DE3404242A1 - Verfahren zum aufarbeiten von vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und andere corrinoide enthaltende fermentationsfluessigkeiten - Google Patents

Description

VERPAHREIi ZUM AUFARBEITE* VOIi VITAMIN B TTvn ^m

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufarbeiten von Vitamin B₁₂ und andere Corrinoide enthaltende Fermentationsflüssigkeiten zur Herstellung von Vitamin E^-Könzentrationen bzw. von -kristallinem Vitamin B, - -

12·

Es ist bekannt, dass bei der auf mikrobiologischem Weg erfolgenden Herstellung von Vitamin B₁₂ und anderen Corrinoiden das durch die Mikroorganismen produzierte Vitamin B-, ρ sich überwiegend intrazellular anhäuft; deshalb wird zur Isolierung der Wirkstoffe im allgemeinen derart gearbeitet, dass man nach der Beendigung der Fermentation die erhaltene Zellenmasse aus der Fermentationsbrühe z.B. durch Filtrieren, Sedimentieren und/oder Zentrifugieren abtrennt, die in dieser C übrigens in getrockneter Form auch unmittelbar

■- ^: ■ -■ ■ 3Λ04242

als B₁₂-vitaminhaltiger Tierfutterzusatz verwendbaren) sog. Biomasse enthaltenen Bakterienzellen aufschlieast, wobei das Vitamin B-, _? u²¹^ ^i^e anderen Corrinoide in das AufSchliessungsmedium gelangen und daraus - nach dem durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren erfolgenden Entfernen der Zellenteile und anderer fester Verunreinigungen und gegebenenfalls nach weiteren Reinigungs- bzw. Anreicherungsoperationen - durch Extraktions- oder Adsorptionsmethoden isoliert werden können.

Die zur mikrobiologischen Herstellung und Isolierung von Vitamin B₁₂ und anderen Corrinoiden bisher bekannten und verwendeten Verfahren sind z.B. in der Monographie von W. Friedrich "Vitamin B-, ₂ und verwandte Corrinoide" C im. Werk von R. Amnon: Fermente- -Hormone-Vitaminej Bd. III/2, G. Thieme Verlag, Stuttgart, 1975·» Seiten 10-13) zusammenfassend beschrieben.

Bei der Durchführung der oben geschilderten bekannten Verfahren werden.bedeutsame Schwierigkeiten dadurch verursacht, dass die Isolierung der die Corrinoide enthaltenden Mikroorganismenzellen aus der Farmentat ionsbrühe technologisch nicht Jj₁ guter Ausbeute durchgeführt werden kann. Weitere Schwierigkeiten ergeben sich-dadurch, dass das zu isolierende Vitamin

B₁₂ in der Fermentationsbrühe nur in sehr niedriger Konzentration und in Begleitung von grossen Mengen von aus der Fermentation stammenden, teils suspendierten, teils gelösten Verunreinigungen vorliegt, wodurch die gewünschten Wirkstoffe aus der na:h dem Aufschliessen der Zellen erhaltenen sehr verdünnten Lösung nur sehr schwer auf wirtschaftliche und technisch rationelle Weise isoliert werden können. Besonders schwerwiegend sind diese Schwierigkeiten bei dem Aufarbeiten von mit Abwasserschlamm inokulierten Fermentatbnsbrühen oder anderen mit stark verunreinigten Ausgangsstoffen durch-

COPV

geführten septischen Fermentationen, bei denen die produzierten Corrinoide aus wesentlich mehr und auch schwieriger entfernbare Verunreinigungen enthaltenden Medien isoliert werden müssen, als z.B. bei mit Propionibakterien durchgeführten aseptischen Fermentationen.

Zur Beseitigung dieser Schwierigkeiten wurden schon zahlreiche verschiedene Verfahren vorgeschlagen, bei welchen meistens verschiedene zusätzliche Reinigungsoder Anreicherungsoperationen zurErleichterung der Gewinnung des Vitamins Β·, ρ ^ reinen Zustand vorgeschlagen wurden.

So wurden nach der ungarischen Patentschrift Ur. 158 809 aus der mit Propionibacterium shermanii erhaltenen Fermentationsflüssigkeit die Zellen abgetrennt, die so erhaltene Biomasse aufgeschlossen und der pH-Wert des Mediums stufenweise auf 5,5 bis 6,5 eingestellt, wobei ein Teil der begleitenden Verunreinigungen, besonders die Proteine an der aufgeschlossenen Biomasse selbst gebunden wurden, während das Vitamin B,ρ in der Lösung blieb.

Die aufgeschlossene Biomasse wurde dann zusammen mit den anhaftenden Verunreinigungen durch Zentrifugieren oder Sedimentieren abgetrennt und das Vitamin B, ρ '^an<^ £ie übrigen Corrin.oide wurden aus der auf diese Weise gereinigten Lösung mit Hilfe von Ionenaustauschern gebunden und isoliert. Die grossbetriebliche Verwirklichung dieses Verfahrens ist aber ziemlich schwierig, da die aufgeschlossenen Zellen mit den anhaftenden Verunreinigungen nur schwer von der flüssigen Phase abgetrennt werden können, während die Anwendung von Filter- und Sedimentierhilfsstoffen erhebliche Wirkstoffverluste verursachen kann.

