DE2021696C3

DE2021696C3 - Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C

Info

Publication number: DE2021696C3
Application number: DE2021696A
Authority: DE
Inventors: Walter Dr. Allschwil Voser (Schweiz)
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1969-05-13
Filing date: 1970-05-04
Publication date: 1979-08-02
Also published as: NL172563B; GB1303728A; CS160661B2; DK129464B; CH541579A; NL7006854A; AT297220B; US3725400A; DE2021696B2; YU86070A; DK129464C; CA960660A; JPS5416922B1; DE2021696A1; NL172563C; BE750292A; YU39104B; FR2044785B1; IE34125L; IE34125B1

Description

Tabelle 1

Austauschkapazität eines Anionenaustauschers
(Amberlite® IRA-68) für Cephalosporin C in Abhängigkeit von Begleit-Verunreinigungen

Cephalosporin	Verwendete	Maximal
lo C-haltige Ausgangs	Menge Ionenaus	absorbierte
lösung gleicher	tauscher	Menge
Konzentration	(Amberlite®	Cephalo
	IRA-68)	sporin C
1. filtrierte Kultur-	1000 ml	20-3Og
^!) lösung
2. praktisch reines	1000 ml	ca. 200 g
(90%iges) Cephalo
sporin C, gelöst in
¹⁰ Wasser

Die Isolierung hydrophiler Antibiotika aus Fermentationslösungen bietet oft große Schwierigkeiten, insbesondere, wenn das Antibiotikum neben anderen, ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften aufweisenden Stoffen vorhanden ist. Eine der in solchen Fällen angewendeten Methoden zur Isolierung schwach saurer oder schwach basischer Antibiotika besteht darin, daß man das Antibiotikum an Ionenaustauschern absorbiert. Diese Methode wird auch zur Isolierung von Cephalosporin C angewandt.

So kann Cephalosporin C mit Hilfe von Anionenaustauschern, beispielsweise Amberlite ® IR-4 B, gemäß DE-PS 10 14 711 von seinem Begleit-Antibioticum Cephalosporin N abgetrennt werden. Aus den Beispielen 2, 5,6,7 und 8 dieser Patentschrift geht aber hervor, daß die dabei erzielten Ausbeuten außerordentlich gering sind. Ein weiteres Problem stellt die Abtrennung des Cephalosporins C von den zahlreichen, in der filtrierten Kulturlösung vorhandenen organischen und anorganischen Anionen dar (vgl. US-Patent 31 84 454, Spalte 1, Zeile 53-65). Durch das in dem genannten US-Patent beschriebene Verfahren lassen sich jedoch nur die Anionen starker anorganischer Säuren, insbesondere Chloridionen, aus der Kulturlösung abtrennen, während das Problem der Abtrennung des Cephalosporins C von den organischen Begleitionen ungelöst bleibt. Wie aus der Einleitung der DE-PS 11 26 564 hervorgeht, sind auch zahlreiche weitere Versuche zur Abtrennung des Caphalosporins C mittels Ionenaustauschern ohne praktisch brauchbares Ergebnis geblieben.

Das indieserPatentschriftbeschriebene Verfahren ist gleichfalls sehr kompliziert, es benötigt verschiedene Ionenaustauscher, was sich nachteilig auf die Ausbeute von Cephalosporin C auswirkt, weil diese teils eine zu geringe bzw. zu wenig selektive Adsorpi.ionskapa/iiäi Die oben angeführten Schwierigkeiten haben zur Entwicklung einer Reihe weiterer Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus filtrierten Kultur-

n lösungen geführt. So wurde Cephalosporin C aus Kulturfiltrateii mittels üblicher, nichtionischer Adsorbentien wie Aluminiumoxid, Aktivkohle oder Kieselgel oder einer Kombination solcher Adsorbentien, mitunter auch unter vorheriger oder nachträglicher Anwendung weiterer Trennverfahren, isoliert. Wie aus den Beispielen 3 und 8 der DE-PS 10 14 711 hervorgeht, sind die dabei erzielten Ausbeuten an Cephalosporin durchweg unbefriedigend.
Als weitere Möglichkeit wurde vorgesehen, Eluate

■ti aus der Aktivkohlesäule, der Aluminiumoxidsäule oder der Säule mit Ionenaustauscherharz solchen Bedingungen in bezug auf Temperatur und Acidität auszusetzen, daß das im Kulturfiltrat enthaltene Penicillin N in die entsprechende Penicillansäure umgewandelt wird, das

■ίο Dephalosporin C jedoch praktisch unbeeinflußt bleibt, oder das Penicillin N unter der Einwirkung von Penicillinase zu zerstören und das Cephalosporin C dann durch fraktionierte Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Chromatographie mit einem Ionenaus-

> > tauschharz abzutrennen.

