing date: 1984-03-26
Publication date: 1987-03-13
Also published as: IE840694L; FI841124A; DE3410180A1; SE456913B; IL71303A; CA1211434A; GB8407294D0; FI841124A0; IL71303A0; DE3410180C2; DK146984A; GB2137201B; FI77471B; IT1194181B; IT8320359A0; BE899254A; DK146984D0; IT8320359A1; AU2588984A; AT383613B

Description

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la purificazione della Tilosina mediante adsorbimento selettivo su resine polimeriche. Di norma, come riportato dalla letteratura sia scientifica che brevettuale , la Tilosina base viene estratta dai brodi di fermentazione, previamente portati ad un pH 8,5, a mezzo di solventi organici clorurati quali il diclorometano o il cloroformio o non clorurati quali il metil-isobutilchetone.

Gli estratti organici riuniti vengono poi concentrati sotto vuoto e, dopo decolorazione con carbone attivo, la Tilosina base viene precipitata per aggiunta di n-esano.

Alternativamente, la Tilosina base può essere trasferita dall'estratto organico in una fase acquosa come sale solubile, per opportuna neutralizzazione con acidi organici od inorganici (tartarico o fosforico). La soluzione acquosa contenente i sali solubili di Tilosina viene successivamente portata a secco sotto vuoto (spry drier) permettendo infine l'isolamento dell'antibiotico sotto forma del sale dell'acido impiegato.

' Con i metodi precedentemente descritti, non si riesce però ad ottenere una completa eliminazione delle impurezze a volte presenti anche in quantità notevoli nei brodi di fermentazione con il risultato che, in dipendenza della natura di dette impurezze (prodotti coloranti o sottoprodotti di fermentazione), la qualità del prodotto finito è spesso carente sia per il titolo che per i suoi caratteri analitici ed organolettici.

Scopo della presente invenzione è quello di eliminare gli inconvenienti sopra elencati e di descrivere un nuovo procedimento di purificazione della Tilosina che, pur nella sua semplice attuabilità, possa fornire un prodotto conforme ai capitolati di analisi per esso stabiliti.

Il procedimento di purificazione secondo l'invenzione è caratterizzato dal fatto che detta purificazione viene effettuata mediante adsorbimento selettivo della Tilosina contenuta nei brodi di fermentazione, su resine polimeriche, per esempio su di una resina adsorbente ER-180 (R) (Rohm and Haas) o su altri tipi di resine polimeriche quali quelle del tipo Amberlite® (XAD2; XAD4- Rohm and Haas); tipo Daion® (HP 20; HP 21; HP 30; HP 40; HP 50 - Mitsubishi); tipo Duolite® (S 861; S 862, S 863; S 866- Diamond Shamrock); tipo Kastel® (S 112 - Montedison); Lewatite® (OC 1031 - Bayer A.G.)

È quindi evidente al tecnico dell'arte che la peculiarità del procedimento di purificazione dipende anche o soprattutto nel-l'aver individuato le condizioni di adsorbimento, gli adatti solventi o miscele di solventi usati per il de-adsorbimento, l'intervallo utile di pH, le ulteriori manipolazioni necessarie all'ottenimento di un prodotto finale corrispondente alla norma.

Con il nuovo procedimento di purificazione che qui brevemente descriviamo e che sarà più estesamente illustrato negli Esempi, il brodo di fermentazione, contenente la Tilosina e previamente filtrato, viene portato a pH 7,5-10 per aggiunta di soluzione acquosa di NaOH e fatto adsorbire sulla resina polimerica.

Nei valori citati di pH la maggior parte delle impurezze colorate presenti nel brodo viene eliminato con l'effluente, mentre la Tilosina base rimane adsorbita sulla resina. È importante notare, e questo è un altro vantaggio del metodo, che la capacità di adsorbimento della resina per il prodotto è molto elevata (40-50 g/1) e che dopo il de-adsorbimento, che viene effettuato a mezzo di una soluzione idro-alcolica o idro-acetonica, la resina può essere ancora usata per una successiva operazione. È solo dopo 20-30 cicli operativi, in dipendenza anche della natura delle impurezze contenute nel brodo di fermentazione, che si rende necessaria una rigenerazione della resina stessa che viene facilmente effettuata a mezzo di una miscela acqua : isopropanolo 70 : 30 e NaOH al 4%. Il de-adsorbimento dalla resina della Tilosina base viene effettuato, come sopra accennato, a mezzo di una miscela di acqua : isopropanolo od acqua : acetone normalmente nei rapporti 1:1.

