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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-B,2- gleichen
Stoffen Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung
von Stoffen mit Wirksamkeit gegen perniziöse Anämie aus Fermentationsflüssigkeiten
und insbesondere auf ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-B,2-gleichen
Substanzen, die an Montmorillonit adsorbiert sind.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Vitamin B12 und Vitamin-B"-gleiche
Stoffe aus einem Montmorillonitadsorbat dadurch gewonnen, daß das Vitamin und vitamingleiche
Stoffe mit einer wäßrigen Lösung ausgewaschen werden, die ein pH von mehr als etwa
6 hat und ein Anion einer stickstoffhaltigen Säure enthält, die Cyanid-, Thiocyanat-
oder Nitritionen aufweist. Es ist bekannt, Vitamin B12 aus wäßrigen Lösungen dadurch
zu isolieren, daß das Vitamin an ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Aktivkohle oder
Fullererde, adsorbiert wird, worauf das adsorbierte Vitamin B12 mit wäßrigen Lösungen
einer organischen Base, wie z. B. Pyridin od. dgl., ausgewaschen wird. Das Vitamin
B12 wird dann aus dem entstandenen Eluat gewonnen. Während dieses Verfahren zur
Isolierung und Gewinnung von Vitamin B12 an sich brauchbar ist, so hat die Anwendung
von Pyridin und anderer organischer Basen in der Auswaschlösung gewisse Nachteile.
Ein Nachteil ist der erhebliche Verlust aktiver Bestandteile, der während des Verfahrens
eintritt. Weiterhin sind die organischen Basen teuer, und
es ist
daher aus wirtschaftlichen Gründen erforderlich, diese Chemikalien wieder zu gewinnen.
Außerdem ist die Anwendung von Auswaschmitteln, die organische Basen zur Wiedergewinnung
von Vitamin B12 aus Montmorillonitadsorptionsmitteln wie Fullererde enthalten, schwierig
im technischen Maßstab auszuführen, da die Aufschlemmung des Adsorbats und des Auswaschmittels
schleimig ist und demgemäß nur äußerst schwierig filtriert werden kann. Es war daher
für eine möglichst wirksame Arbeitsweise erforderlich, Aktivkohle als Adsorptionsmittel
zu verwenden, denn die Anwendung dieses Adsorptionsmittels schaltete die Verarbeitungsschwierigkeiten,
die früher mit Fullererde auftraten, aus. Indessen ist die Anwendung von Aktivkohle
unwirtschaftlich, da sie teurer als Fullererde ist und die Menge der erforderlichen
Aktivkohle ungefähr vier- oder fünfmal größer ist als die Menge der anzuwendenden
Fullererde.
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Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren, mit dem Vitamin
B12 und Vitamin-Bi.-gleiche Stoffe in wirtschaftlicher Weise und erhöhten Ausbeuten
gewonnen werden können. Die Erfindung bezweckt die Gewinnung von Vitamin B12 und
Vitamin-B.2-gleichen Substanzen aus Montmorillonitadsorptionsmitteln, wie Fullererde
(Cälciummontmorillonit) oder Bentonit (Natriummontmorillonit), wobei nur eine wäßrige
anorganische Lösung zur Auswaschung dieser Substanzen verwendet wird und wobei die
Nachteile der bekannten Verfahren vermieden werden. Ein weiteres Ziel besteht darin,
ein praktisches Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung des Vitamins und vitamingleicher
Substanzen aus Lösungen vorzusehen, die nur kleinere Mengen dieser Stoffe enthalten,
wobei die wohlfeilen Montmorillonite als, Adsorptionsmittel und das verbesserte
Auswaschverfahren angewendet wird. Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus
der folgenden Beschreibung: Es wurde gefunden, daß eine wäßrige Lösung, die Cyanid,
Thiocyanat oder Nitrit enthält und ein pH von wenigstens 6 hat, in wirksamer Weise
Vitamin B12 und Vitamin-B12 gleiche Stoffe aus Montmorillonitadsorptionsmitteln
auswäscht. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet also, abgesehen davon, daß ein
wohlfeiles Auswaschmittel verwendet wird, die Gewinnung erhöhter Ausbeuten an Vitamin
B12 oder ähnlich wirkenden Verbindungen, welche eine therapeutische Wirksamkeit
bei perniziöser Anämie aufweisen.
