JPS639838B2

JPS639838B2 -

Info

Publication number: JPS639838B2
Application number: JP13303185A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Komya
Original assignee: Sanko Seisakusho KK
Current assignee: Sanko Seisakusho KK
Priority date: 1985-06-20
Filing date: 1985-06-20
Publication date: 1988-03-02
Also published as: JPS61293391A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は補酵素Ｑの製造方法、特に微生物菌体
から高収率で補酵素Ｑを製造する方法に関するも
のである。補酵素Ｑは合成により、あるいはその存在して
いる動植物組織、微生物のミトコンドリア等から
抽出により得られる。補酵素Ｑは下記の一般式を
有するキノン誘導体である。（ただし、式中のｎは12以下の整数を示す）補酵素Ｑは生体内では、呼吸酵素系の末端電子
伝達系に関与し、心蔵病や高血圧、悪性腫瘍など
の各種疾病に対して優れた薬理効果を示す物質で
ある。本発明の補酵素Ｑとは特に補酵素Q₁₀を含有す
るものであり、具体的には醗酵法により生産され
た微生物菌体中に含有されるものである。（従来の技術）従来、天然物からの補酵素Ｑの抽出方法は、ピ
ロガロール等の抗酸化剤の存在下、アルコール性
水酸化アルカリ溶液により直接鹸化した後、ヘキ
サン等の疏水性溶媒に転溶し、濃縮乾固後カラム
クロマトグラフイー等を用いて精製する方法と、
炭化水素、アセトン、エチルアルコール／エーテ
ル（３：１）等で抽出する方法と、熱メチルアル
コール→熱エーテル→エーテル／メチルアルコー
ル（３：１）若しくは熱アセトン→エチルアルコ
ール→エーテル等で順次抽出を繰り返す方法とが
ある。（発明が解決しようとする問題点）従来、前述の諸方法は薬品が高価であるか、抽
出設備が大型化になる欠点がある上、複雑な工程
を必要とする欠点があり、この為これ等の欠点の
ない工業的抽出方法が要望されていた。（問題点を解決するための手段）本発明は前述の欠点のない工業的抽出方法を提
供する。本発明は補酵素Ｑを含有する微生物菌体から親
水性溶媒を用いて補酵素Ｑを抽出するにあたり、
予め補酵素Ｑの培養液より遠心分離した菌体を乾
燥し、その乾燥菌体より抽出溶媒としてジメチル
スルホキシドを単独で又は他の親水性溶媒と組合
せた混合溶媒を用いて補酵素Ｑを抽出することを
特徴とする補酵素Ｑの製造方法である。ジメチルスルホキシドと組合せる他の親水性溶
媒としては、メチルアルコール、エチルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアル
コール及びアセトンから成る群から選択した親水
性溶媒を用いる。特に、補酵素Ｑの溶解度が比較
的高いイソプロピルアルコールを混合した場合は
使用量が少なく、抽出率も優れている。ジメチル
スルホキシドは菌に対する滲透性が良く、このよ
うに混合溶媒として用いることにより優れた抽出
率を得ることができる。ジメチルスルホキシドと
他の溶媒との混合割合は、混合溶媒中に占めるジ
メチルスルホキシドの量が約10〜90容積％好まし
くは約40〜60容積％である。抽出温度は約20〜
100℃であり、好ましくは約50〜80℃である。抽
出は30分〜５時間、好ましくは約２〜３時間撹拌
抽出を行なう。本発明の好適な１実施例においては、混合溶剤
比１：１、温度70℃、２時間撹拌の条件下で抽出
を行なう。親水性溶媒中に補酵素Ｑを抽出後は、補酵素Ｑ
が易溶性であるｎ−ヘキサン等疏水性溶媒に撹拌
により転溶させ、二層分離を行ない、ｎ−ヘキサ
ン等の易溶性溶液層を回収し、水洗、無水硫酸ナ
