DE3345445C2 - Verfahren zur Reinigung von 4-Demethoxy-daunorubicin und 4-Demethoxy-doxorubicin durch selektive Adsorption an Harzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von 4-Demethoxy-daunorubicin und 4-Demethoxy-doxorubicin durch selektive Adsorp­ tion an Harzen.

Das Erfordernis nach einer sehr spezifischen Methode zum Erhalt der genannten Glykoside in praktisch rei­ ner Form ergibt sich in der Hauptsache daraus, daß sowohl bei den fermentativen Herstellungsverfahren als auch bei den synthetischen Herstellungsverfahren die Menge an organischen und anorganische Verunrei­ nigungen im Rohprodukt besonders hoch ist und im Durchschnitt zwischen 12 und 25% liegt.

Die bisher bei bekannten Reinigungsverfahren angewen­ deten üblichen Methoden, die eine Extraktion des Roh­ produktes mit chlorierten Lösungsmitteln und anschließenden Waschschritten mit Puffern vorsehen, führen jedoch zu einem Endprodukt, bei welchem der Prozentsatz der Verunreinigungen, der zwar deutlich reduziert wurde, immer noch im Bereich von 4,5 bis 5,0% liegt.

Während dieser Reinheitsstandard in Anbetracht der Empfindlichkeit des Glykosidmoleküls gegenüber der üblichen Handhabung sowie chemischen Agentien im all­ gemeinen als akzeptabel angesehen wird, so besteht doch ein Bedarf nach einer verbesserten Reinigungsme­ thode, mit welcher ein praktisch reines Endprodukt erhalten wird. Im Hinblick auf die spezielle Verwen­ dung des 4-Demethoxy-daunorubicins und 4-Demethoxy-doxorubicins in der klinischen Praxis als Antitumor-Agenz sowie in Anbetracht der Probleme bei der Dosierung und Toxizität ist es ver­ ständlich, daß eine optimale Eliminierung von Verun­ reinigungen, die im allgemeinen stark toxisch sind, angestrebt wird. Dies stellt die Aufgabe der vorlie­ genden Erfindung dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren, mit welchem ein End­ produkt mit maximal 3% Verunreinigungen erhalten wird, basiert im wesentlichen auf einem Verfahren, das die Adsorption des Rohproduktes an verschiedenen Harztypen in Saurem Medium (pH = 3-5) und nachfol­ gende Eluierung mit Wasser oder Gemischen aus Wasser und einem polaren Lösungsmittel umfaßt. Insbesondere umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren eine Phase, bei welcher das leicht saure wäßrige Medium, welches die wasserlösliche, gelöste Substanz enthält, am Harz, welches in Partikelform, wie Granalien oder Kü­ gelchen, dispergiert ist, adsorbiert wird, und eine folgende Stufe der Desorption (de-adsorption) der Substanz, die in der ersten Phase oder Passage adsor­ biert worden war.

Das Adsorptionsharz kann in einer geeigneten Vorrich­ tung bzw. einem Gefäß oder einem Behälter, welche im allgemeinen praktisch die Form eines Turmes oder einer Säule haben, die auf einfache Weise mit Harz­ partikel gefüllt werden, enthalten sein. Je nach dem Typ der im Rohprodukt enthaltenen Verunreinigungen, kann das Eluat, welches durch Stoffdesorption vom ersten Harztyp erhalten wird, im folgenden auf einfa­ che Weise an einem Harz eines unterschiedlichen Typs adsorbiert werden, von welchem es dann nach bekannten Verfahren eluiert wird.

Bei dem vorliegenden chromatografischen Reinigungsv­ erfahren wurden Adsorptionsharze des Polymer- und Ionenaustauschtyps oder vom Carboxymethylcellulose- Typ eingesetzt. Die leicht saure Umge­ bung während der Adsorption, ermöglicht einen hohen Reinheitsgrad des Endproduktes, die Vermeidung der Verwendung von chlorierten organischen Lösungsmitteln und ausgezeichnete Ausbeuten bei der Reinigung.

Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher beschreiben, ohne dieses zu be­ schränken.

Beispiel 1 Reinigung von 4-Demethoxy-daunorubicin

15,0 g 4-Demethoxy-daunorubicin im Rohzustand mit einem Titer von 70,2% als solchem und einem Gehalt an Verunreinigungen von 18%, werden in 3,6 l einer 0,5%igen Natriumacetatlösung aufgelöst. Die Lösung, die durch Zugabe von Essigsäure auf pH 4,7 gebracht wird, wird an 400 ml Amberlite XAD2®- Harz in einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm adsorbiert. Das Produkt wird mit 1000 ml Was­ ser gewaschen und dann mit einem Gemisch aus Wasser/ Methanol (5 : 1, V/V) eluiert. Als erstes Eluat werden 2.000 ml Lösung, welche Aglucone und verschiedene Verunreinigungen enthalten, gesammelt.

Die Eluierung wird mit einem Gemisch aus Wasser/Me­ thanol (1 : 1, V/V) fortgesetzt und eine Fraktion von 4.500 ml gesammelt: Das Eluat enthält in Lösung das genannte 4-Demethoxy-daunorubicin, zusammen mit 10% Verunreinigungen.

