DE2053763B2 - Verfahren zur Isolierung des Vitamins B tief 12 aus Kulturflüssigkeiten oder Biomassen der Mikroorganismen, die das Vitamin B tief 12 produzieren - Google Patents

Description

Hydrolyse der Kulturflüssigkeit oder der Biomasse oder Zellenstrukturelemente gebunden vor. In freiem

im salzsauren Medium bei einem pH von 4,0 in 40 Zustand liegt das Vitamin B₁₂ nur in alten Kulturen

Gegenwart von 0,5 Gewichtsprozent Ammonium- vor, in denen es zur Auflösung der Zellen der Mikro-

rhodanid oder 0,01 Gewichtsprozent Kalium- Organismen gekommen ist. Deshalb werden die KuI-

zyanid als Stabilisator und von 0,5 Gewichtspro- turflüssigkeiten sowie die aus diesen durch Abtren-

zent des Natriumsalzes des N-Chlorbenzolsulf- nen der Mikroorganismenzellen erhaltenen Biomas-

amids oder 0,25 Gewichtsprozent Chlorsukzin- 45 sen zwecks Inlösungbringens des Vitamins B₁₂ und

imid als Destruktionsmittel bei einer Temperatur der anderen Kobalamine speziellen Behandlungen

von 96 bis 98° C und die Sorptionsreinigung der unterworfen, welche das Absterben der Zellen, die

Hydrolysate bzw. der Extrakte mit dem Alumi- Zerstörung der Zellenstruktur und die Denaturierung

niumoxid im wäßrigen Medium mit Aluminium- der Eiweißstoffe bewirken. Dazu wendet man am

oxid in der sauren Form bei einem pH-Wert von 50 häufigsten die Hydrolyse oder Extraktion der Sub-

3 bis 5 und mit Aluminiumoxid in der alkalischen strate an.

Form bei einem pH-Wert von 8 bis 10, wobei Die Hydrolyse führt man bei Temperaturen von man die Behandlung mit dem Aluminiumoxid in 50 bis 120° C in wäßrigem oder wäßrig-organischem der sauren und alkalischen Form in beliebiger Medium von pH 4 bis 8 (vgl. österreichische Patent-Reihenfolge vornimmt, durchführt oder daß man, 55 Schriften 194 532 und 198 884) in Gegenwart eines im Fall der genannten Sorptionsreinigung der Hy- Stabilisators, der d«.- Vitamin B₁₂ in eine beständige drolysate mit dem monofunktionellen Karboxyl- Form überführt und damit vor Zersetzung während kationenaustauscher vom Polymerentyp in der der Behandlung schützt, durch. Als Stabilisatoren H⁺-Form, die gefärbten Verunreinigungen im verwendet man Zyanide (vgl. österreichische Patent-Eluat dieses Ionenaustauscher mit Aluminium- 60 schrift 203 630), Ammoniumrhodanid, Natriumoxid in der alkalischen Form bei einem pH-Wert hydrogensulfit und Natriumnitrit. Das Ansäuern der von 8 bis 9 und dann mit Aluminiumoxid in der zu hydrolysierenden Gemische erfolgt mit Salzsäure, sauren Form bei einem pH von 3 bis 4 sorbiert. seltener mit Schwefel-, Essig- oder Oxalsäure. Man

wendet auch ein Autoklavieren bei 110 bis 120° C in

65 Gegenwart von Zyaniden an (vgl. USA.-Patentschrift

2 941 993).