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Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das verbesserte Auswaschverfahren
so durchgeführt, daß das mit den Wirkstoffen beladene Montmorillonitadsorptionsmittel
mit der wäßrigen Auswaschlösung so lange innig in Berührung gebracht wird, als zur
Lösung der aktiven Bestandteile erforderlich ist. Dies'wird z. B. dadurch ausgeführt,
daß die Auswaschlösung mit dem vitaminhaltigen Adsorptionsmittel errührt wird und
das ausgelaugte Adsorptionsmittel zur Gewinnung der wäßrigen Wirkstofflösung abfiltriert
wird. Das in konzentrierter Form in den wäßrigen Eluaten enthaltene Vitamin B12
und die Vitamin-B,2-gleichen Stoffe werden dann zur Gewinnung dieser Stoffe in gereinigter
Form für therapeutische oder andere Zwecke leicht weiterverarbeitet.
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In Ausübung der Verfahrensmaßnahmen gemäß der Erfindung ist es notwendig,
daß die Auswaschlösung ein pH von etwa 6 oder mehr hat, da bei sauren pH-Werten
die aktiven Bestandteile größtenteils adsorbiert bleiben und von der Lösung nicht
ausgewaschen werden. Während im allgemeinen solche wäßrigen Lösungen mit einem ph
von wenigstens 6 in Ausübung der Erfindung nützlich sind, wurde gefunden, daß unter
günstigsten Bedingungen die besten Resultate erhalten werden, wenn Auswaschlösungen
mit einem pH von etwa 7 bis 9 angewendet werden.
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Die Auswaschlösung wird am bequemsten dadurch hergestellt, daß ein
stabiles Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalz der obengenannten Säuren in Wasser
gelöst wird und, falls erforderlich, der pH-Wert auf die gewünschte Höhe durch Zugabe
einer schwachen Base, wie Ammoniumhydroxyd oder eines Alkalimetallcarbonats oder
-bicarbonats, eingestellt wird. Zufolge der sauren Beschaffenheit des auszuwaschenden
Vitaminadsorbats ist es häufig zweckmäßig, einen Überschuß an einer solchen schwachen
Base zuzugeben, um die Azidität des Adsorbats zu neutralisieren, damit die Auswaschlösung
den optimalen pH-Wert behält.
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Die Menge und die Konzentration der anzuwendenden Auswaschlösung hängt
von dem besonderen Adsorbat, das ausgewaschen werden soll, ab. Gewöhnlich genügen
etwa io bis 15 Teile der Auswaschlösung auf einen Teil Adsorbat. Andere Adsorbate
können jedoch auch größere oder kleinere Mengen an Auswaschlösungen erfordern. Wenngleich
verschiedene Konzentrationen an anorganischen Salzen der genannten Säuren angewendet
werden können, wurde gefunden, daß eine Menge von 0,05 bis o,i Gewichtsprozent
an anorganischen Salzen in der Auswaschlösung gewöhnlich ausreichend ist, um eine
optimale Ausbeute an aktiven Bestandteilen zu erhalten.
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Das erhaltene wäßrige Eluat wird gemäß der Erfindung zur Gewinnung
von reinem Vitamin B12 oder reinem Vitamin-B1.-gleichen Substanzen aufgearbeitet.
Die weitere Behandlung- der Eluate hängt von dem für die Auswaschung angewendeten
Anion und den zu gewinnenden aktiven Bestandteilen ab.
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Bei der Durchführung des Auswaschvorgangs mit einer Cyanidlösung werden
das Vitamin B12 und die Vitamin-B1.-gleichen Substanzen, die von dem Adsorptionsmittel
abgelöst werden, in einen purpurfarbenen Cyanidkomplex umgewandelt. Dieser Cyanidkomplex
wird im Eluat durch Behandlung mit einer Säure zersetzt, wobei VitaminB" gebildet
wird. Das Vitamin B12 kann aus der angesäuerten Lösung in gereinigter Form, z. B.
durch Überführung der aktiven Substanzen aus Wasser in Benzylalkohol, durch chromatographische
Behandlung mit aktiver Tonerde oder Aktivkohle oder
durch Aufteilung
der aktiven Bestandteile zwischen Benzylalkohol und Wasser, in einem Vielplattengegenstromverteiler
gewonnen werden. Gegebenenfalls können auch zwei oder mehrere dieser Reinigungsverfahren
in Kombination angewendet «-erden.