Auch dieses durch das L S-Patent 31 84 454 beschriebene Verfahren ergibt sehr geringe Ausbeuten und ist ungewöhnlich aufwendig.

Es ist auch bekannt, das aus Fermentationslösungen

bo durch Adsorption an einem Ionenaustauscher und nachfolgende Elution gewonnene Cephalosporin C zur weiteren Reinigung in das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz zu überführen und dieses nach chromatographischer Reinigung über einen Amberlite®-XE-58-

b-> Ionenaustauscher zu kristallisieren (vgl. Die Pharmazie, Bd. 18 [1963], S. 257). Man hat auch das in Wasser schwerlösliche Bariumsalz gewonnen, wobei die nachträgliche chroinatogniphische Trennung entfällt, das

Bariumsaiz aber wieder in das Natriumsalz zurückverwandelt weiden muß (DE-PS 10 14 711, Spalte 6, Zeile 41-55 und Beispiel 1).

Nach dieser verlustreichen Vorreinigung ist es nötig, anschließend große Mengen an wäßrigen Lösungen im Vakuum einzudampfen, da z. B. das Natriumsalz nur aus relativ konzentrierter, vorgereinigter Lösung kristallisiert, auch müssen wegen der guten Wasserlöslichkeit dieses Salzes weitere große Verluste bei der Auskristallisation in Kauf genommen werden (vgl. die Ausbeuteangaben in der DE-PS1014 711, Beispiele 3,4 und 7). So erhält man gemäß Beispiel 4 der DE-PS 10 14 711 aus 73 g eines rohen (bereits vorgereinigten) Cephalosporins C nur 168 mg, gemäß Beispiel 7 aus 600 mg rohem Cephalosporin C nur 39 mg (noch immer nicht reines) Cephalosporin C-Natriumsalz. Die erwähnten Verfahren sind außerdem ungewöhnlich aufwendig und umständlich.

Es ist praktisch auch nicht möglich, Cephalosporin C nach an sich bekannten Verfahren und in bei anderen verwandten Antibiotika, z. B. bei Penicillinen, wie Penicilline erfolgreich angewandter Weise (vgl. B r u η η e r und M a c h e k, Die Antibiotika, Bd. 1, Seite 335-339, 1962) aus wäßriger Phase, z. B. aus verdünnten Kulturfiltraten, mit organischen Lösungsmitteln zu extrahieren, weil Cephalosporin C ausgeprägt hydrophile Eigenschaften besitzt und daher sehr leicht in Wasser, aber kaum oder gar nicht in organischen Lösungsmitteln löslich ist (vgl. DE-PS 10 14 711, Spalte 1, Zeile 26-27, Spalte 10, Zeile 45-47). Dies wird in Tabelle 2 an Hand der antibiotischen Aktivität (gegenüber Vibrio cholerae) eines Kulturfiltrates von Cephalosporin C vor und nach Extraktion mit verschiedenen üblicherweise zur Extraktion verwendeten organischen Lösungsmitteln gezeigt. (Die Aktivität des nicht extrahierten Kulturfiltrats von wurde = 100% gesetzt.)

Tabelle 2

Antibiotische Wirkung eines wäßrigen Kulturfiltrats
von Cephalosporin C vor und nach
Lösungsmittelextraktion

pH-Wert des Kulturfiltrats bei der Extraktion

Verwendetes Extraktionsmittel

Nach Extraktion verbleibende antibiotische Aktivität in %

Diese Versuchsergebnisse bestätigen die Angaben in der DE-PS 10 14 711, Beispiel 1 und 4: Gemäß Beispiel 1

1 :1,5-Gemisch von Phenol und Chloroform	85 87
Benzylalkohol	90 114
Cyclohexanol	94 125
Cyclohexanon	78 79
n-Butanol	102 74
n-Propanol	104 99
Kontrolle (nicht extrahiert)	100

läßt sich Cephalosporin C im Verteilungssystem Wasser, gesättigt mit Phenol/Phenol, gesättigt mit Wasser/

Tetrachlorkohlenstoff^Ae-Trimethylpyridin/lON-H₂SO₄ bei 3⁰C nach 95 Übertragungen in der Craig-Apparatur nur etwa 8fach (absolut) bzw. 2^>fach (gegenüber Cephalosporin N) anreichern. Analog läßt sich Cephalosporine gemäß Beispiel 4 im System Phenol-gesättigtes Wasser/Wasser-gesättigtes Phenol/ Eisessig nach 100 Übertragungen nur 5fach (absolut)

ι ο bzw. ca. 3f ach (gegenüber Cephalosporin N) anreichern.