トリウム等で脱水、濃縮乾固させる。得られた濃
縮残渣をアセトンに溶解し、冷却後、不溶物を濾
過により除去して、充填剤としてシリカゲル、展
開剤としてｎ−ヘキサンを用いたカラムクロマト
グラフイーで精製し、補酵素Ｑの分画を濃縮乾固
し、残渣をエチルアルコールに溶解し、冷却下で
結晶化させる。結晶化させた補酵素Ｑを濾別し、
減圧下で乾燥する。本発明の補酵素Ｑの抽出では、酸、アルカリ等
の薬品を使用しない為、装置の材質の選定が容易
であり、廃水処理の設備も不要である。二層分離で分離した親水性溶媒は、濾過、蒸留
等により分離精製して回収できる。従つてこれを
再使用できる。本発明において使用する乾燥菌体は、例えば次
のようにして調製することができる。小量の場合
は、培養した菌体を遠心分離した後、水洗し、水
洗した菌体を濾別し、低温（20〜40℃）で乾燥途
中のものを乳鉢で粉砕しつつ乾燥する。多量の乾
燥粉体を得るには、培養液菌体を遠心分離し、水
洗分離した後、85％程度の水分に調整したものを
スプレイドライヤーで、入口温度170〜200℃、出
口温度（サイクロン入口温度）70〜90℃で乾燥す
る。この条件下で操業しても補酵素Ｑの分解は起
こらない。また乾燥菌体中の水分は約３〜10重量
％、例えば５〜７重量％である。以、本発明を実施例につきさらに詳細に説明す
るが、本発明はこれにのみ限定されるものではな
い。実施例１補酵素Q₁₀を生産するオーレオバシデイウム
（Aureobasidium）sp.14（微生物寄託番号・微工
研菌寄第5912号）を、尿素16.9ｇ、KN₂PO₄60
ｇ、MgSO₄・7H₂O6ｇ、FeCl₃・6H₂O0.18ｇ、
ジベンゾイルチアミン塩酸塩12.4mg、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸2250ppm、微量無機塩及び水道水12
からなる培地に、エチルアルコール濃度が
5000ppmになるように、制御しつつ、通気撹拌型
30ジヤー−フアメンターで培養した。培養途中
でKH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、FeCl₃・6H₂O、ジ
ベンゾイルチアミン塩酸塩、微量無機塩類を適時
供給し、30℃、PH5.5で６日間（144時間）培養を
行ない、得たる培養液（菌体を乾燥量で3.42Kgを
含有）を遠心分離し、水洗分離した後、一部を85
％の水分に調整し、スプレイドライヤーで乾燥し
た。乾燥粉体43.6ｇ（絶乾量40ｇ、補酵素Q₁₀含
有量12.7mg）を分取し、ジメチルスルホキシド75
mlとイソプロピルアルコール75mlとの混合溶媒に
投入し、70〜75℃で２時間撹拌抽出を行なつた。
その後ｎ−ヘキサン300mlを入れ、15分間振とう
し、補酵素Q₁₀を転溶させた後静置し、２層分離
を行ない補酵素Q₁₀の存在により橙黄色に着色し
ているｎ−ヘキサン層を分離した。この操作を３
回行なつた後、全ｎ−ヘキサン抽出層を集め、等
量の水900mlで３回洗浄し、無水硫酸ナトリウム
で脱水した。この段階での抽出液には高速液体ク
ロマトグラフイーでの定量に妨害物質を含むの
で、抽出液の一部10％量を鹸化して抽出率を求め
たところ93、１％であつた。次に、減圧下で濃縮
乾固し、残渣を小量のアセトンに溶かした後、冷
却し、析出物を除去し、減圧下で濃縮乾固した。
その後シリカゲル25ｇを詰めたカラムクロマトグ
ラフイーにかけ、ｎ−ヘキサンで溶出した。補酵
素Q₁₀の溶出画分を減圧下で濃縮乾固し、小量の
エチルアルコールに溶かして冷却すると、橙黄色
の補酵素Q₁₀の結晶が析出した。エチルアルコー
ルによりさらに２回再晶出を繰り返し、エタノー
ル母液と分け、減圧下で乾燥し、補酵素Q₁₀の結
晶9.965mgを得た。（収率86.5％）。実施例２実施例１と同じ菌を同じ培養法で各々培養して
得た菌体を遠心分離し、水洗後、40℃で乾燥途中
のものを乳鉢で粉砕しながら乾燥させた。これ等