Nach der sowjetischen Patentschrift ITr. 161 wurde die gesamte Fermentaxionsflüssigkeit oder die abgetrennte Biomasse durch '"anhebehandlung in saurem Medium aufgeschlossen, die festen Teile wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und aus der überstehenden Flüssigkeit wur-

den die Wirkstoffe an Aluminiumoxid oder an einem Ionenaustauscherharz gebunden. Die Zellenteile von Mikronen- -Grössenordnung und die übrigen suspendierten feinen Peststoffteilchen können aber durch Zentrifugieren nicht vollständig entfernt werden, während die zurückbleibenden feinen festen Verunreinigungen bei der Adsorption der Wirkstoffe störend wirken und den Effekt der Gewinnung herabsetzen, wobei die Durchführung dieses Prozesses noch durch weitere technologische Schwierigkeiten er-0 schwert wird.

Die Gewinnung der Wirkstoffe aus den aufgeschlossene Zellenteile und sonstige feste Verunreinigungen enthaltenden Fermentationsflüssigkeiten wurde durch die Anwendung von sogenannten makroretikularen Adsoprtionsharzen erheblich erleichtert. Dieses harten, unlösbaren, porösen, apolaren oder in verschiedenen Grad polaren Perlpolymere mit grosser spezifischer Oberfläche haben den wichtigen Vorteil, dass sie infolge ihrer günstigen Porengrösse, Eörnchengrösse und mechanischen Stabilität die Adsorption der gelösten Wirkstoffe auch aus feste Teilchen enthaltenden flüssigen Gemischen ermöglichen. So kann bei dem Aufarbeiten von Fermentationsflüssigkeiten das meistens schwierige Filtrieren oder Zentrifugieren vermieden werden, die gesamte Fermentationsflüssigkeit kann unmittelbar in das Adsorptionssystem eingeführt werden, wobei das Adsorptionsharz z.B. durch Einrühren oder in fluidem Bett mit der Fermentationsflüssigkeit in Kontakt gebracht werden kann. Die direkte Zuführung der Fermentationsflüssigkeit sum Adsorbenten hat aber den Nachteil, dass zusammen mit dem gewünschten Wirkstoff auch erhebliche Mengen von Verunreinigungen auf dem Harz adsorbiert werden. Dieser Umstand erschwert auch die Anwendung dieser Methode zur direkten Adsorption der Wirkstoffe aus den Fermentationsflüssigkeiten, obwohl es bekannt ist C vgl.- US-PS 3 531 463), dass die Corrinoide durch gewisse makroretikulare Harze

auch aus konzentrierten wässrigen Lösungen adsorbiert v/erden und dass die adsorbierten Corrinoide von diesen Harzen durch geeignete Lösungsmittel gut eluiert werden können. Es war aber bisher kein technologisch leicht durchführbares Verfahren zur direkten Adsorption der Corrinoide aus Fermentationaflüssigkeiten bekannt, welches neben der Eliminierung der erwähnten Nachteile der bekannten Methoden-das- Gewinnen der Wirkstoffe in befriedigender Reinheit und in guter Ausbeute ermöglichen könnte.

Es wurde nun gefunden, dass die durch Mikroorganismen erzeugten und in der Fermentationsflüssigkeit intrazellular anwesenden Corrinoide nach einem neuen zweistufigen Adsorptionsverfahren in guter Reinheit und jja hoher Ausbeute, ferner auch ohne Schädigung des Adsorbentharzes gewonnen werden können, wenn man auf die folgende Weise arbeitet:

Im ersten Schritt des Verfahrens wird die bei der Beendigung der Fermentation erhaltene, noch unversehrte Zellen enthaltende Fermentationsflüssigkeit ohne irgendwelche Vorbehandlung, bei Raumtemperatur mit einem makroporösen, sog. makroretikularen Adsorptions-• harz mit grosser spezifischer Oberfläche behandelt. Unter solchen Bedingungen werden an dem makroretikularen Harz nur die anwesenden unaufgebrauchten Zusatzstoffe des Nährbodens, sowie die im Laufe der Fermentation entstandenen StoffWechselprodukte gebunden, ?iährend die unaufgeschlossenen, intakten Zellen mit den in ihnen enthaltenen Corrinoiden in der flüssigen Phase suspendiert bleiben.

ITach dieser Ξ-ehandlung werden die in der auf obige V/eise schon in erheblichem Hass gereinigten Fermentationsflüssigkeit anwesenden Zellen in bekannter Weise, z.3. durch in Gegenwart von Cyanid-Ionen vorgenommenen Wärmebehandlung aufgeschlossen, wobei die

Corriiioide in die Lösung kommen, während die Bruchteile der ausgeschlossenen Zellen in suspendiertem Zustand in der Fermentationsflüssigkeit bleiben.

Die auf diese Weise behandelte Fermentationfiflüssigkeit wird dann unmittelbar, ohne vorherige Abtrennung dieser suspendierten Zellenbruchteile und anderer fester Verunreinigungen, einer zweiten Behandlung mit einem makroretikularen Adsorptionsharz uterworfen, wobei nunmehr die Wirkstoffe selbst an dem Adsorbenten gebunden werden. Da bei der AufSchliessung der Zellen unvermeidlich auch lösliche Verunreinigungen aus den Zellen in Lösung gehen, wird bei diesem zweiten Adsorptionsschritt auch ein Teil dieser löslichen Verunreinig gungen auf dem Harz adsorbiert; diese Verunreinigungen können aber durch ?/aschen des Harzes mit alkalisch gemachtem Wasser weitgehend selektiv von der Oberfläche des Harzes entfernt werden, während die Corrinoide selbst auf dem Harz gebunden bleiben.