L'eluato così ottenuto viene poi fatto passare per una ulteriore e completa decolorazione, su di una resina anionica debole macroreticolare del tipo IRA 35(5) (Rohm and Haas).

Possono anche essere indifferentemente impiegate resine del tipo Lewatite® (CA 9222 - Bayer) o Kastel® (A-105-Montedi-son). Dall'eluato, previa concentrazione nel vuoto e successiva correzione del pH, la Tilosina base viene precipitata par salatura con una resa di circa F80%.

Dalla Tilosina base così purificata è possibile ottenere i sali (tartrato, fosfato), salificandola in ambiente idroalcolico con la quantità stechiometrica di acido e portando a secco la soluzione dopo filtrazione con carbone decolorante. Alternativamente è possibile ottenere detti sali per salificazione diretta dell'eluato purificato e portando a secco (spry drier) la soluzione. Gli Esempi che seguono illustrano ma non limitano il procedimento dell'invenzione.

Esempio 1 Purificazione della Tilosina base

Kg 440 di brodo di fermentazione, previa aggiunta di Dica-lite (3%), vengono filtrati su filtro rotativo. Il brodo filtrato ottenuto, pari a 1 615 e contenente il 94% dell'attività utile di partenza, viene portato a pH 7,5 per aggiunta di NaOH al 20% e fatto quindi adsorbire su di una colonna di resina ER - 180® (Rohm and Haas) alla portata di 150 1/h. (Volume resina 1 100, 0 22,5 cm.) Il brodo esaurito, titolato, non contiene attività. La colonna viene successivamente lavata con 1 200 di acqua, alla portata di 150 1/h: anche l'acqua di questo lavaggio non contiene attività. Si eluiscono con una miscela di acqua : isopropa-

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nolo o acqua : acetone nei rapporti 1 : 1 e, dopo aver eliminato 1 50 di teste che non contengono attività, si raccolgono infine 1 100 di eluato cuore che contiene il 90% dell'attività di partenza. Detto eluato viene concentrato e fatto successivamente passare su di una colonna di resina (120) IRA 35® (Rohm and Haas) previamente salificata alla portata di 201/h. L'eluato decolorato, così ottenuto, viene raffreddato a + 10°C: si porta il pH a circa 8,5 a mezzo di soluzione acquosa di NaOH e si aggiungono kg 4,5 di sodio cloruro.

Dopo 2 ore di agitazione a +35°C, si filtra su Büchner la Tilosina base precipitata e si lava con 1 8 di acqua avente pH 8,5 ed una temperatura di +45°C. Il pannello lavato viene essiccato sotto vuoto umido a +45°C per 8 ore ed a vuoto secco per 6 ore. La resa, calcolata sull'attività utile di partenza, è di circa l'80% in Tilosina base corrispondente alla norma.

Esempio 2

Preparazione della Tilosina tartrato (neutro)

Kg 1,0 di Tilosina base purificata, ottenuta come descritto nell'Esemio 1, vengono sospesi in 1 3,0 di alcole metilico. Alla sospensione si aggiungono kg 0,066 di acido tartarico e kg 0,05 di carbone attivo. Dopo 30 minuti di agitazione a temperatura ambiente, si filtra su Dicalite (kg 0,10), si lava il pannello con 11,0 di metanolo e si concentra il filtrato sotto vuoto (temperatura dei vapori +20° + 25°C) sino a secchezza.

Il residuo secco, friabile, così ottenuto viene ulteriormente essiccato in stufa sotto vuoto secco per 3 ore a + 50°C e successivamente setacciato. Si ottengono g 911,5 di Tilosina tartrato a titolo 98,5% come attività utile.