Das Eluat wird daraufhin durch Zugabe von Salzsäure auf pH 2,8 gebracht und dann im Vakuum auf ein Volu­ men von 1.500 ml konzentriert. Durch Zugabe von Na­ triumacetat zu der konzentrierten Lösung wird der pH-Wert auf 4,0 gebracht und die leicht saure Lösung an 150 ml CM Sepharose Cl 6B®-Harz adsorbiert, wobei sich das genannte Harz in einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm befindet; die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 150 ml/h. Nach Be­ endigung der Adsorption wird die Säule zuerst mit 450 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,03%iger Salzsäure eluiert.

Die ersten 800 ml Eluat, welche 18% Verunreinigungen enthalten, werden durch Zugabe von Natriumacetat auf pH 4,7 gebracht und zum Recyclisieren mit der rohen 4-Demethoxy-daunorubicin-Lösung, die als ersten Rei­ nigungsschritt an Amberlite XAD2®-Harzen adsorbiert werden muß, gesammelt.

Das folgende Eluat (3.500 ml), welches reines 4-De­ methoxy-daunorubicin enthält, wird im Vakuum auf ein Volumen von 50 ml konzentriert. Es werden 250 ml Ace­ ton zugegeben, der erhaltene Niederschlag filtriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. In einer Ausbeu­ te von 52%, berechnet auf der Grundlage des ur­ sprünglichen Rohproduktes, wird 4-Demethoxy-daunoru­ bicin mit einem Titer von 97% und einem Gehalt an Verunreinigungen von weniger als 3% erhalten.

Beispiel 2 Reinigung von 4-Demethoxy-doxorubicin

2.000 ml wäßrige Lösung, welche 10,4 g 4-Demethoxy-do­ xorubicin mit einem Gehalt an Verunreinigungen von 14% enthielt, wurde an 50 ml ER180®- Harz, welches in einer Säule mit einem Durch­ messer von 2,5 cm enthalten war, bei einer Durchflußrate von 250 ml/h adsorbiert.

Das Eluat, welches teilweise durch selektive Adsorp­ tion von Verunreinigungen gereinigt war, wurde dann an 200 ml CM Sepharose 6B®-Harz adsor­ biert. Das Produkt wurde mit einem Gemisch aus Metha­ nol 50, Wasser 50 und 0,015 konzentrierter Salzsäure eluiert, wobei die Kopffraktionen (ca. 800 ml), wel­ che die Aglucone und andere Verunreinigungen enthiel­ ten, verworfen wurden. 2000 ml Eluat, welches die reine Substanz enthielt, wurde dann gesammelt und im Vakuum zu 60 ml konzentriert. Unter dreistündigem Rühren wurden 300 ml Aceton zugegeben; der Nieder­ schlag wurde filtriert, mit Aceton gewaschen und ge­ trocknet. In einer 58,2%ige theoretischen Ausbeute wurden 6,5 g reines 4-Demethoxy-doxorubicin mit einem Verunreinigungsgehalt von 3% erhalten.

Claims (2)

1. Verfahren zur Reinigung von 4-Demethoxy-daunorubicin mit einem Titer von 70,2% und mit einem Gehalt an Verunreinigungen von 18%, erhalten durch ein fermentatives oder synthetisches Verfahren, wobei organische und anorganische Verunreinigungen entfernt werden, gekennzeichnet durch Adsorbieren einer wäßrigen Lösung des rohen 4-Demethoxy-daunorubicin mit einem pH von 4,7 und einer Konzentration von etwa 0,4% an Amberlite XAD2® als Ionenaustauschharz, wobei das Verhältnis von Harz zu 4-Demethoxy-daunorubicin etwa 26 : 1 (V/G) ausmacht, Deadsorbieren des 4-Demethoxy-daunorubicins durch Elution mit einer 1 : 1 (V/V)-Mischung aus Wasser und Methanol, Readsorbieren des Eluates nach dem Konzentrieren im Vakuum, und Deadsorbieren bei einem pH-Wert von 4,0 an CM Sepharose Cl 6B durch Elution mit 0,03%iger Salzsäure, Konzentrieren des Eluates im Vakuum und anschließendes Isolieren des so gereinigten 4-Demethoxy-daunorubicins mit einem Titer von 97% und einem Gehalt an Verunreinigungen von weniger als 3%.

2. Verfahren zur Reinigung von 4-Demethoxy-doxorubicin mit einem Gehalt von 14% an Verunreinigungen, erhalten durch ein fermentatives oder synthetisches Verfahren, wodurch organische und anorganische Verunreinigungen davon entfernt werden, gekennzeichnet durch Durchleiten einer wäßrigen Lösung des rohen 4-Demethoxy-doxorubicins mit einer Konzentration von etwa 0,5% durch Amberlite ER 180® als Ionenaustauschharz, wobei das Verhältnis von Harz zu 4-Demethoxy-doxorubicin etwa 4,8 : 1 (V/G) ist, wodurch ein Teil der Verunreinigungen an dem Harz adsorbiert wird, Readsorbieren des Eluates an CM Sepharose Cl 6B und Deadsorbieren des 4-Demethoxy-doxorubicins durch Elution mit einer 1 : 1 (V/V)-Mischung von leicht saurem Wasser und Methanol, Konzentrieren des Eluates im Vakuum und anschließendes Isolieren des gereinigten Produktes mit einem Gehalt an Verunreinigungen von etwa 3%.