Bei dem Aufarbeiten von weniger veruneinigten, z.B. aus aseptischen Fermentationen stammenden Fermentationsflüssigkeiten kann es vorkommen, dass bei diesem zweiten Adsorptionsschritt keine solche lösliche Verunreinigungen' auf dem Harz adsorbiert werden; in solchen Fällen kann die erwähnte wässrig-alkalische Behandlung des die Corrinoide adsorbiert enthaltenden Harzes unterbleiben, da schon durch ein einfaches wässriges Waschen die anwesenden festen Verunreinigungen ausgewaschen werden können, so dass nachher die adsorbierten Corrinoide in guter Reinheit eluiert werden können.

Das auf obige Weise mit alkalischem bzw. einfachem Wasser gewaschene Harz wird .dann zwecks Gewinnung der adsorbierten Corrinoide mit einem mit Wasser mischbaren, gegebenenfalls auch Wasser enthaltenden organischen. Lösungsmittel, z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol oder Keton eluiert. Das Eluat kann dann auf bekann-

te Weise zur Herstellung von Vitamin 3-,ρ enthaltenden Futtermittelzusätzen oder zum Gewinnen von reinem kristallinen Vitamin B₁₂ ^¹^- ^von anderen Corrinoiden aufgearbeitet werden.

Der Gegenstand der Erfindung ist also ein neues Verfahren zum Aufarbeiten von Vitamin B-^ und andere Corrinoide enthaltenden Fermentationsflüssigkeiten zur Herstellung von Vitamin B-,2~KoQze:atraten bzw. von kristallinem Vitamin B-, ₂, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die unaufgeschlossene Mikroorganismenzellen enthaltende Fermentationsflüssigkeit mit einem nicht-ionischen makroretikularen Adsorptionsharz von 10~" bis 10 m Porengrössen, mindestens 10 m Korndurchmesser und mindestens 200 m /g spezifischer Oberfläche behandelt, dann

a) nach dem auf an sich bekannte Weise durchgeführten Aufschliessen der Zellen die Flüssigkeit mit einem nicht-ionischen Adsorptionsharz von 10 bis 10 m Porengrösse, mindestens 10 m Korndurchmesser und mindes-

2
tens 200 m /g spezifischer.Oberfläche behandelt, das abgetrennte Harz mit Wasser durchspült und/oder mit einer wässrig-basischen Lösung von pH = 8 bis 12 behandelt und die auf dem Harz gebundenen Vitamin B₁₂ u&d andere Corrinoide in an sich bekannter Weise, zweckmässig mit einem mit Wasser mischbaren und gegebenenfalls wässrigen organischen Lösungsmittel vom Harz eluiert, und gegebenenfalls in an sich bekannter '»veise zu kristallinem Vitamin B₁₂ und/oder zu Vitamin B^₂ enthaltenden Futtermittelzusatz weiterverarbeitet, oder

b) die unaufgeschlossenen Zellen aus der Fermentationaflüssigkeit abtrennt und die erhaltene Biomasse, zweckmässig durch Sprühtrocknen in trockene, als Vitamin B₁₂ enthaltenden Futtermittelzusatz unmittelbar verwendbare Form bringt und/oder.in an sich bekannter 7/eise zu kristallinem Vitamin 3-,₂ weiterverarbeitet.

Als Adsorbentnarze können in beiden Ad3orptions-

schritten des erfindungsgemässen Verfahrens beliebige nicht-ionische makroretikulare Harze Cd.h. Adsorptionsharze mit 10 bis 10 m Porengrösse, mindestens 10 m

2 Komgrösse und mindestens 200 m /g spezifischer Oberfläche), z.B. Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7, XAD-8 oder XAD-9 (Produkte der amerikanischen Firma Eohm und Haas), DIAION HP-20, HP 21 oder HP-2 MG CProdukte der japanischen Firma Mitszbishi) mit gutem Erfolg verwendet werden. Man kann in den zwei Adsorptions schritten gleiche oder verschiedenen Harze als Adsorbenten einsetzen; werden in den zwei Adsorptionsschritten von einander verschiedene Harze verwendet, so können diese in ihrer Porengrösse oder ihrer Oberflächenpolarität von einander ab-" weichen. Der optimale Typ des zu verwendenden Harzes hängt von der Qualität der Fermentationsflüssigkeit und von dem Charakter der anwesenden Verunreinigungen ab und kann in den einzelnen Fällen durch einfache Versuche ermittelt werden. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein die noch nicht aufgeschlossene Fermentationsflüssigkeit im ersten Adsorptionsschritt nach-einander mit zwei verschiedenen Harzen zu behandeln, wobei man z.B. ein Harz mit grösseren und eines mit kleineren Poren, oder ein nicht-ionisches Harz mit apolarer Oberfläche und . nachher ein ebenfalls nicht-ionisches Harz, aber mit mehr oder minder polarer Oberfläche verwenden kann· Die beiden Adsorptionsschritte werden im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt} ihre übrigen Bedingungen, wie der optimale pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit und die optimale Zeitdauer der Behandlung mit dem Adsorptionsharz sind ebenfalls von der Qualität und der Zusammensetzung der Fermentationsflüssigkeit abhängig und können besonders bei kontinuierlich geführten Betrieb vorteilhaft durch Versuche bestimmt werden.

