DE2339760C3 - Verfahren zur Gewinnung von reinem Äscin aus sauren Rosskastanienauszügen

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Description

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DE2339760C3

Publication number: DE2339760C3
Application number: DE19732339760
Authority: DE
Inventors: Max 8018 Grafing Stern
Original assignee: Klinge Pharma & Co 8000 Muenchen De GmbH; Klinge Pharma & Co 8000 Muenchen GmbH
Current assignee: Astellas Deutschland GmbH
Priority date: 1973-08-06
Filing date: 1973-08-06
Publication date: 1982-02-18
Also published as: DE2339760B2; ATA642474A; AT345992B; FR2241564B1; LU70678A1; BE818523A; DE2339760A1; FR2241564A1; NL7410571A

Zur Gewinnung von reinem Aescin kann man durch Erhitzen von sauren wäßrigen Roßkastanienextraktlösungen einen Teil der Triterpenglykoside in Form des schwerlöslichen kristallinen /?-Aescins ausfällen und isolieren (DDR-Patent 11 178). Ein anderer Weg führt über die Bildung eines schwerlöslichen Aescin-Cholesterin-Komplexes, aus dem nach Entfernen des Cholesterins neben J3-Aescin auch Λ-Aescin erhalten wird (Hoppe Seylers Z. physiol. Chem., 320,27 [I960]).

Man hat unter anderem auch schon versucht, durch Behandlung des Extraktes mit organischen Lösungsmitteln das Aescin von den Begleitstoffen abzutrennen. Gemäß dem in der DE-OS 16 17 581 beschriebenen Verfahren soll reines Aescin in quantitativer Ausbeute dadurch erhalten werden, daß wäßriger saurer Roßkastanienextrakt bei pH-Wert 0 bis 3 entweder mit aliphatischen 4 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkoholen oder mit einem Gemisch aus aliphatischen 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkoholen und Chlorkohlenwasserstoffen mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, insbesondere Chloroform, extrahiert wird. Wie der Beschreibung entnommen werden kann, soll bei diesem Verfahren das Verhältnis von Chloroform, Alkohol und wäßriger Säure 1:1:2 betragen, d. h., der Anteil an Wasser beträgt mindestens 50%. Auch ist gezeigt, daß die Verwendung von Methanol in diesem System zu sehr ungünstigen Trennwerten und geringen Aescinausbeuten führt. Aber auch bei Verwendung von Äthanol lassen sich die im Roßkastanienextrakt vorliegenden Flavonolglykoside auf Grund ihres ähnlichen Verteilungskoeffizienten größtenteils nicht von Aescin abtrennen. Man erhält daher doch noch gefärbte Endprodukte, wie dies bereits mit der in den Beispielen der Offenlegungsschrift erwähnten hellgelben bzw. hellbraunen Färbung des erhaltenen Aescins angedeutet wird.

Aus der Arbeit in Arch. Pharm., Bd. 296 (1963), S. 785 bis 791, ist auch ein analytisches' Verfahren zur Untersuchung der Triterpenglykoside des Roßkastanienextraktes bekannt, wobei ein ternäres Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisch im Volumenverhältnis von 35 :40 :25 verwendet wird. Mit Hilfe dieses Gemisches werden aus dem sauren Extrakt aber nur 42,8% der im Extrakt vorhandenen Triterpenglykoside in die sich bildende Unterphase übergeführt und können daraus isoliert werden.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß mit einem ternären Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser dann der größte Effekt erzielt wird, wenn ganz bestimmte Konzentrationen an Chloroform, Methanol und Wasser eingehalten werden. Beim Verfahren zur Gewinnung von reinem Aescin aus sauren Roßkastanienextrakten durch Verteilen des Extrakts in dieser ternären Emulsion bei einem pH-Wert von etwa 2,9 oder darunter und Isolierung des Aescins aus beim Stehenlassen der Emulsion sich absetzenden unteren Phase entsprechen erfindungsgemäß die Volumenteile der Emulsion der in F i g. 1 gezeigten schraffierten Fläche des Dreistoffdiagramms. Wie dem Diagramm zu entnehmen ist, liegt das bekannte ternäre Lösungsmittelgemisch etwas oberhalb des beanspruchten Bereichs. Es war nicht vorhersehbar, daß die Verwendung der gleichen Lösungsmittel bei Wahl der Zusammensetzung innerhalb eines relativ schmalen Bereichs der Volumenverhältnisse zu einer starken Verbesserung der Extraktionswirkung führt.

