CN114702487A

CN114702487A - 一种麦角酸的纯化方法

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Publication number: CN114702487A
Application number: CN202210312161.9A
Authority: CN
Inventors: 何勇崴; 叶琤; 张葵
Original assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; Peking University Founder Group Co Ltd; PKU Healthcare Industry Group
Current assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; New Founder Holdings Development Co ltd; Peking University Medical Management Co ltd
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114702487B

Abstract

本发明提供一种麦角酸的纯化方法，包括：1)对麦角菌种发酵液进行水解处理，将水解后的体系调节pH值至9.0～10.0后浓缩，得到第一处理液；采用丁醇对第一处理液进行萃取，得到丁醇萃取液；2)将丁醇萃取液浓缩后，降温进行一次结晶，得到一次结晶产品；3)向一次结晶产品中加水使其溶解，并调节溶液的pH值至10.0～11.0，得到第二处理液；向第二处理液中加入活性炭搅拌后过滤并收集滤液；4)将滤液的pH值调节至6.5～7.0后，降温进行二次结晶，得到二次结晶产品；5)使用有机溶剂与水的混合溶剂将二次结晶产品溶解后，进行三次结晶，得到麦角酸。该纯化方法能够简单快速、低成本地以高纯度和高收率制得麦角酸。

Description

一种麦角酸的纯化方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种麦角酸的纯化方法。

背景技术

麦角酸是天然产物麦角生物碱的基本结构的一部分，可用于许多半合成麦角生物碱中间体。有些半合成麦角生物碱可作为药品，例如尼麦角林、甲基麦角新碱、溴麦角隐亭等。其中，尼麦角林可加强脑细胞能量的新陈代谢，加强脑部蛋白质生物合成，改善脑功能；甲基麦角新碱直接作用于子宫平滑肌，作用强而持久，大剂量可使子宫肌强直收缩，能使胎盘种植处子宫肌内血管受到压迫而止血，用于治疗产后子宫出血以及子宫复原不佳。

麦角酸的结构如式1所示：

对麦角菌种发酵液进行水解处理后，可得到含麦角酸的混合液，对此混合液进行纯化可分离得到麦角酸。目前对麦角菌种发酵液的水解体系纯化分离制备麦角酸的方式主要有以下两种：采用硫酸对水解体系酸化后用甲醇和氨水溶解后浸提后重结晶，但水解体系中的成分非常复杂，麦角酸的纯度低，很难析出晶体，析出物状态为色泽发黑的粘稠物，析出物的收率也非常低；另一种是采用苯乙烯-二乙烯基大孔树脂对水解体系进行纯化，但麦角酸的极性较强，在大孔树脂上的吸附量很少，且水解体系中除麦角酸外的杂质成分也不利于麦角酸在大孔树脂上进行吸附，导致大孔树脂的用量很大，后续解吸、再生使用的有机溶剂、酸、碱用量也非常大，极大地增加了纯化的成本，造成资源的浪费。

因此，如何能够简单快速、低成本地从麦角菌种发酵液的水解体系中以高纯度和高收率地分离得到麦角酸是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种麦角酸的纯化方法，该方法能够简单快速、低成本地以高纯度和高收率纯化得到麦角酸，适用于大规模地工业化生产中。

本发明提供一种麦角酸的纯化方法，包括以下步骤：

1)对麦角菌种发酵液进行水解处理，将水解后的体系调节pH值至9.0～10.0后浓缩，得到第一处理液；采用丁醇对所述第一处理液进行萃取，得到丁醇萃取液；

2)将所述丁醇萃取液浓缩后，降温进行一次结晶，得到一次结晶产品；

3)向所述一次结晶产品中加水使其溶解，并调节溶液的pH值至10.0～11.0，得到第二处理液；向所述第二处理液中加入活性炭搅拌后过滤并收集滤液；

4)将所述滤液的pH值调节至6.5～7.0后，降温进行二次结晶，得到二次结晶产品；

5)使用有机溶剂与水的混合溶剂将所述二次结晶产品溶解后，进行三次结晶，得到所述麦角酸。

如上所述的纯化方法，其中，步骤5)中，所述三次结晶包括：向所述二次结晶产品中加入所述混合溶剂使其溶解后，升温至50～60℃并搅拌2～3h，得到第一结晶体系；使所述第一结晶体系降温至30～35℃，并加入所述有机溶剂搅拌2～3h，得到第二结晶体系；使所述第二结晶体系降温至0～10℃并搅拌6～8h，得到第三结晶体系。