Bei der Behandlung der unaufgeschlossene Zellen enthaltenden Fermentationsflüssigkeit mit dem Adsorp-

. ₁₂ _ ^:.-^: ■ -■■::■ -^: "^ 34O4242

tionsharz dürfen keine für die Zellen schädliche Bedingungen, wie stark saure CpH ^ 5) oder stark basische CpH ^> 8) Medien oder höhere Temperaturen angewendet werden. Wird der erste Adsorptionsschritt in richtiger Weise, unter optimalen Bedingungen durchgeführt, so wird eine von farbigen und übel riechenden Verunreinigungen weitgehend befreite und Lipoide nur in minimaler Menge enthaltende gereinigte Fermentationsflüssigkeit erhalten. Bei den erwähnten ■Vorversuchen zur Bestimmung der optimalen Bedingungen der Absorptionsschritte kann die Anwesenheit von farbigen bzw. übel riechenden Verunreinigungen durch organoleptische Untersuchung kontrolliert werden, während der Lipoidgehalt der Fermentationsflüssigkeit durch Extraktion mit Fettlösemitteln und Bestimmung des Fettgehaltes des Extrakts ermittelt werden.

Die technische Durchführungsweise der Adsorption kann auch von den im gegebenen Fall zur Verfügung stehenden Betriebseinrichtungen abhängen. So kann man die Adsorption mit gutem Erfolg durch Einrühren des Harzes in die Fermentationsflüssigkeit und Abtrennen des die adsorbierten Stoffe enthaltenden Harzes durch übliche Methoden, wie durch Sedimentieren oder Filtrieren durchführen.. Man kann aber die Adsorption sehr vorteilhaft auch unter Anwendung der bekannten Fluidbett-Technologie durchführen.

Uach dem zweiten Adsorptions schritt, in welchem nunmehr die im ersten Adsorptionsschritt vorgereinigte und die Zellen schon in aufgeschlossenem Zustand enthaltende Fementationsflüssigkeit mit den Harz behandelt wird, kann bei der zum selektiven Entfernen der auf dem Harz neben

der Wirkstoffe ebenfalls anhaftenden Verunreinigungen dienenden wässrig-alkalischen Behandlung des Harzes zweckmässig eine verdünnte wässrige AnmoniumhydroscLc?.lösung, z.B. mit Ammoniumhydroxid auf pH = 8 bis 12, vorteilhaft auf pH = 9 bis 10 eingestelltes Wasser als Waschflüssigkeit

verwendet werden. Ea können aber zu diesem Zweck auch andere alkalische wässrige Lösungen, z.B. eine auf etwa pH β 10 eingestellte wässrige Kaliumhydroxidlösung verwendet werden.

ITach diesem wässrig-alkalischen bzw. gegebenenfalls Cs. oben) nur wässrigen Waschen des Harzes kann die Eluierung der Wirkstoffe auf bekannte Weise, z.B. mit Methanol oder mit wässrigem Methanol erfolgen.

Durch das Eindampfen des auf diese Weise erhalteten Sluats wird ein rohes Produkt erhalten, in welchem das Vitamin B-.« und andere Corrinoide in weitgehend gereinigtem Zustand, in der Form eines wasserlöslichen Konsentrats enthalten sind; der auf die Trockensubstanz' bezogene Wirkstoffgehalt Cd.h. der Gehalt an biologisch aktiven Corrinoiden) dieses Konzentrates beträgt 10 bis 25 %» Dieses rohe Produkt kann in trockenem Zustand unmittelbar als Vitamin Β-,ρ enthaltender Futterzusatz verwendet v/erden, es ist aber andererseits infolge seiner hohen Reinheit und hohen Wirkstoffkonzentration auch als ausgezeichneter Ausgangsstoff zur Gewinnung von kristallinem Vitamin B-^ ^vai^^{L von} sog. Faktor III (5-Hydrozy-benzimidazolyl-cobamid-cyanid) verwendbar.

. .Da. die als unmittelbares Fermentationsprodukt . · erhaltene, unaufgeschlossene Zellen enthaltende Fermentationsflüssigkeit schon bei dem ersten Adsorptionsschritt von "den, , die Verwendung dieses rohen Produktes als Futterzusatz hindernden nachteiligen Eigenschaften Cunangenehmer Geschmack und Geruch usw. ) weitgehend befreit wird, kann sie bereits zur Herstellung von Vitamin B₁₂ enthaltenden Futtermittelzusatz verwendet werden, indem man aus dieser, nur im erfindungsgemässen ersten Adsorptionsschritt gereinigten Fermentationsflüssigkeit · - die den Wirkstoff enthaltenden unaufgeschlossenen

COPY

-H-

Zellen auf an sich bekannte ','/eise, z.B. durch Zentrifugieren abtrennt und die auf diese Weise erhaltene, an Vitamin Β-,ρ und anderen Corrinoiden reiche, aber von den Lipoiden und übel riechenden Verunreinigungen schon befreite Biomasse z.B. durch Sprühtrocknung in trockenen Zustand bringt. Dabei ist au bemerken, dass durch die Reinigung nach der Methode des erfindungsgemässen ersten Adsorptionsschrittes_/ die■Fermentationsflüssigkeit nicht nur von den unerwünschten Verunreinigungen befreit, sondem auch ihr spezifisches Gewicht herabgesetzt und ihre Konsistenz vorteilhaft beeinflusst werden, so dass dadurch auch die Separierbarkeit der Mikroorganismenzellen wesentlich besser wird. Durch das auf obige Weise durchgeführte Abtrennen und Trocknen der Biomasse wird ein hellfarbiges, von unangenehmen Geruch freies, als Futtermittelzusatz unmittelbar verwendbares Produkt mit 2-3 mg/g Wirkstoffgehalt erhalten.