Zur Extraktion benutzt man im allgemeinen wäßriges Aceton oder wäßrige niedere aliphatische

Alkohole (vgl. USA.-Patentschrift 2 764 521 und wäßriger Lösung in Gegenwart von Zyanionen unter deutsche Patentschrift 1 065 979); derartige Lösun- anschließendem Eluieren mit wäßriger Essigsäure gen verwendet man in einigen Fällen auch bei der (vgl. USA.-Patentschrift 2 709 669).
Hydrolyse. Die meisten bekannten Extraktionsver- Adsorptionsmitteln und/oder Kunstharzaustaufahren gewährleisten aber nicht die Zerstörung aller 5 schem haftet jedoch als allgemeiner Nachteil eine Arten von Bindungen des Vitamins mit den Zellen- ungenügende Entfernung der gefärbten Veranreinistrukturen, wodurch bedeutende Vitaminverluste gungen an, von denen einige sich auch bei den nacheintreten, die 40 bis 50 % zum Ausgangsgehalt er- folgenden Reinigungsstufen nicht entfernen lassen,
reichen. Besonders wirksame Verfahren, wie das Nach der Vorreinigung werden die Vitamin-B^- Autoklavieren in Gegenwart von Zyaniden. eignen io Lösungen mit Zyaniden zwecks Überführung des sich nur schwer für eine großtechnische Anwendung. Vitamins B₁, und der anderen Kobalamine in die Zur maximalen Extraktion des Vitamins B₁₂ aus dem Zyan- oder Dizyanform behandelt Die zyanierten Substrat verwendet man zweckmäßig spezielle Mittel, Lösungen unterwirft man allgemein der Extraktion welche die lebenden Zellen der Mikroorganismen mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln und rasch abtöten und weitgehend abbauen. 15 der mehrstufigen Verteilung in Mehrkomponen-

Die erhaltenen Hydrolysate und Extrakte enthal- tengemischen organischer Lösungsmittel mit Wasser ten neben Kobalaminen viele Verunreinigungen, wie in Zweiphasensystemen, im letzteren Fall am häufig-Mineralsalze, Eiweißstoffe, Peptide und gefärbte sten in Gemischen von Phenolen mit Tetrachlor-Stoffe, deren Entfernung langwierig und umständlich kohlenstoff, Chloroform, Propanol, Butanol usw. ist; besonders schwierig ist die Entfernung einiger ge- so (vgl. deutsche Patentschrift 859 359).
färbter Verunreinigungen. Zur Reinigung der Aus- Das Vitamin B₁₂ wird sodann von den Begleitgangshydrolysate und -extrakte sind eine Anzahl kobalaminen mi fels Chromatographie auf Alu-Verfahren bekannt. miniumoxid in wäßrigem Methanol, Aceton oder

Zur Vorreinigung werden verschiedene Sorptions- Dioxan abgetrennt und schließlich aus Aceton, arten und den Ionenaustausch benutzt wobei in Ab- as Dioxan oder Methanol kristallisiert Falls neben anhängigkeit von den Durchführungsbedingungen ent- deren Kobzüaminen der Faktor III (5-Oxybenzimidweder nur Verunreinigungen oder nur Kobalamine azolkobalamin) anwesend ist, ist für dessen Abtrenadsorbiert werden; letztere eluiert man dann auf ver- nung vom Vitamin B₁₂ eine spezielle Behandlung erschiedenem Wege zusammen mit bedeutenden Men- forderlich, z. B. ein Chromatographieren auf Zellugen von Begleitverunreinigungen. So verwendet man 30 losepulver.