Das Verfahren kann in der Weise durchgeführt werden, daß man den Kastanienextrakt unter kräftigem Rühren mit dem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser in den erfindungsgemäßen Verhältnissen löst, kräftig emulgiert und nach dem Stehenlassen und Trennen der Emulsion die untere Phase isoliert und daraus das Aescin gewinnt. Vorzugsweise wird man die untere Phase nochmals mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser in einem Mengenverhältnis, wie es der abgetrennten oberen Phase entspricht, intensiv vermischen, um eine noch bessere Reinigung der unteren Phase von Begleitstoffen zu erreichen. Die Zusammensetzung der oberen und unteren Phase einer Emulsion aus vorgegebenen Anteilen von Chloroform, Methanol und Wasser läßt. sich aus dem Diagramm der F i g. 1 entnehmen.

Die ternären Systeme von nicht miteinander mischbaren Lösungsmitteln ergeben viele Phasenpaare. Das

Verteilungsverhalten wird dabei vom jeweiligen Anteil der drei Lösungskomponenten in Ober- und Unterphase beeinflußt, wobei jeder Oberphasenmischung nur eine entsprechende Unterphasenmischung zuordnet werden kann. Diese Zuordnung gelingt an Hand einer Binodalkurve (= Grenzlösüchkeitskurve) in einem Diagramm des entsprechenden ternären Systems sowie der dazu passenden Konoden (vgL »Die Phasenregel«, Verlag Chemie, 1958).

Ein bestimmtes Gemisch aus drei teilweise mischbaren Lösungsmittelkomponenten, die oberhalb der Binodalkurve als homogene Phase, darunter aber in zwei Phasen vorliegen und beim intensiven Rühren eine Emulsion bilden, IaBt sich durch einen Punkt im Dreieckskoordinatennetz charakterisieren, wobei dann die bei der Trennung sich bildenden Phasen in ihrer Zusammensetzung aus dem Diagramm ermittelt werden können.

In der F i g. 1 ist das Dreistoffdiagramnr. des ternären Systems für das Lösungsmittelgemisch Chloroform — Methanol — Wasser bei Zimmertemperatur, d. h. etwa 23° C, gezeigt, wobei die Eckpunkte der schraffierten Flächen 1, 2, 3 und 4 den beanspruchten Konzentrationsbereichen von Chloroform, Methanol und Wasser entsprechen, wie sie auch in der folgenden Tabelle I aufgeführt sind.

In diesen Kor.zentrationsbereichen lassen sich Gemische herstellen, die sich in zwei Phasen trennen, die für eine selektive Extraktion von Aescin besonders geeignet sind. Die sich automatisch einstellende Lösungsmittelzusammensetzung der jeweils entstehenden Phasen geht aus den Gemischpunkten a, b, c und d des Diagramms hervor, die in der Tabelle II angegeben sind.

Tabelle II Gemischpunkte

a b c d

Chloroform

Methanol

Wasser

Summe

3% 8% 85% 93,5%

44% 51% 13,5% 6,2% 53% 41% 1,5% 0,3%

100% 100% 100%

100%

Hierbei entspricht a der Oberphasenzusammensetzung eines Gemisches 1 im Bereich der Grenzwerte und 4, während d der Unterphasenzusammensetzung der Gemische 1 und 4 entspricht.

Der Wert b entspricht der Oberphasenzusammensetzung von Gemisch 2 und 3, während c der Unterphasenzusammensetzung von Gemisch 2 und 3 entspricht.

Die Zusammensetzung der Oberphase, die sich bei Verwendung des beanspruchten Mischungsverhältnisses der Emulsion nach der Phasentrennung ergibt, ist durch die Strecke a, b im Diagramm der F i g. 1 gezeigt, während die Zusammensetzung der Unterphase aus der Strecke c, d zu entnehmen ist

Das beim Stand der Technik gemäß DE-OS Ϊ6 17 581 verwendete Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Metnanol und wäßriger Säure im Verhältnis 1 :1 :2 ist in dem Diagramm durch den Punkt 5 dargestellt, eine Mischung, die weit außerhalb des beanspruchten Bereiches liegt Obwohl der Wasseranteil von Gemisch ίο 1 und 5 fast gleich liegt, kann man erkennen, daß sich die Mischungen deutlich unterschieden. Eine durch 5 durchzogene Konode gibt Auskunft über die Zusammensetzung der sich bildenden Ober- bzw. Unterphase. Nach dem Diagramm ergibt sich, daß die Oberphase eine Zusammensetzung von Chloroform — Methanoi - Wasser = 1,5% - 32,5% - 66% und die Unterphase Chloroform — Methanol — Wasser = 97,0%-2,9%-0,1% besitzt Darauf ist auch zurückzuführen, daß in der DE-OS 16 17 581 die Verwendung dieser Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser als ungünstig für den Trenneffekt beurteilt wurde.