Die aus dem Stande der Technik für den Fachmann

naheliegenden Verfahren erwiesen sich demzufolge als wenig oder ungeeignet zur Lösung des technisch wichtigen Problems der Abtrennung und Reinigung von Cephalosporin C in großen Mengen.

Überraschend wurde nun gefunden, daß man Cephalosporin C aus Lösungen, in denen es im Gemisch mit aus der Fermentation stammenden Verunreinigungen vorliegt, mittels maktroporöser nichtionischer

>o Adsorptionsharze mit großer Oberfläche adsorbieren kann und daß sich damit insbesondere eine befriedigende Vorreinigung von Cephalosporin C-haltigen Fermentationslösungen erreichen läßt
Das methodisch einfache erfindungsgemäße Verfah-

r-, ren gestattet insbesondere eine hohe Anreicherung des Cephalosporins C aus den originären, stark verunreinigten und verdünnten (ca. 2 -3%igen) wäßrigen Xulturfiltraten in sehr hoher Ausbeute.
In Ergänzung der Angaben von Tabelle 1 läßt sich

jo durch einfache Vorbehandlung mit den erfindungsgemäß verwendeten Adsorptionsharzen die Austauschkapazität der üblichen Anionenaustauscher um das 4,3-8fache steigern und in die Nähe der Grenzkapazität für reine Cephalosporin C-Lösungen bringen

j-, (Tabelle 3).

Tabelle 3 (Ergänzung von Tabelle 1)

Austauschkapazität von Amberlite® IRA-68 für
Cephalosporin C bei Verwendung von mit nichtionogenen, makroporösen Adsorberharzen vorgereinigten
rohen, filtrierten Kulturlösungen

Cephalosporin C-haltige Ausgangs- ^A~> lösung gleicher Konzentration

Verwendete Maximal Menge Ionenaus- absorbierte

tauscher Menge

(Amberlite» Cephalo-

IRA-68) sporin C

3. filtrierte Kultur- 1000 ml 130-16Og

lösung, erfindungsgemäß vorgereinigt
mittels nichtionischem Adsorptionsharz

Durch diese Vorreinigung wird es daher möglich, wenn erwünscht, auch die bisher unbefriedigende Ionenaustauscher-Technik sinnvoll und ökonomisch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu kombinieren.

Die genannten Harze adsorbieren überraschenderweise das stark hydrophile Cephalosporin C quantitativ aus den erwähnten Lösungen, insbesondere den Fermentationslösungen, während sie den größten Teil der übrigen in der Lösung vorhandenen Stoffe nicht adsorbieren. Man kann auf diese Weise bis zu 85% der Verunreinigungen vom Cephalosporin C abtrennen und das adsorbierte Cephalosporin C nahezu quantitativ, /.. B. mit wäßrigen Alkoholen, cluieren. Die Kapazität

des Adsorptionsharzes kann durch vorherige extraktive Eliminierung lipophiler Verunreinigungen erhöht werden. Die Extraktion erfolgt vorzugsweise im sauren pH-Bereich, z.B. ca. 2, mit einem nut Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, oder vorzugsweise mit einem flüssigen Ionenaustauscher, z. B. »Amberlite« LA-2 in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch im pH-Bereich von ca. 2—7. Als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel kommen beispielsweise in ι ο Betracht aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch Halogenatome, wie Brom, Fluor, besonders Chlor, substituiert sind, z. B. Hexan, Heptan, Cyclohexan, Benzin, Petroläther (Kp. 110-140⁰C), Kerosen (Kp. 210-240⁰C, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Methylenchlorid, Methylchloroform, Äthylenchlorid, Perchloräthylen, Perfluoräthylen, Isopropylbromid, Benzol, Toluol, Xylole, ferner Ester, besonders Niederalkylester von niederen Fettsäuren wie Essigester, Butylacetat, Amylacetat, Ketone wie Methylisobutylketon, Methylisoamylketon, Äther wie Diisopropyläther, mit Wasser nicht oder wenig mischbare Alkohole wie Butanol, 2-Äthylbutanol, Äthylhexanol, Cyclopentanon Cyclohexanol.

