CH653341A5 - Verfahren zur reinigung von s-adenosyl-l-methionin. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin, das im nachstehenden abgekürzt mit «SAM» bezeichnet wird, insbesondere auf ein Verfahren zur wirksamen Abtrennung von SAM hoher Reinheit aus einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit.
SAM ist eine wichtige Substanz, die am Metabolismus in vivo in Fetten, Proteinen und Kohlenhydraten teilnimmt. Letzthin wurde gefunden, dass SAM therapeutische Wirkung auf Jecur adiposum, Lipämie, Arteriosclerose, Depressionen und Schlaflosigkeit hat, und es ist daher erwünscht, SAM in grossen Mengen herzustellen.
Bisher sind viele Methoden zur Reinigung von SAM bekannt. Spezifische Beispiele sind (1) ein Verfahren, das eine Kombination einer Stufe der Behandlung einer SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz und einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit Aktivkohle umfasst, wie in der JP-AS 13680/1971 beschrieben; (2) ein Verfahren, das die Behandlung einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz umfasst, wie in «Enzymologia», Bd. 29, S. 283 beschrieben; (3) ein Verfahren, das eine Kombination einer Stufe der Behandlung einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz vom H+-Typ und einer Stufe der Behandlung der Flüssigkeit mit Aktivkohle umfasst, wie in der JP-OS 145299/1982 beschrieben; (4) ein Verfahren, das die Behandlung einer rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit mit einem Chelatharz umfasst, wie in der JP-AS 20998/1978 beschrieben; und (5) ein Verfahren, das über ein Salz von SAM mit Pikrin- oder Pikrolonsäure verläuft, wie in den US-PS 3 707 536 und 3 954 726 beschrieben.
Das vorstehend genannte Verfahren (2) ist hinsichtlich Verfahrensstufen einfacher und wirtschaftlicher als die Verfahren (1), (4) und (5), zeigt jedoch den Nachteil, dass die Abtrennung von SAM von Verunreinigungen und fremden Materialien unvollständig ist und kein SAM der für die Verwendung als Arzneimittel benötigten hohen Reinheit erhalten werden kann.
Nach dem Verfahren (3), das eine Verbesserung des Verfahrens (1) darstellt, wird SAM höherer Reinheit erhalten, da jedoch die Adsorption von SAM auf Aktivkohle stark ist, wird die Gewinnung von SAM vermindert. Die Bestrebung, dass Gewinnungsverhältnisse von SAM durch Erhöhung des Mengenanteils an organischen Lösungsmitteln in einem Eluierungsmittel zu verbessern, führt leider zu ungenügender Trennung von SAM von Verunreinigungen und fremden Materialien.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, nach welchem SAM hoher Reinheit wirksam isoliert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im Patentanspruch 1 definierte Verfahren gelöst.
Das Verfahren zur Herstellung einer im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendeten, rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit unterliegt keinen besonderen Einschränkungen. Diese Herstellung kann beispielsweise erfolgen durch Kultivierung eines zur Produktion von SAM befähigten Mikroorganismus des Genus Saccharomyces, Candida oder Mucor in einem Methionin enthaltenden Kulturmedium zur Bildung und Akkumulierung von SAM innerhalb und/oder ohne die mikro-biellen Zellen und Extraktionen der Kulturbrühe mit einem Ex-traktionsmittel, wie Perchlor-, Salz-, Schwefel- oder Ameisensäure; oder durch enzymatische Reaktion von Adenosin-triphos-phat und Methionin in Gegenwart von Methionin/Adenosyl-Transferase.
Im erfindungsgemässenVerfahren ist es wesentlich, dass eine rohes SAM enthaltende Flüssigkeit gereinigt wird, indem sie einem Mehrstufen-Reinigungsprozess unterzogen wird, der in beliebiger Reihenfolge mindestens eine Stufe (A) der Behandlung der Flüssigkeit mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz von H+-Typ und mindestens eine Stufe (B) der Behandlung der Flüssigkeit mit einem porösen, synthetischen Harz-Ad-sorptionsmittel umfasst.