如上所述的纯化方法，其中，步骤1)中，所述萃取的方式为逆流萃取。

如上所述的纯化方法，其中，步骤2)中，所述一次结晶包括：使浓缩后的丁醇萃取液在0～5℃下保温5～6h，得到所述一次结晶产品。

如上所述的纯化方法，其中，步骤3)中，基于所述第二处理液的体积，每100mL第二处理液中加入4～5g活性炭。

如上所述的纯化方法，其中，步骤4)中，所述二次结晶包括：使pH值调节至6.5～7.0的滤液在0～10℃下保温6～8h，得到所述二次结晶产品。

如上所述的纯化方法，其中，步骤3)中，所述溶解在50～60℃下进行，所述过滤在保温状态下进行。

如上所述的纯化方法，其中，步骤3)中，基于所述一次结晶产品的质量，每1kg一次结晶产品中加入9～11L的水。

如上所述的纯化方法，其中，步骤1)中，所述水解处理包括：将麦角菌种发酵液过滤后得到滤液，在加热条件下使所述滤液在碱性条件下进行水解。

本发明所提供的麦角酸的纯化方法，通过采用丁醇对麦角菌种发酵液的水解体系进行转相萃取，可去除水解液中的大部分水溶性杂质，使体系转变为易结晶的状态，且通过后续的三次结晶陆续除去体系中的水溶性和脂溶性杂质，快速地以高纯度和高收率地纯化得到麦角酸晶体。该方法具有纯化步骤简单快速、成本低、废液产生量小等优点，具有明显的经济、安全和环保优势，适用于大规模地工业化生产中。

附图说明

图1为实施例2纯化得到的麦角酸的HPLC图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种麦角酸的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)对麦角菌种发酵液进行水解处理，将水解后的体系调节pH值至9.0～10.0后浓缩，得到第一处理液；采用丁醇对第一处理液进行萃取，得到丁醇萃取液；

2)将丁醇萃取液浓缩后，降温进行一次结晶，得到一次结晶产品；

3)向一次结晶产品中加水使其溶解，并调节溶液的pH值至10.0～11.0，得到第二处理液；向第二处理液中加入活性炭搅拌后过滤并收集滤液；

4)将滤液的pH值调节至6.5～7.0后，降温进行二次结晶，得到二次结晶产品；

5)使用有机溶剂与水的混合溶剂将二次结晶产品溶解后，进行三次结晶，得到麦角酸。

本发明中所述的麦角菌种发酵液是指麦角菌在发酵后得到的混合液，发酵方法可采用本领域常用的方法，如采用如下方法对麦角菌种进行发酵：取麦角菌种接入种子瓶培养，后转入种子罐培养，达到培养时间后转入发酵罐内培养，控制发酵罐内的pH、温度、溶氧等参数条件直至发酵结束后放罐。麦角菌种发酵液中的主要成分为麦角新碱，根据具体发酵条件和麦角菌种能力的不同，发酵液中的麦角新碱的含量一般会有所差异，但通常都在30～50wt％的范围内，除麦角新碱外，发酵液中还包括其余麦角生物碱物质。麦角新碱的结构式如式2所示，在水解反应中，麦角新碱中的酰胺键发生断裂，从而水解得到麦角酸。

水解后的麦角菌种发酵液进行过滤后滤液为强碱性，在长时间放置或者加热后，可用HPLC检测到麦角酸含量会降低，且有未知杂质生成，因此需要先将其碱性降至pH值为9.0～10.0后再浓缩，可以降低麦角酸的损失。在现有工艺中，通常将水解后的体系酸化后直接进行结晶，但此时体系中的成分过于复杂，包含各种无机杂质和有机杂质，很难析出固体。

本申请的发明人通过大量实验研究发现，采用丁醇对第一处理液进行萃取，能分离出第一处理液中绝大部分的水溶性杂质，得到的丁醇萃取液处于易结晶的状态，再分别进行一次结晶、二次结晶和三次结晶，不断纯化去除体系中的油溶性杂质和脂溶性杂质，从而得到高纯度的麦角酸晶体。其中，一次结晶、二次结晶、三次结晶中特定的pH条件和溶剂体系不仅有利于使麦角酸与其他杂质分离，还有利于麦角酸的在纯化过程中稳定存在，避免其在分离过程中转化为其他杂质，从而保证了麦角酸的纯化收率。