Aus den durch Elution des makroporösen Adsorptionsharzes erhaltenen Lösungen des Cephalosporin C kann das Antibiotikum mittels der üblichen Ionenaustauscher so weit gereinigt werden, daß es aus deren jn Eluaten direkt als freie Säure gefällt oder in Form eines schwer löslichen Salzes kristallisiert werden kann. Das so erhaltene Produkt eignet sich zur direkten Weiterverarbeitung zu 7-Amino-cephalosporansäure und dessen aktiven Acylierungsprodukten. r>

Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher dadurch

gekennzeichnet, daß man Cephalosporin C aus Lösungen, in denen es im Gemisch mit aus der Fermentation stammenden Verunreinigungen vorliegt, gegebenenfalls nach extraktiver Vorreinigung mit lipophilen Lösungsmitteln und/oder flüssigen Ionenaustauschern im pH-Bereich von ca. 2—7, an makroporösen, nichtionisch Adsorptionsharzen mit großer Oberfläche adsorbiert

Als makroporöse, nichtionische Adsorptionsharze kommen Harze mit aromatischem Grundgerüst mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 4-20nm, vorzugsweise 7 —lOnm, insbesondere Polystyrolharze mit einer Oberfläche von 100—1000 m²/g, z. B. die unter den Markennamen »Amberlite« XAD-1, XAD-2, XAD-4, XAD-5 u. a. bekannten Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren (der Fa. Rohm & Haas Co.) in Betracht

So zeigen die Ergebnisse der Beispiele 1, 2, 4 und 6 dieser Patentanmeldung, daß Cephalosporin C auf diese Weise in 95, 824, 75,4 bzw. 97% der in der ursprünglichen Kulturlösung enthaltenen Menge in der eluierten Hauptfraktion konzentriert ist, wobei das in dieser Fraktion enthaltene Cephalosporine in einer Reinheit von ca. 75 - 80,65 - 70,843 bzw. 85% vorliegt.

Um diesen überraschenden Reinigungseffekt und die weiter oben gemachten Angaben weiter zu bestätigen, wurde das Verfahren des Beispiels 3 (zuerst Adsorption an makroporöses, nichtionisches Adsorptionsharz Amberlite® XAD-2, dann weitere Reinigung des Eluats mittels der Ionenaustauscherharze Amberlite® IRA-68 bzw. IR-4 B in der Acetat-Form = Verfahren C) mit der direkten Reinigung über vorgenannte Ionenaustauscherharze (= Verfahren D) sowie mil der Reinigung mittels der genannten Ionenaustauscher nach Vorreinigung mit dem nur anorganische Anionen beseitigenden Ionenaustauscherharz Amberlite® Rl-45 (Acetat-Form; Vefahren E) verglichen (Tabelle 4).

Tabelle 4

Vergleich der Volumenkapazität und des Reinigungseffektes einiger Ionenaustauscherharze mit oder ohne Vorreinigung über das makroporöse, nichtionische Adsorptionsharz Aberlite® XAD-2 bzw. das Ionenaustauscherharz Amberlite® IR-45

Verfahren

Vorbehandlung mit

Amberlite® XAD-2	ohne	IR-4 B	40-60%	IRA-68	IR-4 B	Amberlite¹»¹ IR-45
	63 g	5,3 g	16g
verwendeter Ionenaustauscher (Amberlite®-)	30	2,5	7,5	IR-4 B
IRA-68	10-20%		22 g
53 g	10,5
25	20-30%

Adsorbierte Menge an Cephalosporin C
pro 1000 ml Ionenaustauscher

Volumenkapazität·) des Ionenaustauschers
Erzielte Reinheit des Cephalosporins C

*) Volumenkapazität = Schüttvolumenkapazität ist die Zahl der Äquivalente des in erwünschter Weise adsorbierten Stoffes pro l.ilcr SchüUvolumen des Harzes unter l'raxisbcdingungen in [val/l].

Der vorgenannte Versuch bestätigt insbesondere, daß Cephalosporin C von Ionenaustauschern, im Gegensatz zu makroporösen, nichtionischcn Adsorptionsharzen, nur mit unbefriedigenden Ausbeulen (ungenügender Selektivität) aus Kulliiifiltiaten adsorbiert werden kann und dal) im stm· außerdem ein wesentlich weniger reines Produkt iM'j'i'licn.

