JPS59220198A - 発酵液の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明はビタミンＢ１２及び他のコリノイド（ｃｏｒ
ｒｉｎｏｉｄ　）を含有する発酵液の処理方法、並びに
ビタミンＢ１□濃縮物の製造方法に関する。

さらに詳しくは、この発明はビタミンＢ、２及び他の生
物学的に活性なコリノイド、又はそのｉ稲物を発酵液か
ら高収率で分離する方法に関する。

（発明の背景） ビタミンＢ、２及び他のコリノイドの生物学的製造にお
いて、微生物によシ生産されるビタミンＢｊ２は実質上
細胞内に蓄積され、従って一般に、細胞を分離しく例え
は、濾過、沈降及び／又は遠心分離による）、そして得
られたいわゆる４ｆｆｌ　ｌ１ｆｉクリーム（バイオ　
マス）（このものは乾燥した後又は直接にビタミンＢ、
２含有調料添加物として使用することができる）中の細
胞を破砕することによって発酵液からビタミンＢ、２を
分離する。ビタミンＢ、２及び随伴するコリノイドは液
相に移行し、細胞片及び曲の固形不純物を濾過及び／又
は遠心分離により除去した後、ビタミンＢ、２及びコリ
ノイドを液相から分離し、そしてさらに１１６し又は濃
縮する。

（従来技術） ビタミンＢ、２の微生物的製造、及びう６酵液からのそ
の分離のだめの公知方法は、例えは「Ｖｊｔａｍｌｎ　
　Ｂ　　　　　ｕｎｄ　　ｖｅｒｖｒａｎｄｔｅ　　Ｃ
ｏｒｒｉｎｏｉｄａＪ２ （Ｒ，Ａｍｍｏｎ　：　Ｆｅｒｍｅｎｔｓ　−Ｈｏｒｍ
ｏｎｅ　−Ｖｉ　ｔａｍｌｎｅ　。

ＩＩＩ／　２　＋　Ｇ　Ｔｈｌｓｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　
、スタットガルト。

１９７５．１０〜１３に記載されている。

この公知方法に従えば、コリノイドを含冶する彼生物の
発＃液からの分離は技術的内温を有し、そしてしはしば
満足すべき収率をもって実施することができない。これ
以外の問題点は、発酵液は半懸濁半溶解状の多量の不純
物を伴って比較的低績度でビタミンＢ１２を含有してお
シ、そのために細胞の破砕の後に得られた低レベルの溶
液から活性成分を分離するための技術的に合理的で経済
的な方法を見出すことが非常に困難なことである。

この困褪性は、発酵培地にスラッジを接種する場合（例
えばメタン発生腐敗発酵の場合）特に深刻である。なぜ
なら、この場合、生産されたコリノイドを相当多量の随
伴不純物から分離しなければならず、これはｌ＋ｔｌえ
ばグロピオニパクテリウムを用いる純粋培養の場合よシ
さらに困難であるからである。

高純度のビタミンＢ１２の分離を促進するために種々の
追加の精製段階及び濃縮段階を用いて前記の困難を除去
するための多くの試みが存在する。

ハンガリー特許明細書第１５８，８０９号によれ（Ｐｒ
ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉ　
）の発酵液から細胞が分離され、この細胞が破砕され、
媒体のＰＩ３が徐々に５．５〜６．５に調整される。こ
のような条件下で、不純物の一部、特に蛋白質がバイオ
マスに結合し、他方ビタミンＢ１２は溶液中に残る。

次にバイオマス及び詭洋不純勤を雇心分−又は沈降によ
って除去し、そしてビタミンＢ、２及び他のコリノイド
を精製された溶液からイオン交換によシ分離する。この
方法は工業的に実施するのが困難でおる。なぜなら、細
胞片及び沈澱した不純物の分離が煩わしく、そして濾過
−沈降助剤の使用によシ活性成分の実質的な損失が生ず
るからである。

