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Verfahren zur Reinigung und Entfärbung von Streptomycin Die Erfindung
bezieht sich auf die Herstellung von von Verunreinigungen und Beimengungen befreiten
Streptomycins. Nach Literaturberichten wird Streptomycin durch Züchtung von Stämmen
von Actinomyces griseus in geeigneten Kulturmedien hergestellt, die Kulturflüssigkeit
mit einem Adsorptionsmittel behandelt und das adsorbierte Streptomycin mit alkoholischer
Mineralsäure gewaschen. Das so erhaltene ,rohe Konzentrat, welches nur eine geringe
Potenz oder Aktivität aufweist, wird einer Anzahl von Behandlungen unterworfen,
welche eine mehr oder weniger schrittweise Konzentration des Streptomycins, im allgemeinen
in Form von Salzen, z. B. als Streptömycinhydro= chlorid,-bewirken: -Auf diesem
Wege -gelängt" man schließlich zu im wesentlichen reinen Produkten, die eine Aktivität
von etwa j5o bis Soo Einheiten/ing aufweisen.
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Es wurde jedoch gefunden, daß gewisse Beimengungen und Verunreinigungen
durch die bdkannteri Konzentrations- und Reinigungsverfahren nur sehr schwierig
zu entfernen sind. Dies gilt z. B. für gewisse gefärbte Verunreinigungen, die in
die Endprodukte übergehen. Wenn auch diese gefärbten Verunreinigungen nicht notwendigerweise
schädlich sind, sind sie dennoch in einem Produkt, das für therapeutische Zwecke
verwendet wird, zu beanstanden. In höherem Maße zu beanstandende Verunreinigungen
sind -gewisse histaminärtige Substanzen -öder Substanzgemische; welche 'eberifalls
die
Neigung haben, in die Enderzeugnisse überzugehen. Derartige Verunreinigungen können
bei therapeutischer Anwendung des Streptomycins toxische Wirkungen ausüben, insbesondere
vermögen sie histaminartige Wirkungen auf den Blutdruck auszuüben.
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Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung
und Entfärbung des Streptomycins, insbesondere zur Beseitigung histaminartiger Substanzen.
Das Reinigungsverfahren besteht im wesentlichen darin, daß eine etwa neutrale wäßrige
Lösung von Streptomycin finit Phenol extrahiert wird. Wie gefunden wurde, gelingt
es durch dieses Verfahren, sowohl die gefärbten Verunreinigungen wie auch die histaminartigen
Beimengungen praktisch vollständig zu beseitigen. Das zur Reinigung der wäßrigen
Streptomycinlösung verwendete Phenol kann von der wäßrigen Lösung durch Extraktion
mit geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Isoamylalkohol,
Äther u. dgl., getrennt werden. Die Phenolextralction kann fast in jeder Stufe des
Konzentrations- und Reinigungsverfahrens stattfinden. Es empfiehlt sich jedoch,
ein bereits partiell gereinigtes Streptomy cinkonzentrat, z. B. als Streptomycinhydrochlorid
mit einer Aktivität von etwa Zoo bis 30o Einheiten/mg der Phenolextraktion zu unterwerfen.
Konzentrate von anderen Streptomycinsalzen, wie z. B. Streptomycinsulfat, können
in entsprechender Weise gereinigt werden.
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In Ausübung der Erfindung kann man z. B. derart verfahren, daß ein
teilweise gereinigtes Streptomycinkonzentrat in Wasser gelöst wird, die Lösung durch
ein geeignetes Filter, z. B. bestehend aus Diatomaeen-Kieselsäure, filtriert wird
und der p '#Vert durch Zufügung von wäßrigem Alkali, t,-z. B. einer.n-Natriumhydroxydlösung,
auf etwa 6,5 eingestellt wird. Die neutraleLösung wird dann mit Phenol, vorzugsweise
in Form von etwa go0/aigem wäßrigem Phenol bei etwa 2;° extrahiert. Die Extraktion
kann z. B. derart durchgeführt werden, daß bestimmte Mengen der Lösung mit mehreren
Portionen von wäßrigem Phenol ausgezogen werden und die Auszüge miteinander vereinigt
werden. Man kann aber auch die Extraktion kontinuierlich in einer geeigneten Extraktionskolonne
durchführen. Die wäßrige Lösung wird alsdann mit einem geeigneten. mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittel. wie Isoamylalkohol. ausgezogen. An die Isoamvlallcoholextraktion
kann eine weitere Extraktion. z. B. mit Äther, angeschlossen werden, so daß man
schließlich eine wäßrige Lösung erhält, die frei ist von Phenol.
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Durch diese Behandlung gelingt es, go bis ioo% der histaminähnlichen
Stoffe zu entfernen. Die wäßrige Lösung besitzt alsdann etwa go bis 97% der ursprünglichen
@ Streptomycinaktivität. Die mechanische Trennung der Schichten erniedrigt zwar
etwas die Ausbeute, aber die Streptomycinaktivität kann praktisch vollständig erhalten
bleiben, indem man die organischen Auszüge mit Wasser auswäscht. Es wurde gefunden,
daß das Verhältnis ' von histaminähnlichen Stoffen zu Streptomycin in dem Waschwasser
nicht größer ist als in der Ausgangslösung und daß durch die folgende Phenolextraktion
des konzentrierten Waschwassers etwa go bis ioo% der histaminähnlichen Stoffe daraus
entfernt werden. Außer der praktisch quantitativen Beseitigung der histaminähnlichen
Substanzen werden gleichzeitig fast alle farbigen bzw. färbend wirkenden Stoffe
aus der Streptomycinlösung entfernt.