Der hi-rvonagendc und spezifische Ueiniiüinpscffckt dei mnkionomseti. iiirhlioiiisclicn Adsorptiotishaivc war auch insofern überraschend und nicht vorhersehbar, als einerseits Cephalosporin C eine Verbindung mit im wesentlichen nur hydrophilen und praktisch keinen !lydrophobcn Gruppen, zudem schwach sauer (ionogcn) und polar, die crfindungsgcniäU einzusetzenden Adsorptionsharzc, wie die rnakropoiosin Adsorptionshiti ze vom Typ des Ainbcrlite⁰¹ ΧΛΙ) 2 oder ΧΛΙ) 4 hingegen neutral (nii litumojTii). und in hohem MaIU lipophil und unpolai sind. I λ war demnach /11 ei wallen.

daß Cephalosporin C, ähnlich wie andere hydrophile Stoffe, etwa Rohrzucker (vgl. brit. Pat. 1129 125, Beispiele 6 und 7), wenig oder gar nicht von diesen makroporösen, nichtionischen Adsorptionsharzen adsorbiert werden würde. Fs war auch nicht vorhersehbar, daß dabei ein Reinigungseffekt eintreten würde, bei dem nicht nur anorganische Salze, sondern auch die im Kulturfiltrat nachgewiesenen organischen Verunreinigungen wie Cephalosporin N oder Aminosäuren (z. B. Lysin, Arginin, Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Λ-Aminoadipinsäure, Glycin, Alanin, Valin, Methionin, Leucin und Isoleucin) in so hohem Ausmaße abgetrennt wurden, daß die Kapazität einiger schwach basischer Ionenaustauscher, z. B. Amberlite® IRA-68 und IR-4 B, dadurch bis zu 8fach erhöht und damit eine weitgehende Reinigung und Anreicherung von Cephalosporin C möglich wird.

Die Behandlung mit dem Adsorptionsharz wird zweckmäßig bei einem pH von 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 3, durchgeführt. Dieses pH kann mittels einer beliebigen Säure, z. B. einer organischen Säure wie Oxalsäure oder mittels einer Mineralsäure wie Salzsäure, Phosphorsäure oder besonders Schwefelsäure, eingestellt werden. Es ist vorteilhaft, die Fermentationsbrühe vor dem Filtrieren anzusäuren und dann wie üblich, zweckmäßig in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, zu filtrieren.

Die gegebenenfalls vorextrahierte Kulturlösung wird in der üblichen Weise mit dem Absorptionsharz in Kontakt gebracht. Vorzugsweise arbeitet man mit Säulen, welche das Harzbett enthalten. Die Adsorption erfolgt dann während der Perkolation der Lösung durch die Säule. Das Perkolat enthält kein oder nur geringe Mengen Antibiotikum. Durch Wasser wird die restliche Lösung aus der Säule verdrängt. Auch das Waschperkolat enthält kein oder nur geringe Mengen Antibiotikum.

Zur Eluierung des Antibiotikums vom Harz können Gemische von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, insbesondere wäßrige Niederalkanol-Lösungen. verwendet werden. Besondersgeeignet ist 10 —20%iges wäßriges Isopropanol.

Zur Regenerierung des Harzes eignen sich alkalische wäßrige oder wäßrigalkoholische Lösungen, z. B. ein Gemisch von Methanol und Wasser (1 :1), das 1-n an Natronlauge ist Die Natronlauge-Rückstände können beispielsweise durch Waschen mit Säuren, z. B. Schwefelsäure und/oder Wasser entfernt werden. Weiter ist zur Regeneration z. B. wäßriges Natriumhypochlorit geeignet; das Oxydationsmittel kann aus der Säule mit einem Reduktionsmittel, z. B. Natriumbisulfit- oder -thiosulfatlösung entfernt werden. In Kombination mit den erwähnten Regenerationsmitteln kann eine Behandlung mit Aceton oder Wasser + Aceton-Gemischen die Regeneration vervollständigen.

Das gesamte Verfahren der Adsorption und Regenerierung des Harzes kann, wie üblich, batchweise oder kontinuierlich, in Einzelsäulen oder kombinierten Säulen durchgeführt werden.