zur Adsorption des Vitamins B₁, und der anderen Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Isolie-Kobalamine Aktivkohle, während für die anschlie- rung von Vitamin B₁₂ in kristalliner Form aus KuI-ßende Elution wäßriges Aceton und wäßrige Aiko- turflüssigkeiten bzw. Biomassen von Vitamin B₁₂ prohole verwendet werden (vgl. USA.-Patentschrift duzierenden Mikroorganismen, insbesondere von 2668 137 und deutsche Patentschrift 932 576). Mont- 35 denen der thermophilen Methangärung auf Acetonmorillonit-Sorptionsmittel, wie Bentonit und Fuller- butylschlempe. Die Methangärung auf komplizierten erde, im sauren, wäßrigen Medium verwendet man organischen Substraten wird durch eine gemischte zur Adsorption der Kobalamine, die dann mit wäß- Kultur, nämlich eine natürliche Biozönose anaerober rigen Lösungen vom pH 6 bis 9 in Gegenwart von Bakterien, darunter der fäulnis- und methanbilden-Stabilisatoren eluiert werden (vgl. USA.-Patentschrift 40 den Bakterien, verwirklicht. Die großtechnische Ver-2 643 210 und schweizerische Patentschrift 339 323). Wendung einer solchen gemischten Kultur zur Ge-Diese Sorptionsmittel sind auch zum Entfernen ge- winnung von Vitamin B₁₂ ist von großem Interesse, färbter Verunreinigungen verwendbar. Kieselgur weil sie keine sterilen Bedingungen bei der Fermendient in wäßrigen Lösungen vorzugsweise zum Ent- tation erfordert und als Nährmediun einen billigen fernen von Verunreinigungen und als Filtriennittel. 45 Rohstoff, z. B. Abfälle der Nahrungsmittel-, holz-

Das übliche chromatographische Aluminiumoxid, chemischen und anderer Betriebe sowie Abwasser,

das einen wäßrigen Auszug vom pH um 7 liefert, be- ausnutzen kann. Durch Zugabe von die Biosynthese

nutzt man manchmal zur Reinigung wäßriger Vit- des Vitamins B₁₂ stimulierenden Stoffen kann dessen

amin-B₁₂-Lösungen. Diese Behandlung ist jedoch Speicherung in der Kulturflüssigkeit merklich erhöht

wenig wirksam und ermöglicht nicht die Entfernung 50 werden.

aller gefärbten Verunreinigungen, wie speziell ange- Da die Kulturflüssigkeit der Methangärung jedoch

stellte Versuche erwiesen. sehr stark durch gefärbte Stoffe verunreinigt ist und

Kunstharz-Ionenaustauscher verwendet man ent- bedeutende Mengen des sogenannten Faktors III entweder zur Entfernung saurer und alkalischer Ver- hält, ist deren Reinigung langwierig und kompliziert unreinigungen (vgl. USA.-Patentschrift 2 684 322) 55 sowie mit großen Vitamin-B₁₂-Verlusten und der oder zur Adsorption des Vitamine B₁₂ und anderer Verteuerung seiner Gewinnung verbunden.
Kobalamine, z. B. Kationenaustauscher von Poly- Zur Herstellung von billigem kristallinem Vitmerentyp mit monofunktionellen Carboxylgruppen. amin B₁₂ aus vorgenannten Substraten ist es daher Die Kobalamine werden in saurem Medium von dem notwendig, die Reinigung einfach und wirtschaftlich Kationenaustauscher in der H⁺-Form adsorbiert, 60 zu gestalten und eine hohe Ausbeute an hochreinem dann mit wäßrigen Alkalilösungen eluiert (vgl. Vitamin B₁₂ zu erzielen. Dies wird bei Anwendung deutsche Patentschrift 950 675). Man verwendet auch des weiter unten definierten erfindungsgemäßen Verneutrale entfärbende Phenolharze, welche die Kobal- fahrens mit Erfolg erreicht.

amine aus wäßriger Lösung beim pH um 6 adsor- Die Erfindung macht Gebrauch von dem zum

bieren, und eluiert mit wäßrigem, salzsäurehaltigem 65 Stand der Techaik gehörenden Verfahren zur Isolie-

Aceton (vgl. USA.-Patentschrift 2 7G2 203). Bekannt rung des Vitamins B₁₂ aus der Kulturflüssigkeit oder

ist auch die Verwendung von Anionenaustauschern der Biomasse der Mikroorganismen, die das genannte

in der CN~-Form für die Kobalaminadsorption aus Vitamin produzieren,

1. durch deren Hydrolyse bei erhöhten Tempera- Biomassen erfolgt im salzsauren Medium beim türen in salzsaurem Medium in Gegenwart von pH 4,0 in Gegenwart von 0,5 G^chtsprozent Am · bekannten Stabilisatoren oder durch deren Ex- moniumrhodanid oder 0,01 Gewichtsprozent Kaliumtraktion mit wäßrig-organische α Gemischen, zyanid als Stabilisator and 0,5 Gewichtsprozent