Die Behandlung (A) kann folgndermassen ausgeführt werden:
Zuerst wird der pH-Wert der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit üblicherweise auf 3,5 - 6,5, vorzugsweise 4 - 6,5, eingestellt. Wenn dieser pH-Wert zu niedrig ist, wird SAM schwierig auf dem Kationenaustauscherharz adsorbiert. Wenn dieser pH-Wert zu hoch ist, kann SAM zersetzt werden. Die Methode der Einstellung des pH-Wertes unterliegt keinen besonderen Einschränkungen. Vorzugsweise erfolgt die Einstellung des pH-
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Wertes unter Verwendung einer Kombination einer Säure und eines zur Bildung einer in Wasser schlecht oder nicht löslichen Ausfällung, oder eines Anionenaustauscherharzes von OH--Typ.
Bei Kontaktierung der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit, deren pH-Wert wie vorstehend beschrieben eingestellt wurde, mit dem.schwachsauren Kationenaustauscherharz vom H+-Typ, wird das SAM mit positiver Ladung selektiv am Kationenaustauscherharz adsorbiert. Die in der Flüssigkeit vorhandenen Verunreinigungenn mit neutraler und negativer Ladung werden am Harz nicht adsorbiert.
Als schwachsaures Kationenaustauscherharz kann jedes beliebige derartige Harz verwendet werden, das Carbonsäuregruppen als Ionenaustauschergruppen aufweist. Spezifische derartige Harze sind beispielsweise «Amberlite» IRC-50 und IRC-80 von Rohm & Haas Co., und «Diaion» KW20 von Mitsubishi Chemical Co., Ltd. Die Kontaktierung kann ansatzweise oder durch eine Säulenbehandlung erfolgen. Bevorzugt wird die Säulenbehandlung, da sie gut ausführbar ist und die Verunreinigungen leicht entfernt werden.
Das am Ionenaustauscherharz adsorbierte SAM wird dann abgetrennt durch fraktionelle Eluierung des Harzes mit einer wässrigen Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit einem pH-Wert von üblicherweise nicht mehr als 3,0, vorzugsweise 0,2 - 2,0. Die verwendete Säure unterliegt keinen besonderen Einschränkungen und kann beispielsweise Salz-, Schwefel-, Essig- oder p-Toluolsulfonsäure sein. Nötigenfalls kann das Ionenaustauscherharz vor der fraktionellen Eluierung von SAM mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen Lösung einer Säure, beispielsweise mit pH-Wert 3,5 oder mehr, zur Entfernung von darin befindlichen Spuren von Verunreinigungen gewaschen werden.
Die Behandlungsstufe (B) kann folgendermassen ausgeführt werden:
Zuerst wird die rohes SAM enthaltende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6,5 oder weniger eingestellt und danach mit dem porösen, synthetischen Harz-Adsorptionsmittel in Berüh-' rung gebracht. Die Einstellung des pH-Wertes und die Kontaktierung können auf gleiche Art erfolgen, wie vorstehend für die Behandlungsstufe (A) beschrieben. Die Kontaktierung mit dem Adsorptionsmittel führt zu selektiver Adsorption von Aminen, dem Zersetzungsprodukt Methylthioadenosin von SAM, und von Färbungen, die in der Flüssigkeit fremde Materialien darstellen. Durch Auswahl von im nachstehenden beschriebenen Bedingungen, können SAM und die fremden Materialien zusammen am Adsorptionsmittel adsorbiert werden. In diesem Fall kann SAM selektiv abgetrennt werden durch fraktionelle Eluierung des Adsorptionsmittels mit einer wässrigen Lösung einer anorganischen oder organischen Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 - 2,0.
Hierfür können beliebige der vorstehend für die Behandlungsstufe (A) genannten anorganischen und organischen Säuren verwendet werden. Zusammen mit der anorganischen oder organischen Säure kann organisches Lösungsmittel unter der Voraussetzung eingesetzt werden, dass dessen Mengenanteil eine einheitliche Lösung ermöglicht. Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Methylethylketon, Methylformiat, Ethyl-acetat, Dioxan, Toluol. Gewünschtenfalls kann wie in der Behandlungsstufe (A), das Adsorptionsmittel vor der fraktionellen Eluierung mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen Lösung einer Säure gewaschen werden, um Spuren von darin enthaltenen Verunreinigungen zu entfernen.
Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete poröse, synthetische Harz-Adsorptionsmittel ist wasserunlöslich und zeigt eine Riesen-Netzwerkstruktur. Spezifische Beispiele hierfür sind nichtpolare Adsorptionsmittel auf Basis eines Styrol/ Divinylbenzol-Copolymers als Matrix, wie «Amberlite» XAD-2
und XAD-4 von Rohm & Haas Co., und «Diaion» HP-10, HP-20 HP-30, HP-40 und HP-50 von Mitsubishi Chemical Co., Ldt.; und mässig polare Adsorptionsmittel auf Basis eines Polymers eines Acrylsäureesters und/oder eines Methacrylsäure-esters oder eines Copolymers solcher Monomere mit einem nichtpolaren Monomer, wie Styrol und Divinylbenzol als Matrix, wie «Amberlite» XAD-7 und XAD-8 von Rohm & Haas Co., und «Diaion» HP-ZMG, von Mitsubishi Chemical Co., Ldt. Gewünschtenfalls können solche Adsorptionsmittel in Kombination eingesetzt werden.
Derartigen Adsorptionsmitteln ist gemeinsam, dass sie in der rohes SAM enthaltenden Flüssigkeit vorhandene fremde Materialien, wie Amine und Färbungen, selektiv adsorbieren. Sie zeigen jedoch in Abhängigkeit vom jeweiligen Typ selektive Adsorptionsfähigkeit für SAM. Spezifisch adsorbieren nichtpolare Adsorptionsmittel fremde Materialien, nicht jedoch SAM, und mässig polare Adsorptionsmittel adsorbieren im relativ schwachsauren Bereich SAM zusammen mit den fremden Materialien, im relativ stark sauren Bereich jedoch nur die fremden Materialien, ohne SAM zu adsorbieren.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Behandlungsstufen (A) und (B) mindestens je einmal ausgeführt, wobei deren Reihenfolge freisteht. Bevorzugte Beispiele der Reihenfolge sind (1) zuerst (A) und dann (B); (2) zuerst (B) und dann (A); (3) zuerst (A), dann (B) und danach (A); und (4) zuerst (B), dann (A) und danach (B). Ausser diesen Beispielen kann bzw. können zusätzlich die Behandlungsstufe (A) und/ oder die Behandlungsstufe (B) hinzugefügt werden. Mit zunehmender Anzahl Behandlungsstufen wird natürlich die Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens zunehmend vermindert.
Falls die Behandlungsstufe (B) vor der Behandlungsstufe (A) ausgeführt wird, ist es verfahrensmässig vorteilhaft, solche Bedinungen anzuwenden, dass am synthetischen Harz-Adsorp-tionsmittel nur selektiv die Verunreinigungen, jedoch nicht SAM adsorbiert werden. Spezifische derartige Bedingungen sind beispielsweise die Verwendung eines nichtpolaren Adsorptionsmittels oder die Verwendung eines mässig polaren Adsorptionsmittels in einen pH-Bereich von nicht mehr als 3,5, vorzugsweise 0,2 - 3,0.
Falls die letzte Behandlungsstufe die Stufe (B) ist, ist es möglich, am synthetischen Harz-Adsorptionsmittel zuerst SAM zu adsorbieren und dann abzutrennen, oder das SAM in dieser Stufe nicht am synthetischen Harz-Adsorptionsmittel zu adsorbieren.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren wie vorstehend beschrieben eluierte Lösung von SAM kann gewünschtenfalls unter vermindertem Druck konzentriert und danach mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, n-Pro-panol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol,, Methoxyethanol, Aceton, Methylethylketon, Methyl- oder Ethylformiat oder -acetat, Butylacetat, Dioxan, in Berührung gebracht werden. Hierbei kann eine Ausfällung eines Salzes von SAM und einer anorganischen oder organischen Säure erhalten werden. Alternativ kann ohne Kontaktierung der Lösung von SAM mit einem organischen Lösungsmittel ein Pulver oder ein Salz von SAM und einer anorganischen oder organischen Säure erhalten werden, indem die überschüssige Säure aus der Lösung von SAM unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes vom OH~-Typ oder eines zur Bildung eines wasserunlöslichen Salzes durch Reaktion mit der in der fraktionellen Eluierung von SAM verwendeten Säure befähigten Alkalis entfernt und danach das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bis zur Trockene aus der Lösung entfernt wird.
Das schwachsaure Ionenaustauscherharz vom H+-Typ wird zum Zeitpunkt regeneriert, wenn das SAM daraus eluiert ist. Es ist daher nicht immer notwendig, dieses Harz einer besonderen Regenerierungsbehandlung zu unterziehen. Es kann nur nach Waschen mit Wasser wiederholt eingesetzt werden. Andererseits
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kann das synthetische Harz-Adsorptionsmittel leicht regeneriert werden, beispielsweise durch Waschen mit einer 50%igen wässrigen Lösung von Methanol und danach mit Wasser.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann somit SAM sehr hoher Reinheit wirksam erhalten werden durch einfache Behandlungsschritte unter Verwendung von leicht regenerierbaren Substanzen.