Auf Grund der obigen Erläuterungen können die Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens auf die nachstehende Weise zusammengefasst werden:

1) Die beiden Adsorptionsschritte des Verfahrens und das zwischen diesen Adsorptionsbehandlungen erfolgende Aufschliessen der Zellen kann durchwegs in der ursprünglichen Fermentationsflüssigkeit durchgeführt werden, woraus der aus technologischem Gesichtspunkt sehr wesentliche Vorteil folgt, dass die Biomasse zwischen den einzelnen Schritten des Verfahrens nicht isoliert werden muss.

2) Die Kauptmenge der extrazellularen Verunreinigungen, welche bei den bisherigen Verfahren nach der Auf-Schliessung der Zellen zusammen mit den Wirkstoffen an dem Adsorbenten gebunden wurden, werden in dem erfindungsgemässen Verfahren im ersten Adsorptionsschritt, also noch vor dem Aufschliessen der Zellen aus der Fermentationsflüssigkeit entfernt; daraus folgt, dass eine wesentlich kleinere LIenge des Adsorbenten zur vollständigen Bindung

der Wirkstoffe benötigt wird, wodurch auch die auf den Wirkstoff berechnete Kapazität des Adsorbenten erhöht wird.

3) Infolge der oben geschilderten Umstände ' werden auch zur Eluierung der Wirkstoffe wesentlich kleinere Mengen Lösungsmittel benötigt, so dass die Wirkstoffe im Eluat in wesentlich höherer Konzentration erhalten werden können.

4) Durch die im Laufe des Verfahrens durchgeführte zweifache Reinigung CVorreinigung der Fermentationsflüssigkeit im ersten Adsorptionsschritt und selektives Eluieren der mir den Wirkstoffen zusammen adsorbierten Verunreinigungen durch die basisch-wässrige Behandlung des Harzes nach dem zweiten Adsorptionsachritt) werden die von dem zweiten Adsorbenten eluierten Wirkstoffe in erheblich höherer Reinheit erhalten, als bei den bisherigen Verfahren. Dadurch konnte es erreicht werden, dass im Gegensatz zu den zur Zeit im Handelsverkehr erhältlichen, Vitamin B-^p enthaltenden Puttermittelzusatz-Präparat ionen,

welche im allgemeinen 0,1 bis 0,3 /&> ausnahmsweise höchstens 2 % Corrinoide enthalten, nach dem erfindungsgemässen Verfahren unmittelbar, also ohne weitere Anreicherungsoperationen 10 fo oder noch mehr Corrinoide enthaltende Produkte ■ hergestellt werden können.

53 Da3 erfindungsgemässe Verfahren kann auch in grossbetrieblichem Mass leicht ausgeführt werden und beansprucht keine kostspieligen speziellen Einrichtungen. Es ist ein weiterer Vorteil, dass das Verfahren sehr gut auch unter Anwendung der an sich bekannten, kontinuierliche Arbeit ermöglichenden J'luidbett-Technologie ausgeführt werden kann.

6) Dadurch, dass die extrazellulären Verunreinigungen schon in dem ersten Adsorptions schritt, also noch vor der Aufschliessung der Zellen aus der Permentationsflüssigkeit entfernt werden, sind die in den v/eiteren

" .-' - ^: 34042A2

Verfahrensschritten erhaltenen Produkte infolge ihrer höheren Reinheit für sämtliche Zwecke der weiteren Verarbeitung besser geeignet.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch die nachstehenden Beispiele.näher veranschaulicht.

Beispiel 1

2 nx einer aus mit einer von Abwasserschlamm stammenden gemischten Bakterienpopulation ausgeführter halbkontinuierlicher anaerober Fermentation entnommenen Fermentationsflüssigkeit /Trockensubstanzgehalt: 1,5 %, pH-Wert: 6,3, Wirkstoffgehalt: Vitamin B₁₂ 26 mg/1, Paktor III C5-Hydroxy-benzimidazol-cobalamin) 4,2 mg/17 wurden in einem aus zwei nacheinander geschalteten Fluidbett-Apparaten bestehenden zweigliedrigen Adsorptionssystem auf die folgende Weise gereinigt:

Die unfiltrierte Fermentationsflüssigkeit wurde in kontinuierlichem Strom mit 200 l/h Strömungsgeschwindigkeit durch zwei nach einander geschaltete und je 10 DIAIOU HP 20 rnakroretikulares Harz C Produkt der japanischen Firma LIitsubitshi) enthaltende Fluidbett-Adsorptionsapparate mit je 50 1 !Tutζvolumen geleitet. Dabei wurde die Hauptmenge der in der Fermentationsflüssigkeit anwesenden extrazellulären Verunreinigungen auf dem Harz adsorbiert, Nach dem Durchleiten der Fermentationsflüssigkeit wurden die Apparate mit 100 1 Wasser nachgewaschen.