2. durch daran anschließend- Sorptionsreinigung 5 Natriumsalz des N-CMorbenzolsulfamids oder 0,25 der erhaltenen Hydrolysate bzw. der Extrakte Gewichtsprozent Chlorsukzuiimid als Destruktionsmit Aluminiumoxid im wäßrigen Medium oder mittel bei einer Temperatur von 96 bis 98° C. Diese durch daran anschließende Sorptionsrühiigung Hydrolyse gewährleistet eine praktisch vollständige der Hydrolysate mit einem monofunktionellen Überführung des gebundenen Vitamins B₁, in den K^-boxylkationenaustauscher vom Polymeren- io freien Zustand. Die Kulturflüssigkeiten hydrolysiert typ in der H⁺-Form bei einem pH-Wert von man in einem mit Rückflußkühler, Thermometer, 2,5 bis 3,0 und durch Elution des auf diesem Rührer sowie Heiz- und Kühleinrichtung versehenen Kationenausiauscher adsorbierten Vitamins B₁₂ Behälter. Die Biomassen verdünnt man zuvor mit mit wäßriger Ammoniaklösung und anschlie- mehrfachem Volumen Wasser und hydrolysiert wie ßend mit Ammoniak-Borat-Puffer, 15 vorbeschrieben. Nach der Hydrolyse werden die

3. durch daran anschließende Zyanierung der ge- festen Teilchen von der Flüssigkeit durch Dekantiereinigten Lösungen zum Überführen des Vit- ren, Separieren usw. abgetrennt.

amins B₁₂ in die Zyanform, Die erfindungsgemäß durchgeführte Hydrolyse-

4. durch daran anschließende Extraktion der stufe gewährleistet eine vollständige Überführung zyanierten Lösungen mit organischen Lösungs- ao der gebundenen Kobalamine, darunter auch des Vitmitteln, amins B₁,, in den freien Zustand, wodurch unter sonst

5. durch daran anschließendes Chromatographie- gleichen "Bedingungen die Ausbeute an Zielprodukt ren auf Aluminiumoxid aus wäßrigen Aceton- erhöht wird. Im Vergleich mit bekannten Hydroiyselösungen zum Abtrennen des Vitamins B₁, von verfahren steigt die Ausbeute an Kobalaminen im Begleitkobalaminen und " »₅ Hydrolysat um 30 bis 110°/« bei Anwendung von

6. schließlich durch Kristallisation des abgetrenn- dem Natriumsalz des N-Chlorbenzolsulfamids oder ten Vitamins aus Aceton. von Chlorsukzinimid als Destruktionsmittel, die einen