ソ連特許出願第１６１，７０９号に従えば、完全発酵液
又は分離されたバイオマスが酸性媒体中で熱処理され、
固形粒子が遠心分離によシ分離され、そして活性成分が
アルミナ又は陰イオン交換樹脂によシ上清液から吸着さ
れる。しかしながら、ミクロンサイズの細胞及び他の徽
細な懸濁不純物は遠心分離によって完全に分離され得す
、そして残留不純物の存在下では活性成分の吸着分離の
効率が不十分であシ、そしてこの方法の実際的な実施が
しばしば深刻な技術饅函難により障害される。

細胞又は細胞片及び他の固形不純物を含有する発酵液か
らのある種の活性成分の分離は、いわゆる巨大網状（ｍ
ａａｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ　）吸着樹脂の適用によっ
て相当に促進される。好都合なポアーサイズ、粒子大及
び機械的安定性に基く大きな非表面積を有する硬質で、
不溶性で、多孔性で、非極性又はある程度極性を有する
ビーズ状重合体は、レリえば流動床又は回分操作によシ
、固形粒子を含有する混合物中に溶解している物質を吸
着することが可能である。従って、発酵液の煩わしい濾
過又は遠心分離を回避することができ、発酵液の全体を
吸着系に導入することができる。この方法の欠点は、活
性成分のほかに相当量の不純物が４１１ｉ脂に吸着され
ることである。上記の原理に基く方法は、コリノイドが
発酵液中の活性成分である場合にも使用することができ
る。なぜなら、幾つかの巨大網状吸着樹脂は水溶液から
コリノイドを吸着し、そしてこのコリノイドは適当な溶
剤によシこの栂脂から溶出されえる（米国特許明細書第
３，５３１，４６３号）ことが知られているからである
。しかしながら今まで、発酵液からコリノイドを１ｌＪ
１．着するための方法であって、他の公知方法の欠点を
南さず、容易に実施することができ、そして満足すべき
純度と良好な収率で活性成分を供する方法は知られてい
ない。

（発明の構成） 発明者等は、微生物によシ生産され発酵液中の細胞内に
存在するコリノイドを、吸着剤がなんら損傷を受けない
２段階法によシ、良好な収率と篩い収率を伴って回収す
ることがでることを見出したＯ この方法の第１段階においては、発酵の終シに得られた
そのままの（ｎａｔｉｖｅ　）発酵液を、巨大ポーラス
状の、大きな比表面積を有する巨大網状吸着樹脂によシ
、室温において、その前になんら前処理することなく処
理する。このような条件下で、巨大網状樹脂は発酵液の
若干の添加物及び発酵の若干の不特定の代謝産物を吸着
し、他方コリノイドを内に含有するｊ１１？　傷の１ｉ
’ｌ［ｌｌ　（１ｎｔａｃｔ　ｃｅｌｌ）はう６酵液中
に残留する。

次に、精製された発酵液中の細胞を公知の方法によシ、
例えば、シアニドイオンの存在下で熱処理することによ
シ破砕する。この結果、コリノイドが溶液に移行し、他
方、破砕された細胞片は液中Ｋ　ｉｌＷ　１ｒ４したま
まで残る。これを、細胞片及び他の固形不純物を除去す
ることなく直接、第２吸着段階において巨大網状吸着４
Ｍ脂によシ処理する。

この段階において、活性成分は１信脂に吸着される。

細胞を破砕する間に可溶性不純物が発酵液に溶解するの
が避けられないから、これらもある程度は亀２吸着段階
において樹脂に吸着される。しかしながら、これらの不
純物の大部分は、樹脂のアルカリ水溶液処理によりＷＪ
Ｌ着されたコリノイドから選択的に分離される。従って
、これらの不純物は目的の最終生成物を汚染しない。こ
の操作中、コリノイドは樹脂の表面に残留する。発酵培
地が汚染されていない場合、向えば雑菌を伴わない発酵
から得られる場合、アルカリ水性媒体に可溶性の不純物
は第２の吸着段階において必然的に樹脂に吸着されない
。この場合には、吸着されたコリノイドを担持する樹脂
の水性アルカリ処理を省略することができる。固形不純
物は純粋な水で洗浄除去することができるからである。