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Es wurde ferner gefunden, daß durch Verdampfen der mit Phenol extrahierten
wäßrigen Lösung ein Konzentrat erhalten wird, dessen Aktivität merklich höher ist
als die des Ausgangskonzentrats. Die Vergrößerung der Aktivität ist ausgeprägter,
wenn die Aktivität des Ausgangsmaterials sehr gering ist, aber selbst in Fällen,
in denen höher gereinigte Konzentrate, die z. B. eine Aktivität von etwa 60ö Einheiten/mg
aufweisen, verarbeitet werden, wird eine merkliche Vergrößerung der Aktivität erzielt.
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Phenol scheint mit Bezug auf Wirksamkeit eine Sonderstellung einzunehmen.
Einige Lösungsmittel, wie z. B. Butylalkohol, haben zwar ebenfalls eine gewisse
Wirksamkeit auf die Entfernung histaminartiger Stöffe aus basischen Lösungen, sie
sind aber unwirksam bei neutralen Lösungen. Mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel,
wie Butanol, Cyclohexanol, Anisol, Anilin, Propionitril, Furfuran, Benzaldehyd,
Chloroform, Benzol, Nitrobenzol, Nitromethan, sind unwirksam. Lösungsmittel, wie
Pyridin, Methanol, Dioxan, Formaldehyd, Essigsäure u. dgl., sind mit wäßrigen Lösungen
von Streptomycin mischbar und infolgedessen ungeeignet. o-Kresol ist zwar etwas
wirksam, aber dem Phenol so unterlegen, daß es praktisch nicht in Betracht kommt.
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Die Erfindung sei nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen erläutert.
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Beispiel i Eine Lösung von 711 g von teilweise gereinigtem Streptomycinhydrochlorid
mit 253 Einheiten/mg in i2oo ccm Wasser wurde durch ein geeignetes Filter filtriert
und i,oo ccm Wasser zum Nachwaschen verwendet. Nach Einstellung von pH = 6,5 mit
Hilfe von n-Natriumhydroxydlösung (95 ccm) betrug das Gesamtvolumen der Lösung 160o
ccm -(1d.00 ccm angewendetes Wasser). Diese Lösung wurde mit vier Portionen von
je 700 ccm von go%igem Phenol extrahiert, hierauf wurde mit drei Portionen
von je 700 ccm Isoamylalkohol und anschließend mit 700 ccm Äther extrahiert.
Nach dieser Behandlung war die wäßrige Lösung frei von Phenol.
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Eine Portion Wasser von 80o ccm wurde zum Auswaschen der aus organischen
Lösungsmitteln bestehenden Schichten verwendet, wobei mit dem ersten Phenolextrakt
begonnen wurde und anschließend die Isoamylalkohol- und Ätherextrakte behandelt
wurden.
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Die Originallösung enthielt, wie festgestellt wurde, i80 ooo ooo Einheiten
von Streptomycin mit einem Verhältnis von i70 Teilen Streptomycin
zu
o, i Teilen Histamin. Nach Extraktion enthält die Lösung 163 goo ooo Einheiten von
Streptomycin mit einem Verhältnis von 170o, Teilen Streptomycin zu o,i Teilen Histamin.
Die Rückwaschung liefert io ooo ooo Einheiten Histamin mit 17o Teilen Streptomycin
zu o,i Teilen Histamin. Dies bedeutet eine go%ige Beseitigung der histaminähnlichen
Verunreinigungen aus der Hauptfraktion, welche gi % des ursprünglich vorhanden gewesenen
Streptomycins enthält. Das Totalergebnis an Aktivität betrug 970/0.
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Bei anderen Versuchen wurden go bis ioo% der histaminartigen Stoffe
mit gleichen Ergebnissen mit Bezug auf Gesamtaktivität und einer Vergrößerung der
Potenz (Einheiten/mg) des, festen Stoffes von io.bis 50% je nach den anwesenden
Verunreinigungen erzielt. Hierbei wurden praktisch alle färbend wirkenden Verunreinigungen
aus den Streptomycinlösungen entfernt.
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Beispiel 2 Eine filtrierte Lösung von 12o9 g teilweise gereinigtem
Streptomycinhydrochlorid (62o Einheiter./mg) (streng positiver Pauly-Diazotest für
Histamin) wurde mit N-Natronlauge auf PH = 7,0 eingestellt und auf 2570 ccm
verdünnt. Hierauf wurden vier Portionen mit je 1300 ccm go%igem Phenol und anschließend
drei Extraktionen mit Amylacetat durchgeführt. Hierauf wurde eine praktisch farblose
phenolfreie Lösung erhalten. Die Lösungsmittelschichten wurden aufeinanderfolgend
mit zwei Portionen von je 65o ccm Wasser behandelt. Durch Kältetrocknung wurden
1o67 g von farblosen Streptomycinhydrochlorid (653 Einheiten/mg) aus der Hauptfraktion
erhalten. Der Pauly-Test für Histamin war negativ. Auch bei physiologischer Prüfung
mit 5ooo Einheiten Streptomycin pro Kilogramm Tiergewicht (Katze) wurden keine histaminähnlichen
Stoffe festgestellt. Aus den Waschflüssigkeiten wurden 1,05 g (500, Einheiten/mg)
gewonnen. Die direkte Ausbeute von 93% ergibt bei Zufügung der aus den Waschflüssigkeiten
gewonnenen Beträge einen Totalbetrag von etwa 99,811/o.