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Wenn die anzuwendende wäßrige Auswaschlösung Thiocyanat- oder Nitritanionen
enthält, enthält das entstehende Eluat sowohl Vitamin B12 als auch Vitamin-B12-gleiche
Stoffe. Diese Eluate können durch die oben angegebenen Reinigungsverfahren zur Gewinnung
von Vitamin B12 und bzw. oder Vitamin-B12-gleichen Substanzen aufgearbeitet werden.
Gleichwohl ist im allgemeinen die Behandlung dieser Mischung von Vitamin B12 und
Vitamin-B12 gleichen Substanzen mit einer Quelle von Cyanidionen vorzuziehen, um
Vitamin-131.-gleiche Substanzen in Vitamin B12 überzuführen. Dadurch ist es möglich,
die Schwierigkeiten der getrennten Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-B,2-gleichen
Substanzen zu vermeiden und nur ein Produkt zu erhalten.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden,
daß Vitamin B12 und Vitamin-B"-gleiche Stoffe in konzentrierter Form aus Fermentationsflüssigkeiten
u. dgl., die nur kleinere Mengen dieser Bestandteile enthalten, gewonnen werden
können. Die Ausführung erfolgt wie oben beschrieben. Auf diese Weise wird gemäß
der Erfindung ein einfacher Weg zur Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-B12-gleichen
Stoffen aus dünnen Lösungen gewiesen.
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Das Verfahren ist insbesondere nützlich zur Gewinnung von Vitamin
B12 und Vitamin-B..-gleichen Stoffen aus schwachen Streptomycinflüssigkeiten. Nach
Entfernung des Streptomycins wird der Fermentationsflüssigkeit dann das Montmorillonitadsorptionsmittel
zugegeben, das seinerseits Vitamin B12 und Vitamin-B"-gleiche Stoffe aus der Lösung
aufnimmt. Das vitaminhaltige Adsorbat wird dann aus der erschöpften Flüssig-Iceit
durch Filtration und andere Verfahren zur Gewinnung der aktiven Bestandteile in
gereinigter Form, wie oben beschrieben, entfernt. Zur großtechnischen Aufarbeitung
ist Fullererde als Montmorillonitadsorptionsmittel vorzuziehen, da sie leicht erhältlich
ist und ein Minimum an Arbeitsschwierigkeiten bietet. Beim praktischen Arbeiten
hat sich gezeigt, daß i Gewichtsteil Fullererde auf 4.oo Gewichtsteile Flüssigkeit
zur vollständigen Adsorption von Vitamin B12 und Vitamin-B"-gleichen Substanzen
ausreicht.
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Der Begriff »Vitamin-B,2-gleiche Substanzen« wie er hier angewendet
wird, bezieht sich auf solche Substanzen, welche gleich Vitamin B12 bei der Behandlung
von perniziöser Anämie wirksam sind und welche durch Reaktion mit Cyanidionen in
Vitamin B12 umgewandelt werden können. Diese Stoffe können als Analoge von Vitamin
1312, bei denen die Cyanidgruppe dieses Vitamins durch andere Radikale ersetzt ist,
angesehen werden.
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In den folgenden Beispielen werden besondere Ausführungsformen der
Erfindung dargestellt. Beispiel i Eine aus der Züchtung eines Streptomycin erzeugenden
Stammes von Streptomyces griseus erhaltene Nährflüssigkeit, aus der das Streptomycin
durch Adsorption an ein Carboxylsäureharz, wie z. B. ein granuliertes Mischpolymerisat
von Methacrylsäure und Divinylbenzol mit einem Gehalt von 51/o Divinylbenzol, entfernt
worden war, wurde auf pH 2, 5 angesäuert. o,io Gewichtsprozent Fullererde und eine
gleiche Menge Kieselgur als Hilfsfiltermasse wurden zugegeben. Die Mischung wurde
während etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert.