この場合、良好な収率でコリノイドを樹脂から溶出する
ことができる。

次に、目的のコリノイドを、上記のようにして処理され
た吸着剤から、公用の方法によって、例えば場合によっ
ては水を含有している低級アルコール又はケトンを用い
て溶出する。この溶出液は、公知の方法によシビタミン
Ｂ、２＠料添加物として使用することができ、あるいは
結晶ビタミンＢ１２又は他のコリノイドの分離のために
使用することができる。

この発明の方法の２つの吸着段階において、任意の巨大
網状（ポアーサイズ：　１０−８〜１０−’ｍ　；粒子
サイズ：少なくとも１０”　ｍ　；比表面積：少なくと
も２００ｍ２／Ｉ　）非イオン性吸着樹脂、列えばアン
バーライト　ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ　−７、
ＸＡＤ−８又はＸＡＤ−９（米国、Ｒｏｈｍ　ａｎｄｌ
（ａａａの製品）を用いて良好な結果を得ることができ
る。２つの逐次吸着段階において使用されるｅ、着樹脂
は同一でも異なっていてもよく、異る樹脂を使用する場
合、この相違は、例えばＩアーサイズ、又は表面の多孔
性に存在する。最適の樹脂は、発酵培地のタイプ及び存
在する不純物の性質に依存して実験的に選択すべきであ
る。もとの発酵液は第１の吸着段階において２種類の異
る樹脂、列えば小ポアーサイズの樹脂と大ポアーサイズ
の樹脂、又は非イオン性非極性樹脂と非イオン性でいく
分極性を有する樹脂によ逆処理するのが好ましい。一般
に室温において行われる吸着段階の前記以外の条件も又
、発酵培地及びその実際の組成に依存して変化するから
、最も好ましい条件を実験的に決定すべきである。

無傷の細胞を含有する発＃散を吸着樹脂によ逆処理する
に当っては、操作条件は細胞に損傷を与えるようなもの
であってはならず、例えば強すぎる酸性（ＰＨ＜５）条
件又はアルカリ性（ｐＨ＞８）条件、及び高温は回避す
べきである０最適に選択された条件下で第１の吸着段階
が行われれば、精製された発酵液が得られ、このものは
着色不純物又は不快臭を有する不純物をなんら含有せず
、最少量の脂質のみを含有する。実験において、着色不
純物又は不快臭を有する成分は官能試験によって制御す
ることができ、一方脂質含射は脂−溶剤による抽出及び
抽出液中の脂肪の測定によシ決定することができる。

吸着の技術的な実施方法は選択された装置に依任して異
なる。すなわち、回分式操作においては樹脂を発酵液と
混合し、そして常用技法、例えば沈降、又はＥ過によシ
吸着された物質を担持せしめながら分離する。他の好ま
しい態様に従えば、吸着を流動床（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ
　ｂｅｄ　）技法を用いて行うことができる。

細胞を破砕した後に行われる第２の吸着段階においては
、活性成分と共に樹脂に吸着された不純物を、アルカリ
洗浄液、例えばｐＪ（８〜１２、好ましくは９〜１０の
水ば化アンモニウムの冷水溶液も用いて選択的に除去す
ることができる。他のアルカリ性水溶液、例えば水酸化
カリウム又は水酸化ナトリウムの水溶液も同様に適当で
ある〇活性成分は、公知の方法によシ、例えばメタノー
ル又は水性メタノールを用いて樹脂から溶出することが
できる。