Beispiel 1
Saccharomyces cerevisiae, IFO 2044, wurde zur Bildung von mikrobiellen Zellen mit darin akkumuliertem SAM in dem von F. Schlenk et al in «Journal of Biologica! Chemistry», Bd. 229, S. 10377 (1957) beschriebenen Kulturmedium kultiviert. Von den erhaltenen Zellen wurden 210 g in 1000 ml 1,5N Perchlorsäure suspendiert und unter Schütteln während 1 h bei Zimmertemperatur extrahiert. Dann wurden die Zellrückstände durch Zentrifugation abgetrennt. Dem Extrakt wurde zur Einstellung des pH-Wertes 5,0 Kalium-hydrogencarbonat zugesetzt. Die erhaltene Ausfällung von Kaliumperchlorat wurde abgenutscht, wobei 1080 ml eines 1,15 g SAM enthaltenden Extraktes erhalten wurden.
Der erhaltene Extrakt wurde zur Adsorption von SAM durch eine mit 200 ml des schwachsauren Kationenaustauscherharzes «Amberlite» IRC-50 vom H+-Typ gefüllte Säule geleitet. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure gewaschen und fraktionell mit 0,1N Schwefelsäure eluiert, wobei 630 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde mit dem schwachbasischen Anionenaustauscherharz «Amberlite» IRA-45 vom OH--Typ auf den pH-Wert 4,5 gestellt und dann durch eine mit 1,5 1 des synthetischen Harz-Adsorptionsmittels «Amberlite» XAD-7 gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 1 0,0001N Essigsäure gewaschen und dann mit 0,1N Schwefelsäure fraktionell eluiert, wobei 1440 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die Lösung von SAM wurde unter vermindertem Druck auf ein Gesamtvolumen von 200 ml konzentriert. Dann wurden 800 ml Aceton zugesetzt, wobei eine Ausfällung von SAM-Sulfat erhalten wurde. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in wenig Wasser gelöst und dann lyophilisiert, wobei 174 g SAM-Sulfat in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Silikagel-Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiel 2
Ein wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellter, 1,06 g SAM enthaltender Extrakt wurde durch eine mit 200 ml des schwachsauren Kationenaustauscherharzes «Amberlite» IRC-84 vom H + -Typ gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Salzsäure gewaschen und dann mit Salzsäure fraktionell eluiert, wobei 640 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde mit dem schwachbasischen Anionenaustauscherharz «Amberlite» IRA-45 vom OH--Typ auf den Wert 4,8 gestellt und dann durch eine mit 1,5 1 des synthetischen Harz-Adsorptionsmittels «Amberlite» XAD-7 gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 2 1 0,0001N Essigsäure gewaschen und dann durch Hindurchleiten eines Lösungsmittelgemisches von 0,1N Salzsäure und Aceton im Vol.-Verhältnis 1 : 0,1 fraktionell eluiert, wobei 1120 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden. Die erhaltene Lösung von SAM wurde unter vermindertem Druck auf ein Gesamtvolumen von 200 mml konzentriert und dann durch Zugabe des schwachbasischen Anionenaustauscherharzes «Amberlite» IRA-45 vom OH--Typ auf den pH-Wert
2,0 gestellt. Das Harz wurde abgenutscht und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde lyophilisiert, wobei 119 g SAM-Hydrochlorid in Form eines weissen Pulvers erhalten wurde. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Silikagel-Dünnschichtchromatogra-phie einen einzelnen Fleck.