Das Cephalosporin C-haltige Eluat kann in üblicher Weise, vorzugsweise an basischen Ionenaustauschern wie »Amberlite« IR-4 B (Phenol-Polyamin mit primären und sekundären Aminogruppen), »Amberlite« IRA-68 (Methacrylsäure-Polymerisat), »Amberlite« XE-265 (Polyamin), »Imac« A 13 T oder »!mac« A 17 P (der Firma Imacti-Maatsch.) weitergereinigt werden. Diese Ionenaustauscher weisen für die Absorption von Cephalosporin C aus dem Eluat eine wesentlich größere Kaoazität auf als aus dem Kulturfiltrat. Aus den so weiter gereinigten Lösungen kann das Cephalosporin C, beispielsweise nach Konzentrieren, als freie Säure gefällt werden, z. B. mittels mit Wasser mischbarer organischer Lösungsmittel wie Aceton oder Isopropas nol, oder man kann es in Form eines schwerlöslichen mikrokristallinen Schwermetallkomplexes, z. B. eines Komplexes mit Kupfer, Quecksilber, Cadmium, Blei, Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel oder insbesondere in Form des Zinkkomplexes isolieren, vgl. belg. Patent ίο 7 34 5b5.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Eine Kulturlösung, die in bekannter Weise durch Züchten eines Cephalosporin C produzierenden Stammes der Gattung Cephalosphorium in einer Nährlösung erhalten wird, wird nach Erreichen des Maximums der Cephalosporin C-Produktion auf 15° C abgekühlt und mit 50%iger (G/V) Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 — 3,0 angesäuert. Das Mycel und die unlöslichen Nährlösungsbestandteile werden unter Zusatz von Filterhilfsmitteln (z. B. »Dicalite«) abfiltriert. Das so erhaltene Kulturfiltrat weist ein pH von 3 auf; es enthält 2,1 g Cephalosporin C und 5,4% Trockenrückstand. Es ist braun gefärbt.

61 »Amberlite« XAD-2 werden zusammen mit Wasser in der für Ionenaustauscher üblichen Art und Weise in eine Glassäule von 10 cm Durchmesser eingefüllt. Das Harzbett ist 76 cm hoch. Durch diese Säule werden 6 1 des nach der oben beschriebenen Methode erhaltenen Kulturfiltrates mit einer Geschwindigkeit von 6 1/Std. durchperkoliert. Das Filtrat wird bei der gleichen Durchlaufgeschwindigkeit mit 3 1 deionisiertem Wasser verdrängt und die Säule mit 10%igem wäßrigem Isopropylalkohol eluiert. Die Adsorptionsund Waschperkolate werden in 1 '/2-Liter-Fraktionen die gelborangen Eluate in 1-Liter-Fraktionen aufgefangen. Das »Amberlite« XAD-2 wird mit 6 Liter 50%igem wäßrigem Methylalkohol, der 1-n an Natronlauge ist regeneriert und das Regenerationsmittel mit Wasser ausgewaschen. Die Säule ist dann für eine erneute Adsorption bereit.

Das Resultat der Adsorption/Elution ist folgendes: ca 65-70% der Verunreinigungen des Kulturfiltrate« befinden sich in den biologisch inaktiven Perkolat- unc Waschfraktionen sowie in den beiden ersten Eluatfrak· tionen, die nur eine Spur Cephalosporin C enthalten.

Die biologisch aktiven Eluatfraktionen haben eir Volumen von 12 Liter und enthalten 95% des irr Kulturfiltrat vorhandenen Cephalosporin C sowie 20 bi: 25% der Verunreinigungen des Kulturfiltrates. Di« aktiven Eluatfraktionen sind frei von anorganischer Anionen.

Beispiel 2

4 Liter eines Kulturfiltrates, das 2^g Cephalosporin C pro Liter enthält und das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhalten wird, aber mil Oxalsäure statt Schwefelsäure angesäuert wurde wire mit einer Geschwindigkeit von 121/Std. durch die ir Beispiel 1 beschriebene, mit »Amberlite« XAD-i gefüllte Säule perkoliert Das Perkolat wird mit 3 Litei deionisiertem Wasser verdrängt und die Säule mil insgesamt 12 Liter 10%igem wäßrigem Isopropylalko hol eluiert Zur Regeneration des »Amberlite« XAD-i läßt man Natriumhypochlorit-Lösung, die 3%ig ar

aktivem Chlor ist, und dann 4 Liter 0,2%ige Natriumbisulfit-Lösung durch die Säule laufen. Darauf beginnt der Zyklus durch Adsorption von 4 Liter Kulturfiltrat von neuem. Die durchschnittliche Ausbeute mehrerer aufeinanderfolgender Zyklen an Cephalosporin C be- ^r> trägt 85,2% in den aktiven Eluatfraktionen, die frei von anorganischen Anionen sind. 9,2% befinden sich in den ersten Eluatfraktionen die noch anorganische Anionen enthalten, und können durch nochmalige Adsorption gewonnen werden. Die aktiven Haupteluate enthalten κι 30 — 35% der im Kulturfiltrat vorhandenen Verunreinigungen.