この発明の方法に従って、吸着樹脂（あらかじめアルカ
リ性水溶液で洗浄されている）からの活性物質の溶出、
及びこれに続く溶出液の蒸発乾燥によシ得られた粗生成
物は、水溶性濃縮物であって、このものはビタミンＢ、
２及び他のコリノイド１０〜２５饅でおる。この乾燥状
態の粗生成物はビタミンＢ、２ｍ科添加物として直接１
史用することができ、他方、純匿が高く、そしてコリノ
イド濃度が高いために、結晶ビタミンＢ１２及びいわゆ
るファクター■（５−ヒドロキシベンズイミダゾールコ
バラミン）を分離するための卓越した出発材料である。

動物を飼育するた・めに直接使用する場合に不利なもと
の発酵液の性質、列えば不快臭、不快味が、もとの発酵
液の最初の吸着処理中に除去されるため、最初の吸着段
階の後に得られた精製された発酵液は、これを？１１ｍ
し、又は蒸発乾燥してビタミンＢ、２飼料添加物を得る
ことができる。前処理の結果として発酵液の比重が低下
し、従って微生物の分離がさらに容易になる。この方法
によって色の薄い生成物が得られ、このものは不快臭を
有しない。

この発明の方法の利点を次のように要約することができ
る。

（１）　　この方法の過程で固形部分の分離が必要でな
いから、もとの発酵液における２回の吸着段階及び細胞
の破砕の実施は非常に有利である。

（２）無傷の細胞を伴うもとの発酵液について行われる
第１の吸着段階において、細胞外不純物の大部分が活性
成分と分離されて第１の吸着剤に吸着されるため、第２
の段階において活性成分が実買上少ない証の吸層剤に吸
着され摺る。

（３）上記の技術的変化の結果として、活性成分の溶出
を有意に少い量の溶離剤を用いて行うことができ、従っ
て得られた溶液中の活性成分の濃度がさらに高くなる。

（４）第１吸着段階における前処理、及び第２吸着段階
におけるアルカリ水溶ｃ夜処理による不純物の選択的溶
出によシ、溶出された活性成分の純度が実質上改良され
る。従って、この発明の方法によシ、追加の精製又は濃
縮をなんら必要としないで１０チ又はこれよシ多くの活
性成分を含有する生成物が得られる。

（５）この発明は工業的規模で実施するのも容易である
。′Ｒｋも有利には、この方法はいわゆる流動床技法に
よって行うことができ、この方法によシ連続操作が可能
になる。

（６）第１の吸着段階はｎ′州胞外不純物のみを減少せ
しめるので、次の操作、列えば飼料添加物への直接乾祿
又は結晶ビタミンＢ１２の常用の抽出のためによシ良好
な精製された液が得られる。

次に、しＵによシこの孔明をさらに詳、削に説明する。

但しこれによシこの発明の純囲を限定するものではない
。

Ｎ１゜ １ノ尚ｊ９２６＃ｌ１ｉｉ’のビタミンＢ１２及び４．
２りのファクター■（５−ヒドロキシ−ぺ／ズイミダゾ
ールーコパラミン）を含有し、１．５％の乾物及び６．
３の−を有する、スラッジに由来する混合細菌群を用い
る嫌気性発酵によシ得られた発酵液２ｍ３を、直列に連
結された２個の流動床成層系中で精製する。濾過されて
いない発酵液を、１０ノのＩＭＡＩ　ＯＮ　−ＨＰ　２
０巨大網状吸着樹脂（日本、三菱製）を充填した５０１
の装置２晶を逆流（ｕｐｆｌｏｗ）によシ２００Ｊ／時
の速要で浬ｈＣ的に通過せしめる。この段階を通じて発
酵液中に存在する実質的な量の不純物が樹脂に吸着され
る。発酵液を通した後装置を１００１の水で洗浄する。

部分的に精製された発酵液に２５０ｒｎｌの１チＫＣＮ
水湿液を加え、そして次に５０％硫敵水溶液の連続的添
加によル…を４に調整する。この後、発酵液を連続系に
おいて１１０℃に加熱し、１０分間接触せしめる。この
段階において、細胞が破砕され、細胞から遊離したコリ
ノイドが発酵液に溶解する。