Die auf obige Weise vorgereinigte Fermentationsflüssigkeit vrurde mit 250 ml 1 3-iger wässriger Kaliumcyanidlösung versetzt und dann durch die kontinuierliche Z'.igabe von 50 %-iger wässriger Schwefe!säure auf pH = 4 eingestellt. Die auf diese ',Teise behandelte Feraentationsflüssigkeit wurde in einen Durchströmungssystem mit 10 Minuten Aufenthaltszeit auf 110 G erwärmt, wobei die ZeI-

COpy

len augeschlossen und die aus den Zellen frei gewordenen Corrinoide in der Fennentationsflüssigkeit gelöst wurden.

Die auf die Weise aufgeschlossene Fermentationsflüssigkeit wurde in einem Wänneaustauschsystem bis unter 30 ⁰C abgekühlt und dann mit 200 l/h Strömungsgeschwindigkeit durch ein zweites zweigliedriges, aus zwei nach einander geschalteten,· je 20 1 DIAIOH HP 20 inakroretilculares Adsorptionsharz enthaltenden Fluidbett-Adsorptions-TO apparat en mit je 50 1 Nutzvolumen bestehenden Adsorptionssystem geleitet. In diesem zweiten Adsorptionsschritt wurden die Corrinoide auf dem Harz adsorbiert; die durch die Apparatur geflossene und keine Corrinoide mehr ent-" haltende Flüssigkeit wurde in den Abwasserkanal abgelas-

T5 sen. Anschliessend wurden zuerst 250 1 Wasser mit 1 m /h Strömungsgeschwindigkeit in entgegengesetzter Richtung geleitet um die im Apparat gebliebene Zellenrückstände zu entfernen und dann wurden die auf dem Adsorbentharz haftenden Lipoide und nicht identifizierte gelbe und braune Verunreinigungen durch Durchströmenlassen von 200 1 mit Ammoniumhydroxyd auf pH 9 bis 10 eingestelltem Wasser von dem die Corrinoide gebunden haltenden Harz abgewaschen. Das mit dem basischen Wasser behandelteHarz wurde mit Wasser neutral gewaschen und anschliessend wurden die Corrinoide mit 200 1 Methanol mit 100 l/h Durchströmungsgeschwindigkeit vom Adsorbentharz eluiert.

. Aus dem Eluat wurde das LIethanol im Vakuum bei 50 C nicht überschreitender Temperatur verdampft, wobei 10 1 wässrige Lösung zurückblieb. Dieser wässrige Rückstand enthielt 45,2 g Vitamin B₁₂ und 7,3 g Faktor III; ihr gesamter Trockensubstanzgehalt war 331 g, der auf die Trockensubstanz berechnete Wirkstoffgehalt des ,Produktes war also 15,9 %. Der Anzeicherungsgrad der Wirkstoffe in diesem als unmittelbares Produkt erhaltenen Konzentrat war also Cauf die als Ausgangsprodukt eingesetzte Fermentationsflüssigkeit berechnet) 200-fach,

COPY

340A2A2

der auf die Trockensubstanz berechnete Grad der Reinigung 92-fach; die auf den V/irkstoffgehalt der ursprünglichen Penaentationsflüssiükeit berechnete Wirkstoffausbeute betrug 87 % ·

Das aus dem auf obige Weise erhaltenen wässrigen Konzentrat durch Sprühtrocknung herstellbare trockene Produkt kann unmittelbar, ohne jede weitere Behandlung als Futterzusatzmittel mit hohem Vitamin-B-jp-Gehalt verwendet werden; andererseits kann man aus diesem wässrigen Konzentrat in an sich bekannter Weise, z.B. durch Extraktion und Reinigung durch Ionenaustausch kristallines Vitamin B-, 2 herstellen.
Beispiel 2
100 1 einer aus mit Propionibacterium shermannii durchgeführten aseptischen Fermentation stammenden, 45 mg/1 Vitamin B, ρ ^im^· 1>35 % Trockensubstanz enthaltenden Fermentationsflüssigkeit CpH = 5,9) wurden mit 2 1 Axaberlite XAO 2 makroretikularem Harz versetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde langsam gerührt, dann wurde das Harz durch Filtrieren über einen die in der Fermentationsflüssigkeit anwesenden unaufgeschlossenen Mikroorganismen durchlassenden Filter abgetrennt. Die als Filtrat erhaltene' gereinigte Fermentationsflüssigkeit wurde auf pH = 5 eingestellt und dann auf bekannte Weise, in Gegenwart von Cyanidionen aufgeschlossen.

Der pH-Wert der aufgeschlossenen und auf 30 ⁰C abgekühlten Fermentationsflüssigkeit wurde auf 5 bis 5»5 eingestellt und dann wurden 5 1 Aiaberlite XAD 2 makroretikulares Harz zugesetzt.-las Gemisch wurde 3 Stunden gerührt; während dieser Zei~ wurde die gesamte Menge des in der Lösung befindlichen Wirkstoffes auf dem Harz adsorbiert. Das Harz wurde durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser durchgewaschen und darm wurden die Wirkstoffe durch Vermischen des Karze3 mit 10 1 60 ^-igeni wässrigem Aceton eluiert. Das Sluieren wurde mit weiteren 5 1 60 70-igem

wässrigen Aceton wiederholt, die beiden Eluate wurden vereinigt und das Aceton wurde im Vakuum abdestilliert. Die als Rückstand erhaltene wässrige Lösung C3 1) enthielt 3i 96 g Vitamin B-, ρ; ^^er Trockensubstanzgehalt der Lösung war 27»O g, der auf die Trockensubstanz bezogene spezifische Wirkstoffgehalt war somit 14»66 %. Im erhaltenen Konzentrat war die auf die als Ausgangsprodukt eingesetzte Fennentationsflüssigkeit berechnete Wirkstoffausbeute also 88 %.