Eine Extraktion von Aescin aus Roßkastanienauszügen setzt voraus, daß Aescin in seiner Säureform vorliegt. Dies kann durch Zugabe von Mineralsäure erreicht werden, wobei ein Überschuß wegen Hydrolysegefahr vermieden werden soll. Auch bei der Reinigung durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Emulsion muß das Aescin in Säureform vorliegen, weshalb der pH-Bereich auf einen Wert von etwa 2,9 oder darunter eingestellt werden muß.

Das Verteilungsverhalten von Roßkastanienextrakt in den verschiedenen ternären Systemen geht aus den Daten von Tabelle III hervor. Die Analyse der Extraktfraktionen zeigt, daß nach dem ersten Vertei lungsschritt bereits deutliche Qualitätsunterschiede bei Verwendung verschiedener ternärer Systeme auftreten, wobei die Versuche mit Gemisch 1 und 2 gemäß der Erfindung vorgenommen wurden. Die Bestimmung des Aescins erfolgte nach E. Kammerl und W. Schlemmer (Pharm. Ind.. 34. 356 [1972], die der Flavonolglykoside nach ). Wagner (Arzneimittel-Forsch.. 17,546 [1967]).

Wie die Werte in Tabelle III zeigen, ist der höchste Aescingehalt mit der geringsten Färbung durch Verteilung von Roßkastanienextrakt im Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisch zu erzielen, wenn ein Verhältnis gewählt wird, das eine geringe, jedoch an Chloroform reiche untere Phase ergibt (Versuch 2).

Die Wirtschaftlichkeit des Verteilungsverfahrens wird vom Aufwand an wertvollen Lösungsmitteln stark beeinflußt. Im Falle des Chloroform-Methanol-Wasser-Systems bedeutet dies, den Anteil an Chloroform auf ein Mindestmaß zu verringern. Dies gelingt durch Verschiebung des Gemischpunktes auf einer geeigneten Konode. Dabei wird zwar das Verhältnis von Ober- zu Unterphase geändert, nicht jedoch die Zusammensetzung der Phasen. Den Einfluß auf die Ausbeute an extrahierbarem Material aus Roßkastanienextrakt in Abhängigkeit der Phasenmengenverhältnisse bei konstanter Phasenzusammensetzung zeigt F i g. 2.

Die Ausbeute an extrahierbarem Material wird durch Verkleinerung der Unterphase nur geringfügig reduziert. Der limitierende Faktor ist das zur Extraktion benötigte Mindestvolumen an Unterphase. Die Reduziei^ng der Unterphase wirkt sich günstig auf den Flavonolglykosidgehalt des extrahierten Materials aus. Wie Fig. 3 zeigt, verringert sich der Flavonolglykosidgehalt bei Änderung des Verhältnisses von Ober- zu Unterphase von l/l auf 10/1. von 1,5 auf 1%.

Tabelle III

Losungsmittelgemisch Anteile in Volumprozent

Gesamtausbeute Aescingehalt

Flavonolglykosidegehalt

Zuckergehalt

Gemisch 1	= 48/27/25
CHCyCHaOH/HaO	= 4/47/49
Oberphase	= 92/7/1
Unteφhase	= 1/1
Oberphase/Unterphase
Gemisch 2	= 13/42/45
CHCI3/CH3OH/H2O	= 4/47/49
Oberphase	= 92/7/1
Unterphase	= 10/1
Oberphase/Unterphase
Gemisch 3	= 41/24/35
CHCI3/C2H5OH/H2O	= 2/30/68
Oberphase	= 83/16/1
Unterphase	= 1/1
Oberphase/Unterphase
Gemisch 4	= 20/30/50
CHCI₃ZC₃O₇OHZH₂O	= 0/11/89
Oberphase	= 66/32/2
Unterphase	= 1,2/1
OberphaseZUnterphase
Gemisch 5	= 40/10/50
CHCI3ZC4H9OHZH2O	= 1,1/1,0
Oberphase/Unterphase

21,5%

20%

28,1%

30,4%

25,5%

Ein Vergleich der Daten von Gemisch 1 und 2 in Tabelle i zeigt, daß bei Verwendung einer geeigneten Oberphase und der dazugehörenden Unterphase durch Veränderung der Phasenvolumina einerseits der Anteil an wertvollem Lösungsmittel — in diesem Fall Chloroform — verringert werden kann, andererseits die Qualität des extrahierbaren Materials gesteigert wird.