Das Verhältnis der Gewinnung von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiel 3
Ein wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellter, 0,98 g SAM enthaltender Extrakt wurde durch eine mit 200 ml des Adsorptionsmittels «Amberlite» XAD-2 vom Styrol/Divinylbenzol-Typ gefüllte Säule geleitet, um fremde Materialien zu adsorbieren. Nach Entfernung der fremden Materialien wurde die Lösung von SAM durch Zugabe von Kalium-hydrogencarbonat auf den pH-Wert 5,0 gestellt. Die gebildete Ausfällung von Kaliumperchlorat wurde abgenutscht.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde durch eine Säule mit 200 ml des schwachsauren Kationenaustauscherharzes «Amberlite» RC-50 vom H+-Typ geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Essigsäure gewaschen und mit 0,1N Schwefelsäure fraktionell eluiert, wobei 630 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde unter vermindertem Druck auf ein Gesamtvolumen von 200 ml konzentriert und dann mit 800 ml Aceton versetzt, wobei SAM-Sulfat ausgefällt wurde. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in wenig Wasser gelöst unnd lyophilisiert, wobei 150 g SAM-Sulfat in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Silikagel-Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiel 4
Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehen wurden mi-krobielle Zellen mit darin akkumuliertem SAM hergestellt. Von den erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden 200 g in 1000 ml 0,1N Ameisensäure suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde während 10 min auf 60°C erwärmt und unmittelbar danach gekühlt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt, wobei 1020 ml eines 0,91 g SAM enthaltenden Extraktes erhalten wurden.
Der erhaltene Extrakt wurde durch eine Säule mit 200 ml des Acrylat-Adsorptionsmittels «Amberlite» XAD-8 geleitet, um fremde Materialien zu adsorbieren.
Nach Entfernung der fremden Materialien wurde die Lösung von SAM mit dem schwachbasischen Anionenaustauscherharz «Amberlite» IRA-45 vom OH-Typ auf den pH-Wert 5,0 gestellt und dann durch eine Säule mit 200 ml des schwachsauren Kationenaustauscherharzes «Amberlite» IRC-84 vom H+-Typ geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001N Salzsäure gewaschen und dann mit 0,2N Salzsäure fraktionell eluiert, wobei 710 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde mit dem schwachbasischen Anionenaustauscherharz «Amberlite» IRA-45 vom OH--Typ auf den pH-Wert 2,0 gestellt. Das Harz wurde abgenutscht und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wobei 1,01 g SAM-Hydrochlorid in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Silikagel-Dünnschicht-chromatographie einen einzelnen Fleck.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Beispiel 5
Von der gemäss Beispiel 3 durch Behandlung mit dem Sty-rol-Divinylbenzol-Adsorptionsmittel und dem schwachsauren Kationenaustauscherharz von H+-Typ erhaltenen Lösung von SAM wurden 630 ml durch eine mit 200 ml des Adsorptionsmittels «Amberlite» XAD-7 vom Acrylat-Typ gefüllte Säule geleitet, um fremde Materialien zu adsorbieren.
Nach Entfernung der fremden Materialien wurde die Lösung von SAM unter vermindertem Druck auf ein Gesamtvolumen von 200 ml konzentriert. Dann wurden 800 ml Aceton zugesetzt, um eine Ausfällung von SAM-Sulfat zu bilden. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugation abgetrennt und in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert, wobei 146 g SAM-Sulfat in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Silikagel-Dünn-schichtchromatographie einen einzelnen Fleck.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
Vergleichsversuch A
Der pH-Wert von 950 g des gemäss Beispiel 1 hergestellten, 0,98 g SAM enthaltenden Extraktes wurde mit Kalium-hydrogencarbonat auf 5,0 gestellt. Die gebildete Ausfällung von Kali-umperchlorat wurde abgenutscht, wobei eine SAM enthaltende Flüssigkeit erhalten wurde.
Die erhaltene, SAM enthaltende Flüssigkeit wurde durch eine mit 200 ml des schwachsauren Kationenaustauscherharzes «Amberlite» IRC-50 vom H+-Typ gefüllte Säule geleitet, um SAM zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 400 ml 0,0001 N Essigsäure gewaschen und dann mit 0,1N Sulfat fraktionell eluiert, wobei 610 ml einer Lösung von SAM erhalten wurden.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde durch eine mit 200 ml chromatographisch aktivierter Kohle gefüllte Säule geleitet. Die Säule wurde mit 600 ml 0,2N Schwefelsäure gewaschen und dann mit einem Lösungsmittelgemisch von 1,0N Schwefelsäure und Methanol im Vol.-Verhältnis 1 : 1 graktionell eluiert, wobei eine Lösung von SAM erhalten wurde.
Die erhaltene Lösung von SAM wurde unter vermindertem Druck auf ein Gesamtvolumen von 200 ml konzentriert. Dann wurden 800 ml Aceton zugesetzt, um SAM-Sulfat auszufällen. Die gebildete Ausfällung wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert, wobei 1,28 g SAM-Sulfat in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Produkt zeigte in Papierchromatographie und Si-likagel-Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck.