Das auf die obige Weise erhaltene wässrige Konzentrat kann auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise weiter verarbeitet werden.
Beispiel 3

10 1 der im Beispiel 1 erwähnten Fermentationsflüssigkeit wurden durch eine 200 ml Amberlite XAD 7 Harz enthaltende Säule geleitet. Der pH-Wert der durchgeflossenen Flüssigkeit wurde auf 3 bis 3,5 eingestellt, es wurden 2 ml 1 %-ige Kaliuncyanidlösung zugesetzt und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 80 C gehalten. Die auf diese Weise aufgeschlossene Fermentationsflüssigkeit wurde auf 20-30 ⁰C abgekühlt und durch eine 200 ml Amberlite ER 180 Adsorptionsharz enthaltende Säule geleitet. Die durchgeflossene Flüssigkeit wurde weggegossen, das Harz wurde zuerst mit Wasser, dann mit verdünnter Kaliumhydrox dlösung CpH =10) und zuletzt bis neutraler Reaktion wieder mit Wasser gewaschen. Der Wirkstoff wurde dann mit 2 1 70 %-igem wässrigem Methanol eluiert; das Methanol wurde aus dem Eluat im Vakuum verdampft. Die als Rückstand erhaltene wässrige Lösung C 500 ml) enthielt 216 mg Vitamin 3-,ρ» ¹^^r Trockensubstanzgehalt war 1,2 g. Der auf die Trockensubstanz berechnete spezifische Wirkstoffgehalt war 18 %, die auf die als Ausgangsprodukt eingesetzte Fermentationsflüsaigkeit berechnete Ausbeute 83 %. Das erhaltene Konzentrat kann auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise zur Herstellung von trockenen Futterzusatzmittel oder von kristallinem

Vitamin B-, ₂ weiter verarbeitet werden. Beispiel 4

10 1 einer von einer mit Abwasserschlamm-Inokulation durchgeführten septischen aeroben Fermentation entnommenen, 26 mg/1 Vitamin B-^₂ enthaltenden Fermentationsflüssigkeit Y/urden durch eine 100 ml Amberlite ]LAD 7 Harz enthaltende Säule, und anschliessend durch eine zweite, 100 ml Amberlite ER I6o Harz enthaltende Säule geleitet. Die auf diese Weise vorgereinigte Fermentationsflüssigkeit wurde dann auf die im Beispiel 3 beschriebene 7/eise aufgeschlossen und weiter verarbeitet. Die durch Eindampfen des nach dem zweiten Adsorptionsschritt erhaltenen Eluats erhaltene wässrige Lösung enthielt 202 mg Vitamin B-, ο 5 der gesamte Trockensubstanzgehalt dieses wässrigen Konzentrats war 900 mg. Der spezifische Wirkstoffgehalt war somit 22,4 ^c/°; die auf den Vfirkstoffgehalt der ursprünglichen Fermentationsflüssigkeit berechnete Ausbeute war 77,7 %.

Beispiel 5

Im einer aus einer mit Abwasserschlamm inokulierten anaeroben Fermentation entnommenen, 25 mg/1 Vitamin B-, 2 enthaltenden Fermentationsflüssigkeit, deren auf Wasser bezogene r-elative Viskosität 1,5 war, wurde mit 200 l/h Strömungsgeschwindigkeit durch drei nach einander geschaltete Fluidbett-Adsorptionsaäulen mit je 10 1 DIAIOH HP 21 Adsorbentharz geleitet. Die austretende Flüssigkeit war hellfarbig, hatte keinen unangenehmen Geruch; ihre auf Vi'asser bezogene relative Viskosität war 1:1. Aus der auf obige ',Veise vorgereini~ten Fermentationsflüssigkeit wurde die Biomasse durch Separieren abgetrennt und durch Sprühtrocknen getrocknet. Zs wurden 9,5 kg trockenes, unmittelbar als Futterzusats verwendbares Produkt erhalten, dessen Vitamin B-^-Ge'¹¹⁵¹-^ 22,5 g, spezifische Aktivität 2370 mg/kg war.

Beispiel 6

Das nach. Beispiel 1 erhaltene wässrige Konzentrat wurde auf die folgende Weise zur Herstellung von in der Humantherapie verwendbarem kristallinem Vitamin B-,₂ weiter verarbeitet:

10 1 eines wässrigen Konzentrats, welches insgesamt 45,2 g Vitamin B₁₂ ¹¹¹¹Cl T,3 g Paktor II enthielt Cgesamter Trockensubstanzgehalt 331 g), wurden mit 200 ml verflüssigtem Phenol versetzt und dann mit 2 1 1:6 Gemisch von Phenol und Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit 1 1 1:6 Gemisch von Phenol und Chloroform noch einmal extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt' und mit 1,5 1 2 % Phenol enthaltendem Wasser gewaschen. Diese wässrige Waschflüssigkeit wurde mit der bei der obigen Extraktion zurückgebliebenen wässrigen Phase vereinigt.