本发明的纯化方法可简单快速地以高纯度和高收率得到麦角酸，其成本低、废液产生量少，具有显著的经济、安全和环保优势，适用于大规模地工业化生产中。

在水解前通常先对麦角菌种发酵液过滤除去其中的不溶性杂质，过滤可采用本领域常规过滤方式，如板框压滤、陶瓷膜过滤，离心等，优选采用陶瓷膜过滤。过滤后再对滤液进行水解，水解可采用本领域的常规水解条件，例如，在加热状态下，使滤液在碱性条件下进行水解。其中，碱性条件可通过在水溶液中加入氢氧化钠和/或氢氧化钾实现。

在一种具体的实施方式中，步骤5)的有机溶剂选自乙腈和/或丙酮，其中，混合溶剂中有机溶剂与水的体积比为(0.35～0.6):1时，进一步优选为(0.4～0.5):1时，能够进一步提高麦角酸的收率和纯度。

进一步的，当步骤5)中的三次结晶为阶段式降温结晶时，能够获得纯度更高的麦角酸晶体。具体的，阶段式降温结晶的过程包括：向二次结晶产品中加入混合溶剂使其溶解后，并升温至50～60℃并搅拌2～3h，得到第一结晶体系；使第一结晶体系降温至30～35℃，并加入有机溶剂搅拌2～3h，得到第二结晶体系；使第二结晶体系降温至0～10℃，进一步优选为4～6℃，并搅拌6～8h，得到麦角酸。可以理解的是，在第二结晶体系降温析晶后，还需对降温析晶的体系进行过滤并对晶体干燥，即可得到麦角酸。在上述阶段式降温结晶的过程中，基于二次结晶产品的质量，第一结晶体系中，每1g的二次结晶产品中加入14～16mL的混合溶剂；第二结晶体系中，每1g的二次结晶产品中加入9～11mL的有机溶剂。

在采用丁醇对第一处理液进行萃取时，可采用少量多次的方式以获得更好的萃取效果和萃取效率，每次加入的萃取溶剂的体积为第一处理液体积的0.5～1倍，萃取至水层残留的麦角酸质量低于萃取前麦角酸质量的10％以下即可。

除上述传统的萃取方式外，采用逆流萃取的方式能够获得更高的萃取效率和更为优异的萃取效果。逆流萃取的原理为，利用螺旋柱在行星运动时产生的多维离心力场，使丁醇和水相不断混合，以水相为固定相，连续向水相固定相中输入丁醇相，按照分配系数的不同，有机物被依次萃取至丁醇相中，从而得到优异的萃取效果。

在得到丁醇萃取液后，其溶液浓度太小，不适宜直接结晶，将丁醇浓缩液浓缩至其中麦角酸的含量为40～50g/L时再降温在0～5℃下保温5～6h进行一次结晶，可获得较优的结晶效果。

在步骤5)中，在第二处理液中加入活性炭能够吸附第二处理液中的色素杂质，有利于结晶得到色度更优的麦角酸晶体。基于第二处理液的体积，在每100mL第二处理液中加入4～5g活性炭可以获得较好的吸附效果。本发明中使用的活性炭为粉末状活性炭，优选为737针活性炭。

在得到第二处理液的过程中，由于麦角酸在水中的溶解度较差，可通过加热促进一次结晶产品在水中的溶解，加热温度为50～60℃；同样的，为避免第二处理液在过滤时有固体析出，过滤也在保温状态下进行。

在步骤3)的加水溶解过程中，基于一次结晶产品的质量，每1kg一次结晶产品中加入的水的量为9～11L。

经过实验摸索发现，步骤4)中，较为适宜的二次结晶过程包括：使pH值调节至6.5～7.0的滤液在0～10℃下，优选为3～5℃下，保温6～8h，得到二次结晶产品。

本发明的二次结晶的母液可以采用丁醇继续萃取，并重复进行步骤3)～5)，实现母液的回收套用；同样的，三次结晶母液可减压浓缩去除有机溶剂后，水相体系也可以采用同样的方式实现回收套用。经过回收套用后，麦角酸的纯化收率可达到80％以上，具有良好的经济效益。