の乾燥菌体を用いて、抽出溶媒であるジメチルス
ルホキシドとイソプロピルアルコールとの混合比
率を変えて、次のように補酵素Q₁₀の抽出を行な
つた。ジメチルスルホキシドとイソプロピルアルコー
ルとの混合溶液に乾燥菌体を投入し、加熱下で２
時間撹拌した。冷却後ｎ−ヘキサンを300ml加え、
15分振とうし、静置してｎ−ヘキサン層を分離し
た。この操作を３回行なつた後、全ｎ−ヘキサン
抽出液を集めて等量の水で３回洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで脱水後、減圧下で濃縮乾固した。こ
の段階での抽出液は、高速液体クロマトグラフイ
ーでの定量で妨害物質を含むので、鹸化を行なつ
た後定量した。鹸化は濃縮物にピロガロール１
ｇ、水酸化ナトリウム４ｇ、メチルアルコール30
ml、水10mlを加え、90℃で１時間還流することに
より行なつた。急冷後ｎ−ヘキサン100mlを加え、
15分振とうし、静置してｎ−ヘキサン層を分離し
た。この操作を３回行なつた。全ｎ−ヘキサン層
を集め、300mlの水で３回洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで脱水後、減圧下で濃縮乾固した。濃縮物
を小量のアセトンに溶解して、高速液体のクロマ
トグラフイーで定量した。これ等の結果を第１表
に示す。実施例３実施例１と同じ菌を用いて同様にして各々培養
した。但し、補酵素Q₁₀の抽出をジメチルスルホ
キシドとエチルアルコールとの混合溶媒を使用
し、２時間撹拌抽出を行なつた。以下は実施例２
と同様の手順で行なつた。これ等の結果を第１表
に示す。実施例４実施例１と同じ菌を用いて同様にして各々培養
した。但し、補酵素Q₁₀の抽出をジメチルスルホ
キシドとエチルアルコールとの混合溶媒を使用
し、２時間撹拌抽出を行なつた。以下は実施例２
と同様の方法で行なつた。これ等の結果を第１表
に示す。実施例５実施例１と同じ菌を用い培養した。但し、乾燥
菌体20.6ｇ（補酵素Q₁₀含有量14.1mg）をジメチ
ルスルホキシド45mlとアセトン45mlとの混合溶媒
に投入して、50℃にて２時間撹拌抽出を行なつ
た。以下は実施例２と同様の方法で行なつた。こ
の際の抽出率は87.4％であつた。実施例６実施例１と同じ菌を用い、同様にして培養し
た。乾燥菌体42ｇ（補酵素Q₁₀含有量29.4mg）を
ジメチルスルホキシド単独150mlに投入して、70
℃にて２時間撹拌抽出を行なつた。その後は実施
例２と同様の方法で処理した。抽出率は33.2％で
あつた。比較例１実施例１と同じ菌を用い、実施例１と同様にし
て培養した。但し、抽出溶媒としてメチルアルコ
ール、エチルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｎ−プロピルアルコール、アセトン又はアセ
トニトリルを同量用いた。ｎ−ヘキサンに補酵素
Q₁₀を転溶させ静置後に層分離したヘキサン層
は、補酵素Q₁₀の存在を示す橙黄色の着色を示さ
なかつたので、抽出率を測定することなく廃棄し
た。

【表】

【表】（発明の効果）実施例１と第１表から明らかな通り、本発明は
安価な薬品と小型の抽出設備を用いて簡単な工程
で、極めて効率高く補酵素Ｑを抽出することがで
きる。従つて、本発明は産業上極めて有用であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

１補酵素Ｑを含有する微生物菌体から親水性溶
媒を用いて補酵素Ｑを抽出するにあたり、予め補
酵素Ｑの培養液より遠心分離した菌体を乾燥し、
その乾燥菌体より抽出溶媒としてジメチルスルホ
キシドを単独で又はメチルアルコール、エチルア
ルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピ
ルアルコール及びアセトンから成る群から選択し
た親水性溶媒と組合せた混合溶媒を用いて補酵素
Ｑを抽出することを特徴とする補酸素Ｑの製造方
法。