発酵液を熱交換系において３０℃よシ低温に冷却し、そ
して第２の２基の吸着系に導入する。各吸着系は５０１
の有効容積を有し、そしてＤＩＡＩＯＮ−ＨＰ　２０巨
大網状吸着樹脂２０ＩＩが充填されている。流動床吸着
系が直列に連結されてお９、発酵液の流速は２００１７
時である。この段階においてコリノイドが樹脂に吸着さ
れ、装置を通過した、＃ミとんどコリノイドを含有しな
い液が排出される。この後、２５０１の水を装置を通し
て１ｍ５／時の速度で逆流せしめることによシ、装置中
に残留している消化された細胞残渣を除去する。水［化
アンモニウムによυ−を９〜１０ＫＩ＆１整した２００
１の水を装置に通す。このアルカリ性水溶液によシ、コ
リノイドが吸着されている執着剤から、脂質並びに未同
定の黄色及び褐色不純物が除去される。アルカリ溶液で
処理された樹脂を中性に洗浄し、そして次に２００１１
のメタノールを１ｏ０１／時の速度で導入することによ
シコリノイドを溶出する。メタノールを、５０℃を超え
ない温度によシ真空蒸発せしめることによシ除去して１
０）の水溶液を得る。この水溶液は４５．２Ｉのビタミ
ンＢ１２及び７．３ｇのファクター１■を含有し、そし
て３３１ｇの全乾物世を有する。従って乾物に対する活
性成分濃度は１５．９％である。

得られた濃縮物は出発発酵液に比べて２００倍高い濃度
で活性成分を含有し、乾物に対する精製度は９２倍であ
シ、出発発酵液の活性成分含有に対する活性成分収率は
８７チであることがわかる。

上記のようにして得られた水性濃縮物を噴霧乾燥（５ｐ
ｒａｙ−ｄｒＦ　）することによシ得られた乾燥生成物
は、高濃度のビタミンＢＴ２を有する飼料添加物として
直接使用することができ、そして抽出し、イオン交換に
よってさらに精製することによシ、公知の方法で結晶ビ
タミンＢ１２に転換することができる。

以下余白 し１ｊ　　　２゜ ４５ｍ９／ｌのビタミンＢ１２及び１．３５％の乾物を
含有し、そして５．９の−を有する１００１の発６％ｒ
ｆｆｌ（プロピオニバクテリウム・シェルマニーを用い
る無雑菌発酵によシ得られたもの）Ｋ、、　２１のアン
バーライトＸＡＤ２巨大網状１ｊ脂を混合する。１時間
にわたってゆっくシとＪＲ拌した後、発酵液中に存在す
る微生物が通過することができるフィルターを進して濾
過することによシ樹脂を除去する。Ｐ液として得られた
４’／ｌ　’Ｊされた発ｗ液を、−１５に調！した後、
シアニドイオンの存在下で公知の方法によシ消化する。

３０℃に冷去した後、発酵液のＰＨを５〜５．５に調整
し、そして５１のアンバーライトＸＡＤ　２を加える。

３時間攪拌する間に溶液中に存在するビタミンＢ１２の
全量が樹脂に吸着される。濾過によって樹脂を除去し、
水で洗浄し、そして６０チアセトン水溶液１０１を混合
することによシビタミンＢ、２を樹脂から浴出する。さ
らに５１の６０％アセトン水溶液を用いて溶出を繰シ返
し、そして−緒にした溶出液からアセトンを真空蒸留除
去し、３．９６．９＋７）ビタミ／　Ｂ　１２及び２７
．０１９＋７）乾物を含有する３１の水溶液を得る。従
って、活性成分濃度は１４．６６％であシ、そして出発
発酵液の活性成分含量に対する活性成分収率は８８チで
ある。