以下，将结合具体的实施例对本发明所提供的麦角酸的纯化方法进行详细地阐述。在下述实施例中，如无特殊说明，所有原料均可通过商购或常规方法纯化得到。

以下实施例和对比例中均采用HPLC法对各个步骤中的组分含量及产品纯度进行检测。

其中，HPLC的测试条件如下：

HPLC仪器型号：安捷伦G1314B；色谱柱：Wetch Uitimate XB-C18 4.6mm*5um*250mm；流动相：A相为0.01mol/L K₃PO₄水溶液：已腈＝95:5(v/v)，B相为0.01mol/L K₃PO₄水溶液：已腈＝65:35(v/v)；检测器波长：310nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱程序如表1所示。

表1

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
20	90	10
			27	70	30
35	0	100
			44	0	100
45	100	0
			55	100	0

注：麦角酸、麦角酸碱性盐结合物或麦角酸酸性盐结合物在HPLC中的出峰位置重叠。为了方便描述，以下实施例和对比例中检测到的麦角酸、麦角酸碱性盐结合物以及麦角酸酸性盐结合物或其混合物的含量，均统一描述为麦角酸含量。

实施例1

本实施例的麦角酸纯化方法包括以下步骤：

1)将麦角菌发酵液放罐，采用板框压滤法过滤得到滤液106L，加入氢氧化钠加热水解得到水解液，检测到水解液中麦角酸质量为224g，麦角酸纯度为63.4％。采用盐酸调节水解液pH至9.1，使用玻璃旋转蒸发器减压浓缩水解液至11L，得到第一处理液。采用11L的丁醇萃取第一处理液，共萃取三次，合并得到丁醇萃取液，测得丁醇萃取液中麦角酸质量为204g。

2)采用玻璃旋转蒸发器对丁醇萃取液进行减压浓缩至体积为5.1L，麦角酸的质量含量为40.8g/L，缓慢降温至5.0℃结晶5h，抽滤，得到一次结晶产品，一次结晶产品中含麦角酸171g，纯度为78.4％。

3)采用1550L一级反渗透水溶解一次结晶产品，并用氨水调节pH值为10.0，加热至60℃保持5h，加入62g活性炭保温搅拌30min后过滤，用草酸调节滤液的pH值为6.5，并缓慢降温至3℃结晶6h，得到二次结晶产品，二次结晶产品中含麦角酸142g，纯度为92.1％。

4)将二次结晶产品加入2L的40％体积浓度的乙腈水溶液(0.8L乙腈+1.2L水)中搅拌加热至50℃溶解2小时，缓慢降温至35℃后再加入1.3L的乙腈，并保温搅拌2h，再缓慢降温至4℃结晶6h，抽滤，得到三次结晶产品，将三次结晶产品在真空干燥箱中干燥，得到白色麦角酸晶体107.6g，纯度为97.4％，纯化总收率为48.0％。

实施例2

本实施例的麦角酸纯化方法包括以下步骤：

1)将麦角菌发酵液放罐，使用陶瓷膜过滤得到滤液156L，加入氢氧化钠加热水解得到水解液，检测到水解液中麦角酸的质量为268g，麦角酸纯度为65.2％。采用硫酸调节水解液pH至10.0，使用玻璃旋转蒸发器减压浓缩水解液至10.5L，得到第一处理液。使用三次逆流萃取器对第一处理液进行萃取，共使用丁醇萃取剂20L，测得丁醇萃取液中麦角酸质量为256g。

2)采用玻璃旋转蒸发器对丁醇萃取液进行减压浓缩至体积为5L，麦角酸的质量含量为50g/L，缓慢降温至0℃结晶6h，抽滤，得到一次结晶产品，一次结晶产品中含麦角酸218g，纯度为80.6％。

3)采用2300L一级反渗透水溶解一次结晶产品，并用氨水调节pH值为11.0，加热至50℃保持6h，加入100g活性炭保温搅拌30min后过滤，用柠檬酸调节滤液的pH值为7，并缓慢降温至5℃结晶8h，得到二次结晶产品，二次结晶产品中含麦角酸172g，纯度为94.7％。

4)将二次结晶产品加入2.7L的50％体积浓度的丙酮水溶液中搅拌加热至60℃保持3小时，缓慢降温至30℃后再加入1.9L的乙腈，并保温搅拌3h，再缓慢降温至6℃结晶8h，抽滤，得到三次结晶产品，将三次结晶产品在真空干燥箱中干燥，得到白色麦角酸晶体108.0g，纯化总收率为40.3％。