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Zu einem Teil des Adsorbats wurde eine wäßrige Lösung, enthaltend
28 % Ammoniumhydroxyd und o, i % Natriumcyanid, zugefügt, wobei 5 Teile der Lösung
pro Teil Fullererde angewendet wurden. Die Mischung wurde während 30 Minuten
gerührt und dann filtriert. Das entstehende Filtrat wurde dann zur Gewinnung und
Isolation des Vitamin B12 weiterbehandelt. Zuerst wurde das Filtrat mit Essigsäure
auf PH 7 neutralisiert, und zu dem neutralen Filtrat wurden 50 g pro Liter
Natriumbicarbonat und ioo g pro Liter Natriumsulfat zugegeben. Die Lösung wurde
einmal mit ein Fünftel des Volumens und zweimal mit ein Zehntel des Volumens an
Benzylalkohol extrahiert. Die vereinigten Benzylalkoholauszüge der wirksamen Substanzen
wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Zu der getrockneten Benzylalkohollösung
wurden 5 Raumteile Aceton und 2 Raumteile Äther zur Ausfällung der wirksamen Substanzen
zugegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und in der geringsten
Menge Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde mit aktiver Tonerde chromatographisch
behandelt. Die Tonerdesäule wurde mit Methanol, das 2 % Essigsäure enthielt, ausgewaschen,
die Fraktionen von roter Farbe wurden gesammelt, und die optische Dichte wurde bei
5500 A (dem charakteristischem Maximum für Vitamin B12) gemessen. Die Messung
zeigte, daß 16o mg des potentiellen Vitamins B12 (9o bis 980/a davon können als
kristallisierbares Vitamin B12 gewonnen werden) in rund 38001 vorliegen.
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Zwei zusätzliche Teile des Adsorbats wurden mit wäßrigen Lösungen,
die 7 bzw. 2,8% Ammoniumhydroxyd und o, 10/9 Natriumcyanid enthielten, ausgewaschen,
worauf sie in derselben Weise aufgearbeitet wurden. 203 bzw. 178 mg des potentiellen
Vitamin B12, in rund 3800 1 Flüssigkeit wurden gefunden. Beispiel e Eine Fermentationsflüssigkeit
von der in Beispiel i beschriebenen Art wurde nach der Ansäuerung auf PH 2,5 mit
o,io Gewichtsprozent Fullererde behandelt. Ein Teil des abgetrennten Adsorbats wurde
mit einer wäßrigen Lösung, die 3 0/a Natriumbicarbonat und 0,05 % Natriumeyanid
enthielt, ausgewaschen, wobei die Lösung in einem Verhältnis von 5 Gewichtsteilen
pro Teil Fullererde angewendet wurde.
Ein zweiter Teil des Adsorbats
wurde in gleicher Weise mit einer wäßrigen Lösung, die i % Natriumbicarbonat und
0,o5 % Natriumcyanid enthielt, ausgewaschen.
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Die entstehende Eluate wurden dann zur Gewinnung von Vitamin B12 wie
folgt behandelt: Es wurden 300 g Ammoniümsulfat pro Liter zugegeben, die
Lösung wurde einmal mit ein Fünftel Raumteil und zweimal mit ein Zehntel Raumteil
Benzylalkohol extrahiert. Die vereinigten Benzylalkoholauszüge wurden mit Essigsäure
auf pH 6 bis 6,5 angesäuert, filtriert und über Natriumsulfat getrocknet. Zur getrockneten
Lösung wurden 6o Volumprozent Kohlenstofftetrachlorid zugegeben, und die Lösung
wurde viermal mit Wasser extrahiert, wobei jeder Auszug ein Zehntel des Volumens
des Benzylalkohols darstellte. Die in den wäßrigen Auszügen enthaltenen wirksamen
Stoffe wurden wiederum in Benzylalkohol, darauf in Wasser und schließlich in derselben
Weise nochmals in Benzylalkohol übergeführt. Die Benzylalkohollösung wurde über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, mit 5 Raumteilen Aceton und 2 Raumteilen
Äther gefällt, in der geringsten Menge Methanol gelöst, auf PH 4 mit Essigsäure
angesäuert, mit 7 Raumteilen Aceton und 2 Raumteilen Äther gefällt und in der Mindestmenge
Methanol, das o,i ccm Eisessigsäure pro 15 ccm Methanol enthielt, gelöst. Die Lösung
wurde chromatographisch mit aktiver Tonerde behandelt. Die Tonerdesäule wurde mit
Methanol ausgewaschen, und die rotgefärbten Fraktionen wurden gesammelt. Die optische
Dichte dieser Fraktionen wurde bei 5500 A gemessen. Die Messungen ergaben,
daß 255- bzw. 217 mg des potentiellen Vitamin B12 aus rund 38001 Fermentatibnsflüssigkeit
in den Eluaten der 3%igen bzw. i%aigen Natriumbicarbonatlösung vorhanden waren.