この水性譲給湯を例１に記載した方法にょシさらに処理
する。

剃　３゜ 例１の発酵１１０Ａ’を、２００　ｍｌ　ノア　ンハ−
ライトＸＡＤ　７　＆脂を官有する浮動床（ｆｌｏａｔ
ｉｎｇｂｅｄ　）吸着カラムに通す。カラムを出る液の
−を塩酸によシ３〜３．５に調整し、２Ｉｎｌの１チＫ
ＣＮ溶ｉ＆を加え、そして温度を８０Ｃに１ｏ分間保持
する。次に発酵液を２０〜３０Ｃに冷却し、そして２０
０ｍ１のアンバーライトＫＲ１８０吸着樹脂を充填した
カラムに通す。舗脂を出る液を廃棄し、そして樹脂を水
で洗浄し、次に希水酸化カリウム水溶液（ｐＨ１０）に
ょシ洗浄し、そして最後に中性になるまで水で洗浄する
。２ノの７０％メタノール水溶液を用いて活性成分を樹
脂から溶出する。

メタールを真空蒸発によって溶出液から除去し、２１６
ダのビタミンＢ１２及び１．２１１の乾物を含有する水
溶液を残渣として得る。乾物に対する活性成分一度は１
８％であシ、そして出発発酵液の活性成分含量に対する
収率は８３チである。得られた濃縮物は飼料添加物とし
て使用することができ、又は例１に記載したように結晶
ビタミンＢ１２の製造のために使用することができる。

例４゜ スラッジを接種して行った非無菌的好気発酵によ＃）得
られた発酵液１０ノを、それぞれ１００ゴのアンバーラ
イトＸＡＤ７、及び１００Ｌｎｌのアンバーライ）　Ｅ
Ｒ１８０を充填した２つの連続する吸着カラムに通す。

細胞の破砕、及び前精製された発ｔ＃故のその後の処理
は、実質上列３に記載した方法に従って行う。溶出液の
蒸発にょシ得られた水溶液は２０２９のビタミンＢ、２
及び９００　ｍｌの乾物を含有する。活性成分一度は２
２．４−でらシ、そして出発発酵液のビタミンＢ１２含
量に対する収率は７７．７優である。

約　５゜ ２５ｍ９／ｌのビタミンＢ１２を含有し、そして水に対
して１．５の相対粘度を有する１ｍ３の発酵液（スラッ
ジ由来の混合微生物群による嫌気発酵によシ得られたも
の）を、それぞれが１０／のＤ■Ａｌ０Ｎ−ＨＰ　２１
吸着Ｗ　’Ａ’ｔｌを収容する３本の連続するカラムに
、２００７７時の速度で通す。第３カラムから排出され
る液は淡色でラシ、そして不快臭を有さす、その相対粘
度は１．１である。前精製し７た発酵液からバイオマス
を分離し、そして濃縮物を噴き乾燥する。２２．５．９
のビタミンＢ１２を含有し２３７０ｍ９／に＆の比活性
を有する乾燥生成物９．５ｋｇを得る。

例６゜ １＋ｌ１１で調製した水性Ｉｌｌｌｌ金物用して、次の
ようにして医薬として使用することができる結晶ビタミ
ンＢ、２を調製する。

４５．２１ｉのビタミンＢ、２及び７．３　Ｉ！の７ア
クタ−ｍを官有し、そして３３１ｇの乾物金蓋を有する
水性ａ給湯１０７に、２００１１！／の液体フェノール
を加え、そしてこの混合物をフェノール／クロロホルム
（１：６）混合物２１によυ抽出する。

有機相を分離し、そして水相をフェノール／クロロホル
ム（１：６）混合物１１によシ繰返し抽出する。分離さ
れた有機相を一緒にし、そして２チのフェノールを含有
する１、５ＩＩの水で洗浄する。