Die auf obige Weise erhaltene,. Vitamin Β·, ρ enthaltende Phenol-Chloroformlösung C 3 ID wurde mit dem gleichen Volumen C3 1) Aceton und mit 1500 ml Wasser vermischt. Dabei ging das Vitamin B-, ο ^- &i-^e wässrige Phase über;^vdie wässrige Phase wurde abgetrennt und die organische Phase mit je 200 ml Wasser zweimal extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden zum Entfernen der zurückge-· . · bliebenen Spuren von Phenol mit 1 1 Chloroform gewaschen. Es wurden auf diese Weise 2100 ml wässrige Lösung erhalten, deren Vitamin B-jp-Gehalt 21,7 g C 48 % d. ThO war; die papierchromatographisehe Untersuchung der Lösung zeigte, dass andere Cobalamin-?aktoren nur in Spuren Cweniger als 1 je) anwesend waren.

Diese wässrige Lösung wurde auf etwa 500 ml Volumen eingedampft und das Vitamin B-, ₂ wurde auf die übliche Weise, unter Zugabe von 3000 ml Aceton zum Kristallisieren gebracht. Es wurden 18,1 g kristallines Vitamin 3-,₂ ⁵^i* einem Cyanocobalamingehalt von 90,0 % erhalten. Aus der bei dem Kristallisieren erhaltenen Mutter-

COPY

lauge wurde das Aceton abdestilliert, der wässrige Rückstsnd wurde mit der wässrigen Phase der mit dem 1:6 Gemisch von Phenol und Chloroform durchgeführten Extraktion und mit der wässrigen Waschflüssigkeit des ·Phenol-Chloroformgemischea vereinigt. Diese wässrige Lösung C etwa 1.2 1) wurde durch Extraktion nur 20 VoI.% Chloroform von Phenolrückständen befreit, eingedampft und durch Sprühtrocknen in trockenen Zustand gebracht. Das auf diese V/eise erhaltene Zweitprodukt enthielt 24,4 g Vitamin B-, ₂ und 6,5 g Paktor III. Diese Produkt entspricht den Qualitätsvorschriften von "Vitamin Β,ρ feed grade".

Claims (5)

1. 39 772 m/fg

   Richter Gedeon Veg^eszeti Gyär R.T., Budapest / Ungarn

   VERPAHREN ZUM AUPARBEITEH VON VITAMIN B₁₂ UND ANDERE CORRINOIDE ENTHALTENDE FERMENTATIONS-FLÜSSIGKEITEN

   Pat entansprüche

   (l .J Verfahren zum Aufarbeiten von Vitamin ₁₂ andere Corrinoide enthaltenden Fermentationsflüssigkeiten zur Herstellung von Vitamin B-, p~Konzentraten bzw. von kristallinem Vitamin B-,₂> · dadurch gekennzeichnet , dass man die unaufgeschloasene Mikroorganiamenzeilen ent-- . . haltende Penaentationsflüsaigkeit mit einem nicht-io-

   il —8

   niachen makroretikularen Adsorptionsharz von 10 bis IQ m Porengrösa«, mindestens 10 m Korndurchmesser und mindestens 200 m /g spezifischen Oberfläche behandelt, dann

   a) nach dem auf an sich bekannte Weise durchgeführten Aufschliessen der Zellen die Flüssigkeit mit einem nicht-ionischen Adsorptionsharz von 10

   Ί5 bis 10 m Porengrösse, mindestens 10 m Korndurch-

   2
   messer und mindestens 200 m /g spezifischer Oberfläche behandelt, das abgetrennte Harz mit Wasser durchspült,

   und/oder mit einer wässrig-basischen Lösung von pH .= 8 bis 12 behandelt und das auf dem Harz gebundene Vitamin B₁₂ und andere Corrinoide in an sich bekannter Weise, zweckmässig mit einem mit Wasser mischbaren und gegebenenfalls wässrigen organischen Lösungsmittel vom Harz eluiert, und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise zu kristallinem Vitamin B₁₂ und/oder zu Vitamin B₁₂ enthaltendem Futtermittelzusatz weiterverarbeitet, oder

   b) die unaufgeschlossenen Zellen aus der Fermentationsflüssigkeit abtrennt und die erhaltene Biomasse, zweckmässig durch Sprühtrocknen in trockene, in einer als Vitamin Β-,ρ enthaltenden Futtermittelzusatz unmittelbar verwendbare Form bringt und/oder in an sich bekannter Weise zu kristallinem Vitamin B₁₂ weiterverarbeitet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, Absatz a), dadurch gekennzeichnet , dass man zur adsorptiven Reinigung der unaufgeschlossene Zellen enthaltenden Fermentationsflüssigkeit und zum adsorptiven Binden des Wirkstoffgehalt es der aufgeschlossenen Fermentationsflüssigkeit Adsorptionsharze von dem selben Typ verwendet.

   .
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, Absatz a), • dadurch gekennzeichnet , dass man zur adsorptiven Reinigung der unaufgeschlossene Zellen enthaltenden Fermentationsflüssigkeit bzw. zum adsorptiven Binden des Wirkstoffgehalt es der aufgeschlossenen Fermentationsflüssigkeit von einander verschiedene Harze verwendet.

   .
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, Absatz a),

   dadurch gekennzeichnet , dass man zur wässrig-b.asischen Behandlung des das Vitamin B₁₂ gebunden enthaltenden Harzes eine wässrige Ammoniumhydroxidoder Alkalimetallhydroxidlösung von pH 8 bis 12

   COPY

   verwendet.
5. 5. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet , dass man die adsorptive Reinigung der unaufgeschlossene Zellen enthaltenden Fermentationsflüssigkeit in zwei Stufen, mit gleichen oder von einander verschiedenen Adsoprtionsharzen durchführt.

   COPV