Zur weiteren Anreicherung des Aescins genügt es. die abgetrennte Unterphase ein- bis zweimal mit frischer Oberphase auszuschütteln. Eine nachfolgende behandlung mit Aktivkohle führt zu rein weißem Aescin.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auch unmittelbar von den sich bei dem erfindungsgemäßen Bereich der Anteile der Lösungsmittel einstellenden Phasen ausgehen, indem man die Konzentration der Komponenten bei zwei Lösungsmittelgemischen entsprechend der oberen und unteren Phase wählt. Den Kastanienextrakt löst man dann in einem der Phasengemische, vorzugsweise in dem Gemisch, das der oberen Phase entspricht, worauf man das zweite Gemisch entsprechend der anderen Phase hinzufügt und mit der ersten Phase in Berührung bringt. z. B. intensiv mischt und emulgiert worauf man die zwei Phasen wieder trennt und das Aescin aus der unteren Phase isoliert.

Wie aus dem Dreistoffdiagramm der F i g. 1 ersichtlich ist betragen bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung der Emulsion die Anteile in der Oberphase an Chloroform 3 bis 8%, an Methanol 44 bis 51 % und an Wasser 41 bis 53%, während sich in der entsprechenden Unterphase 85 bis 93,5% Chloroform, 6,2 bis 133% Methanol und 03 bis 13% Wasser befinden.

Diese Arbeitsweise unter Verwendung der Lösungen entsprechend der oberen und unteren Phasen eignet sich auch für ein kontinuierliches Gegenstromverfahren zur Isolierung des Aescins.

80%

85%

76%

61,5%

72,6%

1,5%

1%

2,50/0

3,4%

5,7%

Folgende Beispiele sollen
Verfahren näher erläutern.

etwa 18%

etwa 14%

etwa 21%

etwa 35%

etwa 21%

das erfindungsgemäße

Beispiel 1

100 g Roßkastanienextraktpulver werden in einem Gemisch aus 424 ml Methanol und 440 ml Wasser gelöst und mit etwa 5 ml 5-m Schwefelsäure auf pH 2,9

<»o angesäuert. Zur klaren Lösung werden 130 ml Chloroform hinzugefügt und nach kurzem Schütteln die Phasen zur Trennung gebracht. Die abgetrennte Unterphase wird zweimal mit je 200 ml frischer Oberphase (8 ml Chloroform, 93 ml Methanol. 99 ml Wasser) ausgeschüttelt und nach dem Trennen der Phasen die Unterphase im Vakuum zur Trockne gebracht. Der helle Rückstand wird in Methanol aufgenommen und mit wenig Aktivkohle behandelt.

Ausbeute: 15 g weißes Pulver. Aescingehalt >99% (titrimetrisch). Dünnschichtchromatographisch mit Standardaescin vergleichbar.

Beispiel 2

100 kg Roßkastanienextrakt mit 39 Gewichtsprozent Methanol und 103 Gewichtsprozent Trockensubstanz werden mit 1,6 kg 5 η-Salzsäure auf pH 23 angesäuert und in einer Verteilungsanlage mit 2235 kg Chloroform vermischt Die abgetrennte Unterphase wird mit 20 kg frischer Oberphase (13 kg Chloroform, 8 kg Methanol, 10.7 kg Wasser) gewaschen und die anfallende Unterphase im Grobvakuum vom Lösungsmittel befreit Der blaßgelbe Rückstand wird in methanolischer Lösung mit Aktivkohle behandelt und nach Filtration zur Trockne gebracht

Ausbeute: 17 kg weißes Pulver, Aescingehalt >95% (titrimetrisch). Dünnschichtchromatographisch mit Standardaescin vergleichbar. -

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Tabelle I

Gemischpunkte
1 2

15%
47,5%
37,5%

78%
17%
5%

86%
9,5%
4,5%

11%
41%
48%

Chloroform
Methanol
Wasser

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von reinem Aescin aus sauren Roßkastanienextrakten durch Verteilen des Extraktes in einer ternären Emulsion eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser bei einem pH-Wert von etwa 2,9 oder darunter und Isolieren des Aescins aus der beim Stehenlassen der Emulsion sich abtrennenden unteren Phase, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumenanteile der Emulsion dem Bereich 1, 2, 3, 4 des Dreieckdiagramms Methanol-Chloroform-Wasser nach F i g. 1 entsprechen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Dreistoffdiagramm Chloroform, Methanol und Wasser und der für jede Zusammensetzung der Emulsion zugehörigen Konode die Zusammensetzung der oberen und unteren Phase ermittelt, die entsprechenden Lösungsmittelgemische herstellt, in der Lösung gemäß der oberen Phase den Kastanienextrakt aufnimmt und mit der Lösung der unteren Phase in Berührung bringt, vorzugsweise durch intensives Rühren die Phasen miteinander vermischt und emulgiert, worauf nach dem Trennen der Phasen das Aescin aus der unteren Phase isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Trennen der Phasen die untere Phase mindestens noch einmal mit frisch zubereiteter oberer Phase in Berührung bringt und dadurch wäscht, bevor das Aescin isoliert wird.