Beispiel 3 li

30 Liter eines Kulturfiltrates, das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhalten wird und 2,10 g Cephalosporin C pro Liter enthält, wird mit einer Geschwindigkeit von 30 1/Std. durch eine Säule mit 30 Liter »Amberlite« XAD-2 perkoliert. Der Innendurchmesser der Säule beträgt 15 cm. Das Kulturfiltrat wird mit 15 Liter deionisiertem Wasser verdrängt und die Säule mit 60 Liter 10%igem wäßrigem Isopropylalkohol eluiert. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 60 1/Stunde. Die Hauptmenge des Cephalosporin C befindet sich in 45 Liter Eluat. Das »Amberlite« XAD-2 wird anschließend durch aufeinanderfolgende Perkolation von 15 Liter 1 n-Natronlauge, 10 Liter 0,2 n-Schwefelsäure und 10 Liter Wasser regeneriert. Darauf beginnt jo der Zyklus durch Adsorption von 30 Liter Kulturfiltrat von neuem. Die durchschnittliche Ausbeute mehrerer aufeinanderfolgender Zyklen an Cephalosporin C in den aktiven Eluatfraktionen, die frei von anorganischen Anionen sind, beträgt 95%. Circa 3% des Cephalospo- r, rin C befinden sich in den ersten Eluatfraktionen, die noch Chlor- und Sulfationen enthalten. Aus diesen Fraktionen kann das Antibiotikum durch nochmalige Adsorption gewonnen werden. Die aktiven Haupteluate enthalten 28% der im Kulturfiltrat vorhandenen Trockensubstanz. »Amberlite« IRA-68 wird in 10%igem wäßrigem Isopropanol aufgeschlämmt und in eine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 5 cm eingefüllt. Das Füllvolumen beträgt 1 Liter. Durch diese Säule werden 45 Liter des oben erhaltenen Eluats perkoliert. Die Adsorptionslösung enthält 1367 mg Cephalosporin C pro Liter bei einem Feststoffanteil von 0,684%. Die Adsorptionsgeschwindigkeit beträgt 10 Liter/Std. Die Adsorptionslösung wird mit 1 Liter Wasser verdrängt. Das Adsorptions- und Waschperkolat enthält 3% des eingesetzten Cephalosporin C und ca. 35 — 40% der in der Adsorptionslösung vorhandenen Verunreinigungen.

Das Cephalosporin C wird mittels Pyridinacetatpuffer, pH 5,5, eluiert Der Puffer ist 0,44molar an Pyridin und 0,2molar an Essigsäure. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 1 Liter/Std. 923% der eingesetzten Cephalosporin C-Menge befinden sich in 3 Liter Eluat der Hauptfraktionen mit einem Gehalt von 18,5 g Cephalosporin C/Liter. Weitere 3% befinden sich in bo 1,25 Liter aus Nebenfraktionen.

Die Hauptfraktionen mit einem pH von 4,9 werden mit 185 g Zinkacetat versetzt Zur klaren Lösung wird unter Rühren innerhalb 20 Minuten 3 Liter Isopropanol zufließen gelassen. Gegen Ende der Zugabe beginnt der Cephalosporin C-Zink-Komplex auszukristallisieren. Die Mischung wird auf 2° abgekühlt und 4 Stunden bei dieser Temperatur gerührt Der Niederschlag wird genutscht und zweimal mit je 300 ml Wasser und einmal mit 300 ml Aceton gewaschen und bei 40° im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 36,6 g Cephalosporin C-Zink-Komplex als weißes Pulver mit einem durch Messung der Absorption im UV bestimmten Gehalt von 91,6%.

Beispiel 4

Die in Beispiel 3 beschriebene Adsorption/Elution an »Amberlite« IRA-68 wird analog mit »Amberlite« XE-265 durchgeführt, wobei 50 Liter des nach Beispiel 3 erhaltenen XAD-2-Eluates adsorbiert werden. Das Adsorptions- und Waschperkolat enthält 5,9% des eingesetzten Cephalosporin C und ca. 40 — 45% der in der Adsorptionslösung vorhandenen Verunreinigungen.

Das Cephalosporin C wird wie in Beispiel 3 beschrieben mit Pyridinacetatpuffer eluiert. 75,4% der eingesetzten Cephalosporin C-Menge befinden sich in 4 Liter Eluat der Hauptfraktionen mit einem Gehalt von 12,05 g Cephalosporin C/Liter. Weitere 9,5% sind in 2,75 Liter Nebenfraktionen enthalten.