水性洗浄ｉを、フェノール／クロロホルム（１：６）混
合物で抽出した後に得られだ水相と一緒にする。

ビタミンＢ、２を含有するフェノール／クロロホルム溶
液に、同量すなわち３１のアセトン及び１５００／ｄの
水を加えてビタミンＢ１２を水相に移行せしめる。水相
を分離し、そして有機相を２００ｍ１ずつの水で抽出す
る。−緒にした水溶液から、１ノのクロロホルムによジ
フェノールの痕跡を抽出する。２１．７ｇ（理論量の４
８％）のビタミンＢ１２を含有する水溶液２１００１ｄ
を得る。ペーパークロマトグラフィーによれは、この生
成物は痕跡のみ（１％未満）の池のコバラミ／ファクタ
ーを含有する。この水溶液を約５００ｄに真空濃縮し、
そして公知の方法によって３０００ｒＩＬｌのアセンを
含有する１８．１．９の結晶ビタミンＢ１２を得る。

結晶液からアセトンを蒸発せしめ、この水性残渣を、フ
ェノール／クロロホルム（１：６）混合物で抽出した後
に得られる水相、及びフェノール／クロロホルム混合物
の水性洗浄液と混合する。

得られた１２１！の混合物を２０容ｆ、ｔｉ６ずつのク
ロロホルムで２回洗浄してフェノール　を完全に除去し
、次にこれを噴霧乾燥する。こうして得られた第２の生
成物は２４．４ｇのビタミンＢ１２及び６．５９のファ
クター■を含有する。この生成物は「飼料銘柄」のビタ
ミンＢ、２でおる。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビタミンＢ１２及び他のコリノイドを含有する発酵
   液を処理し、そしてビタミンＢ、２＃縮物、及び／又は
   結晶ビタ′ミンＢ１２を製造する方法において、無傷の
   微生物細胞を含有するそのままの発酵液を、１０−８〜
   １０””ｍのポアーサイズ、少なくとも１０　　ｍの粒
   子直径及び少なくとも２００ｔｎ２／ｇの比表面積を有
   する非イオン性巨大網状吸着樹脂を用いて前処理し；そ
   して、 （、）　　前処理された発酵液中の微生物細胞を破砕し
   た後、この発酵液を　１０−８〜１ｏ−’ｍのポアーサ
   イズ、少なくとも１０−’　ｍの粒子直径及び少なくと
   も２００　ｍ２／　、！ｉ’の比表面積を有する非イオ
   ン性吸Ｍ樹脂によシ処理し、処理４ｉｆＪ脂を分離し、
   場合によっては該樹脂をｐＨ８〜１２の水性塩基で洗浄
   し、そして次にこの樹脂からビタミンＢ、２及び匝のコ
   リノイドを浴出し；あるいは、（ｂ）　　前処理された
   発酵液から前処理吸着樹脂及び細胞クリームを分１４Ｉ
   Ｉｉシ、細胞クリームを乾燥して飼料添加物を得； そして所望によシ、上記の変法（、）又は変法（ｂ）に
   おいて得られた生成物を結晶ビタミンＢ１２、及び／又
   はビタミンＢ１２を含有する飼料添加物製剤に転換する
   ことを特徴とする方法。 ２、変法（ａ）において、ビタミンＢ、２及び他のコリ
   ノイドを前記吸着樹脂から、水を含有している場合があ
   る水混和性有ｖｔ浴剤によって溶出する騎許ｍｌ求の１
   出回第１項記載の方法。 ３、変法（、）において、無傷の細胞を含有する発酵液
   の前処理のため、並びにビタミンＢ、２及び他のコリノ
   イドの吸着のために同じタイプの吸着樹脂を使用する％
   許請求のＪ飽囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、変法（ａ）において、無傷の細胞を含有する発酵液
   の前処理のため、並びにビタミンＢ、２及び他のコリノ
   イドの吸着のために異るタイプの吸着樹脂を使用する特
   許請求の範囲第１項又は第２項記較／）方法。 ５．無禍の細胞を含有する発酵液の吸着による前処理を
   、同じタイプ又は異るタイプの吸着樹脂を用いて反後し
   て行う特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、変法（、）において、ビタミンＢ１２及び池のコリ
   ノイドを担持する吸着樹脂をＰＨ８〜１２の水酸化アン
   モニウム溶液又はアルカリ金属水酸化物溶液で洗浄する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。