采用HPLC对实施例2得到的白色麦角酸晶体取样进行分析，图1为实施例2纯化得到的麦角酸的HPLC图，从图中可得出表2的相关信息：

表2

其中，图1中保留时间为14.612min的峰为麦角酸的峰，保留时间为19.350min的峰为异麦角酸的峰。根据表2可知，本实施例纯化得到的麦角酸的纯度为98.5％。

实施例3

本实施例的麦角酸纯化方法的步骤1)-步骤3)与实施例1一致，步骤4)为：将二次结晶产品加入2L的40％体积浓度的乙腈水溶液中搅拌加热至50℃溶解2小时，再缓慢降温至4℃，结晶6h，抽滤后干燥，得到三次结晶产品，将三次结晶产品在真空干燥箱中干燥，得到白色麦角酸晶体45.4g，纯度为99.1％，纯化总收率为20.3％。

实施例4

本实施例的麦角酸纯化方法的步骤1)-步骤3)与实施例1一致，步骤4)为：将二次结晶产品加入3.3L的63.6％体积浓度的乙腈水溶液(2.1L乙腈+1.2L水)中搅拌加热至50℃溶解2小时，再缓慢降温至4℃结晶6h，抽滤，得到三次结晶产品，将三次结晶产品在真空干燥箱中干燥，得到白色麦角酸晶体88.04g，纯度为94.7％，纯化总收率为39.3％。

对比例1

本实施例的麦角酸纯化方法包括以下步骤：

1)将麦角菌发酵液放罐，采用板框压滤法过滤得到滤液65L，加入氢氧化钠加热水解得到水解液，检测到水解液中麦角酸质量为113g，麦角酸纯度为67.1％。采用盐酸调节水解液pH至9.5，使用玻璃旋转蒸发器减压浓缩水解液至5.1L，得到第一处理液。采用5L的丁醇萃取第一处理液，共萃取三次，合并得到丁醇萃取液，测得丁醇萃取液中麦角酸质量为104g。

2)采用玻璃旋转蒸发器对丁醇萃取液进行减压浓缩至体积为2.3L，麦角酸的质量含量为45.2g/L，缓慢降温至5.0℃结晶5h，抽滤，得到一次结晶产品，一次结晶产品中含麦角酸85g，纯度为79.6％。

3)将一次结晶产品加入1.2L的40％体积浓度的乙腈水溶液中搅拌加热至50℃保持2小时，缓慢降温至35℃后再加入0.77L的乙腈，并保温搅拌2h，再缓慢降温至4℃结晶6h，抽滤，得到结晶体，将结晶体在真空干燥箱中干燥，得到灰黑色结晶粉末。HPLC检测干燥晶体中灰黑色晶体粉末中含麦角酸量为56.7g，纯度为87.6％，纯化总收率为54.5％。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种麦角酸的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤5)中，所述有机溶剂选自乙腈和/或丙酮；

所述混合溶剂中有机溶剂与水的体积比为(0.35～0.6):1。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，步骤5)中，所述三次结晶包括：向所述二次结晶产品中加入所述混合溶剂使其溶解后，升温至50～60℃并搅拌2～3h，得到第一结晶体系；使所述第一结晶体系降温至30～35℃，并加入所述有机溶剂搅拌2～3h，得到第二结晶体系；使所述第二结晶体系降温至0～10℃并搅拌6～8h，得到所述麦角酸。

4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述萃取的方式为逆流萃取。

5.根据权利要求1-4任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述一次结晶包括：使浓缩后的丁醇萃取液在0～5℃下保温5～6h，得到所述一次结晶产品。

6.根据权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，基于所述第二处理液的体积，每100mL第二处理液中加入4～5g活性炭。

7.根据权利要求1-6任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤4)中，所述二次结晶包括：使pH值调节至6.5～7.0的滤液在0～10℃下保温6～8h，得到所述二次结晶产品。

8.根据权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，所述溶解在50～60℃下进行，所述过滤在保温状态下进行。

9.根据权利要求1-8任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，基于所述一次结晶产品的质量，每1kg一次结晶产品中加入9～11L的水。

10.根据权利要求1-9任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述水解处理包括：将麦角菌种发酵液过滤后得到滤液，在加热条件下使所述滤液在碱性条件下进行水解。