Die Hauptfraktionen werden auf 400 ml eingeengt, und das Konzentrat wird unter Rühren in 4,8 Liter Isopropanol einlaufengelassen. Die voluminöse Fällung wird genutscht, mit 200 ml Isopropanol und 200 ml Aceton gewaschen und anschließend bei 40° im Vakuum getrocknet. Es resultieren 45 g eines beigen Pulvers, das nach dem biologischen Test zu 84,3% aus Cephalosporin C besteht. Die Fällungsausbeute beträgt 56%. Aus der Mutterlauge kann das restliche Cephalosporin C nach Konzentrierung und abermalige Fällung großenteils gewonnen werden.

Beispiel 5

Eine Glassäule von 2,5 cm Durchmesser wird mit 200 ml »Amberlite« XAD-2 in Wasser beschickt. 200 ml Kulturfiltrat, das 1,96g Cephalosporine pro Liter enthält und nach Beispiel 1 erhalten wird, wird mit Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert und mit einer Geschwindigkeit von 400 ml/Std. durch das »Amberlite« XAD-2 perkoliert. Das Filtrat wird mit 100 ml deionisiertem Wasser verdrängt und das Cephalosporin C mit 10%igem wäßrigem Isopropanol eluiert. Die Säule wird nach der im Beispiel 2 beschriebenen Methode regeneriert und erneut zur Adsorption verwendet. Die Perkolat- und Waschfraktion enthalten kein Cephalosporin C. In den ersten Eluatfraktionen, die noch anorganische Anionen enthalten, sind 8%, in den übrigen Eluatfraktionen 90% des im Kulturfiltrat vorhandenen Cephalosporin C enthalten.

Beispiel 6

30 Liter eines nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode erhaltenen Kulturfiltrates mit 2,12 g Cephalosporin C und ca. 34 g Verunreinigungen pro Liter, werden auf einem Gegenstromextraktor mit 15 Liter einer Lösung aus 5% Amberlite LA-2 (freie Base) in Äthylhexanol extrahiert Die im extrahierten Kulturfiltrat gelösten Anteile vermindern sich von ca. 3,6% auf ca 335%. 12 Liter extrahiertes Kulturfiltrat werden mit 50%iger Schwefelsäure auf ein pH von 2,7 gestellt mit einer Geschwindigkeit von 6 Litern pro Stunde durch 6 Liter Amberlite XAD-2 perkoliert und mit 3 Litern deionisiertem Wasser verdrängt Der Durchlauf enthält

Il 12

kein Cephalosporin C. Das adsorbierte Cephalospo- vorhanden.

rin C wird mit insgesamt 12 Litern 10%igem wäßrigem Das Amberlite XAD-2 wird dann wie im Beispiel 2

Isopropanol eluiert. Das Eluat enthält 97% des im beschrieben regeneriert und zusätzlich noch mit 3 Liter

Kulturfiltrat vorhandenen Cephalosporin C (ca. 2% Aceton-Wasser im Verhältnis 1 :1 durchperkoliert. Das

befinden sich in einer salzhaltigen Vorfraktion). Im Eluat ^r. Aceton wird mit Wasser verdrängt, worauf die Säule für

sind noch 15% der Verunreinigungen des Kulturfiltrates eine erneute Adsorption bereit ist.

Claims

Patentansprüche:

L Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C aus Fermentationslösungen, in denen dieses im Gemisch mit aus der Fermentation stammenden Verunreinigungen vorliegt, und die gegebenenfalls einer extraktiven Vorreinigung mit lipophilen Lösungsmitteln und/oder flüssigen Ionenaustauschern im pH-Bereich von ca. 2 —7 unterworfen wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cephalosporin C bei pH 1 —8 an makroporösen, nichtionischen Adsorptionsharzen mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 4 bis 20 nm und mit einer Oberfläche von 100 bis 1000 m²/g adsorbiert und nachträglich eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsharz ein mit Divinylvenzol vernetztes makroporöses Styrolpolymerisat verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution des Cephalosporins C vom Adsorptionsharz ein Gemisch von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution des Cephalosporins C vom Adsorptionsharz 10 — 20%iges wäßriges Isopropanol verwendet.

für Cephalosporin C haben oder dieses teilweise zerstören. Auch ist die Regeneration großer Mengen von Ionenaustauschern aufwendig und wegen der Instabilität einiger Ionenaustauscher mit Verlusten verbunden.

Wie aus der nachstehenden Tabelle 1 hervorgeht, liegt die Hauptursache für das Versagen der Abtrennung des Cephalosporins C aus filtrierten Kulturlösungen mittel« Ionenaustauschern in der erheblichen Verminderung der Austauschkapazität der verwendeten Anionenaustauscher durch die Begleit-Anionen.