Esempio 3

Kg 520 di brodo di fermentazione vengono trattati, come descritto nell'Esempio 1, sino ad ottenimento dell'eluato decolorato e purificato. Si aggiungono all'eluato g 396 di acido tartarico portando il pH a 6,0-6,4. Si aggiungono successivamente g 300 di carbone attivo e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo filtrazione su Dicalite, si concentra la soluzione sotto vuoto sino ad un volume di circa 1 25 e la 5 si porta poi completamente a secco a mezzo di spry drier. Si ottengono g 4400 di Tilosina tartrato a titolo 98% come attività utile.

Esempio 4

io Kg 520 di brodo di fermentazione vengono trattati, come descritto nell'Esemoio 1, sino all'ottenimento dell'eluato cuore. Detto eluato viene successivamente concentrato sotto vuoto sino 1 70 eliminando contemporaneamente isopropanolo nelle teste. Si aggiungono 1 35 di cloruro di metilene e si porta il pH a 15 8,5 per aggiunta di una soluzione acquosa di NaOH al 20%. Dopo agitazione per 15 minuti, l'estratto organico viene separato, concentrato sotto vuoto sino a 1 9,0 ed addizionato, sotto agitazione, di 1 30,0 di cicloesano.

Si mantiene sempre in agitazione ad una temperatura di 20 + 10°/+ 15°C per circa 3 ore e si filtra il prodotto precipitato che viene infine essiccato sotto vuoto a +40°C per 4 ore.

Si ottengono g 4600 di Tilosina base a titolo 95% come attività utile.

25 Esempio 5

Kg 490 di brodo di fermentazione vengono trattati come descritto nell'Esempio 1 effettuando l'adsorbimento su 1 100 di resina Kastel® S 112.

Dopo lavaggio della resina con acqua deionizzata, la Tilosi-30 na base viene eluita con 1 300 di una miscela di acetone : acqua nei rapporti di 2,3 : 1 alla velocità di 1,5 B/v/h.

Si raccoglie un eluato cuore di 1 100 che viene salificato con soluzione di H3PO4 al 12% sino ad un pH di 5,5 e concentrato successivamente sotto vuoto sino a 1 10 per ottenere una solu-35 zione concentrata corrispondente a g 5000 di Tilosina fosfato.

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Claims

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1. Procedimento per la purificazione della Tilosina, caratterizzato dal fatto che detta purificazione viene effettuata mediante adsorbimento selettivo, su resine polimeriche, della Tilosina contenuta nei brodi di fermentazione.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che i brodi di fermentazione previamente filtrati, vengono portati ad un pH compreso tra 7,5-10,0, mediante aggiunta di soluzione acquosa di NaOH, prima di essere fatti assorbire sulla resina polimerica.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, previo lavaggio con acqua della resina polimerica, la Tilosina base adsorbita viene successivamente eluita a mezzo di una miscela acqua : isopropanolo 1 : 1 (v/v), acqua acetone 1 : 1 (v/v) o acqua : acetone 1 : 23 (v/v).

4. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 1-3, caratterizzato dal fatto che, per ottenere una più completa decolorazione ed eliminazione di particolari impurezze, l'eluato viene ulteriormente filtrato su di una resina anionica debole macroreticolare ed il filtrato ottenuto, previa concentrazione ed aggiustamento del pH a circa 8,5, viene addizionato con sodio cloruro per permettere la precipitazione della Tilosina base pura.

5. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 1-4, caratterizzata dal fatto che, dopo il passaggio sulla resina debole anionica, la Tilosina base contenuta nel filtrato viene estratta e trasferita in una fase organica costituita da diclorometano da cui viene isolata come tale per successiva aggiunta di n-esano o cicloesano.

6. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che, il filtrato ottenuto dopo il passaggio dell'eluato idro-alcolico o idro-acetonico sulla resina anionica, viene addizionato della quantità stechiometrica di acido tartarico o di acido fosforico in modo da ottenere la trasformazione della Tilosina base nei rispettivi sali che vengono isolati allo stato puro portando a secco la soluzione che contiene.