Das Gewinnungsverhältnis von SAM und dessen Reinheit sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Vergleichsversuch B Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, dass für die Reinigungsbehandlung nur die Behandlung mit «Amberlite» IRC-50 vom H+-Typ ausgeführt wurde.
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 1
Beispiel
Reinheit
Ninhydrin
Mengen
Gewinnungs bzw.
von SAM,
reaktion anteil verhältnis
Vergi.
% *
mit anderen
Methylthio von SAM,
Vers.
Materialien adenosin,
Gew.-%
als SAM **
Gew.-% ***
1
98,1
—
0,08
89
2
98,0
—
0,1
90
3
98,0
—
0,1
90
4
98,1
—
0,08
90
5
98,5
—
unterhalb
88
0,05
A
97,6
—
0,4
77
B
56,7
+ +
1,8
90
*: Die Reinheit von SAM wurde mittels zweidimensionaler Papierchromatographie bestimmt.
**: Die Ninhydrinreaktion mit anderen Materialien als SAM wurde folgendermassen bestimmt:
Ein Prüfmuster wurde mittels zweidimensionaler Cellulose-Dünnschichtchromatographie entwickelt und die durch Ninhy-drin-Farbbildung angezeigten anderen Flecke als ein Fleck von SAM wurden nach der folgenden Dreistufenskala bestimmt und ausgewertet:
—: keine
+ : geringfügig vorhanden + + : beträchtlich vorhanden
***: Der Mengenanteil Methylthioadenosin wurde mittels zweidimensionaler Papierchromatographie bestimmt.
Aus der Tabelle ist eindeutig ersichtlich, dass nach dem erfindungsgemässen Verfahren SAM höherer Reinheit in höherem GewinnungsVerhältnis erhältlich ist, als nach bekannten Verfahren.
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Claims (10)
- 653 3412PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin durch Einleitung einer rohes S-Adenosyl-L-methionin enthaltenden Flüssigkeit in ein Reinigungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reinigung in einem Mehrstufenverfahren ausführt, wobei man die Flüssigkeit in beliebiger Reihenfolge in mindestens einer Stufe (A) mit einem schwachsauren Kationenaustauscherharz vom H+-Typ und in mindestens einer Stufe (B) mit einem porösen, synthetischen Harz-Adsorptions-mittel behandelt.
- 2. Verfahren nach Anspruchl, dadurch gekennzeichnet,dass man in der Stufe (A) die Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 3,5 - 6,5 zur Adsorption von S-Adenosyl-L-methionin auf dem Harz mit dem Kationenaustauscherharz in Berührung bringt und danach aus dem Kationenaustauscherharz mittels einer wässrigen Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,0 fraktionell S-Adenosyl-L-methionin eluiert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeit in der Stufe (B) bei einem pH-Wert von nicht mehr als 6,5 mit dem synthetischen Harz-Adsorp-tionsmittel in Berührung bringt, um fremde Materialien aus der Flüssigkeit auf dem Harz zu adsorbieren.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Stufe (B) die Flüssigkeit mit einem pH-Wert von nicht mehr als 6,5 mit dem synthetischen Harz-Adsorbie-rungsmittel in Berührung bringt, um sowohl S-Adenosyl-L-methionin wie auch fremde Materialien aus der Flüssigkeit zu adsorbieren, und dass man danach aus dem synthetischen Harz-Adsorbierungsmittel unter Verwendung einer wässrigen Lösung einer Säure mit einem pH-Wert von nicht mehr als 3,5 fraktionell S-Adenosyl-L-methionin eluiert.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da§s man die Reinigung in der Reihenfolge der Stufen (A) und (B) ausführt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reinigung in der Reihenfolge der Stufen (A), (B) und (A) ausführt.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reinigung in der Reihenfolge der Stufen (B) und (A) ausführt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reinigung in der Reihenfolge der Stufen (B), (A) und (B) ausführt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Stufe (B) die Flüssigkeit mit einem pH-Wert von nicht mehr als 6,5 mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel in Berührung bringt, um nur fremde Materialien aus der Flüssigkeit zu adsorbieren.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in der ersten Stufe (B) die Flüssigkeit mit einem pH-Wert von nicht mehr als 6,5 mit dem synthetischen Harz-Adsorptionsmittel in Berührung bringt, um nur fremde Materialien aus der Flüssigkeit zu adsorbieren.
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