Beispiel 3 Die in Beispiele beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt, wobei
eine wäßrige Auswaschlösung mit 2% Natriumbicarbonat und 0,05% Kaliumcyanid angewendet
wurde. Bei Wiederholung des gleichen Vorganges, wie in vorangehendem Beispiel beschrieben,
ergab sich, daß das gewonnene Produkt 232 mg potentielles Vitamin B12 aus rund 380o
1 Fermentationsflüssigkeit enthielt.
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Bei Wiederholung dieses Versuchs mit einer wäßrigen Auswaschlösung;
die lediglich 20/0 Natriumbicarbonat enthielt, ergab sich, daß nur 5 mg potentielles
Vitamin B12 aus etwa 3800 1 Brüde gewonnen wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen
zeigen,, daß, praktisch kein wirksamer Stoff erhalten wird, wenn die Auswaschlösung
kein Cyanidion enthält. Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt,
wobei drei verschiedene Lösungen zur Auswaschung der Fullererde angewendet wurden,
nämlich i. eine wäßr'ige Lösung mit 2% Natriumbicarbonat und o, i % Natriümthiocyanat,
2: eine wäßrige Lösung mit 2% Natriumbicarbonat und 0,1% Natriümnitrit und 3. eine
wäßrige Lösung mit :21/9 Natriumbicarbonat, o, i % Natriumnitrit und 2% Natriumchlorid.
Außerdem wurden die ersten wäßrigen Auszüge von Benzylalkohol nach dem Auswaschen
der Fullererde mit i g Natriumcyanid pro 400 ccm Lösung (ein beträchtlicher Überschuß)
zur Überführung der Vitamin-B12-gleichen Stoffe in Vitamin-B12 Cyanidkomplex behandelt.
Die Mengen des in den Erzeugnissen vorhandenen potentiellen Vitamin B12 aus den
drei oben beschriebenen Auswaschlösungen waren erstens 192 mg, zweitens 224 mg und
drittens 258 mg pro etwa 3800 1 Fermentationsflüssigkeit.
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Bentonit, der ebenfalls eine hohe Adsorptionskapazität für Vitamin
B12 und Vitamin-B12 gleiche Stoffe hat, wurde als Adsorptionsmittel zur Entfernung
dieser wirksamen Stoffe aus der Lösung angewendet. Das Adsorptionsmittel wurde mit
der oben beschriebenen Lösung 3 ausgewaschen, und das Eluat wurde in derselben allgemeinen
Art behandelt. Die Ausbeute an potentiellen Vitamin B12 entsprach der mit Fullererde
als Adsorptionsmittel erhaltenen.
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Beispiel 5 Acht Produktionschargen von Streptomyces griseus Fermentationsflüssigkeit
wurden mit o,25 Gewichtsprozent Fullererde behandelt. Von den Adsorbaten wurden
Proben genommen und ein Teil Adsorbat mit 13 Teilen einer wäßrigen Lösung, enthaltend
2 0/a, Natriumbicarbonat, o, i % Natriumnitrit und 20/a Natriumchlorid, ausgewaschen.
In den Eluaten wurden die Mengen des kristallierbaren Vitamin B12 bestimmt. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
| Kristallisierbares Vitamin B,2 |
| Carge Nr. in mg/3 8oo 1 |
| Fermentationsflüssigkeit |
| 454 |
| 2 474 |
| 3 4o6 |
| 4 347 |
| 5 420 |
| _ 6 3o6 |
| _ 7 397 |
| 8 478 |
| 410 Mittel-,vert |