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch ge- raschen und tisfen Abbau der Mikroorganismen kennzeichnet, daß man die Hydrolyse der Ku'turflüs- zellen hervorrufen. Die Hydrolyse wird in wäßrigem sigkeit oder der Biomasse im salzsauren Medium bei 30 Medium unter milden Bedingungen in einem Reaktor einem pH von 4,0 in Gegenwart von 0,5 Gewichts- konventioneller Art durchgeführt,
prozent Ammoniumrhodanid oder 0,01 Gewichts· Die Extraktion der Kulturflüssigkeiten bzw. Bioprozent Kaliumzyanid als Stabilisator und von 0,5 massen erfolgt in bekannter Weise bei Raumtempe-Gewichtsprozent des Natriumsalzes des N-Chlor- ratur vorzugsweise mit wäßrigem Aceton, Methanol, benzolsulfamids oder 0,25 Gewichtsprozent Chlor- 35 Äthanol oder Isopropylalkohol, zweckmäßig mit 70-sukzinimid a's Destruktionsmittel bei einer Tempera- bis 75gewichtsprozentigem Aceton in Gegenwart von tür von 96 bis 98° C und die Sorptionsreinigung der 0,5 Gewichtsprozent Ammoniumrhodanid oder Ka-Hydrolysate bzw. der Extrakte mit dem Aluminium- liumzyanid als Stabilisator, wonach das Aceton oxid im wäßrigen Medium mit Aluminiumoxid in der abdestilliert wird,
sauren Form bei einem pH-Wert von 3 bis 5 und mit 40 ^. _ . . .
Aluminiumoxid in der alkalischen Form bei einem ^Die Sorpuonsreinigung
pH-Wert von 8 bis 10, wobei man die Behandlung Bei der erfindungsgemäßen Reinigung der crhalmit dem Aluminiumoxid in der sauren und alkali- tenen Hydrolysate bzw. Extrakte durch Adsorption sehen Form in beliebiger Reihenfolge vornimmt. auf Aluminiumoxid in der sauren Form bei einem durchführt, oder daß man im Fall der genannten 45 pH-Wert von 3 bis 5 und in der alkalischen Form Sorptionsreiirgung der Hydrolysate mit dem mono- bei einem pH-Wert von 8 bis 10 wenden die gcfunktionellen Karboxylkationenaustauscher vom färbten Verunreinigungen praktisch vollständig ad-Polymerentyp in der H+-Form die gefärbten Ver- sorbiert, während das Vitamin B₁₂ und die anderen unreinigungen im Eluat dieses Ionenaustauschers mit verwandten Kobalamine in der wäßrigen Lösung Aluminiumoxid in der alkalischen Form bei einem 50 zurückbleiben. Das einzusetzende Al₂O₃ in der sauren pH-Wert von 8 bis 9 und dann mit Aluminium- Form soU einen wäßrigen Auszug vom pH um 3, oxid in der sauren Form bei einem pH von 3 bis 4 das einzusetzende Al₂O₃ in der alkalischen Form sorbiert. _ei_nen solchen vom pH um 10 liefern. Die Behänd-

Das neue Verfahren wird wie folgt durchgeführt: ^l™l ^ ^A1A in der sauren und alkalischen Form

rv 55 führt man in behebiger Reihenfolge durch, d. h. ent-

Die Vorbehandlungen _weder ^ _{der sauren uad dann mil der} alkalischen

Das erfindungsgemäße Verfahren führt, wie oben Form oder umgekehrt

hervorgehoben, zur Isolierung eines hochreinen Zur Bereitung von Al₂O₈ in der sauren Form gibt

kristallinen Vitamins B₁₂ aus Kulturflüssigkeiten ver- man zu 1 kg handelsüblichem chromatographischem

schiedener Mikroorganismen, welche dieses Vitamin 60 Al₂O₃, das einen wäßrigen Auszug mit pH um 7

erzeugen. Außer derartigen Kulturflüssigkeiten kön- liefert, 1,5 bis 2,01 0,2 η-Salzsäure und rührt bis

nen auch Biomassen, die aus jenen Flüssigkeiten zur Einstellung des pH-Wertes auf 3,5, läßt dann

auf irgendeinem Weg, z. B. durch Separieren, Zentri- das Gemisch bis zur Abtrennung einer dichten

fugieren, abgetrennt werden, zur Anwendung korn- Schicht des Sorptionsmittels stehen, wonach die

men. Geeignet sind z. B. Substrate der propioasauren 65 überstehende trübe Lösung abgezogen und das Sorp-

Gärung; wirtschaftlich am besten ist aber die Auf- tionsmittel mehrere Male mit kleinen Anteilen 0,01

arbeitung der stark gefärbten Substrate. η-Salzsäure bis zum pH um 3,0 der wäßrigen Schicht

Die Hydrolyse der Kulturflüssigkeiten oder der gewaschen wird. Zur Bereitung von A1„O. in der

7 8

alkalischen Form setzt man zu 1 kg handelsüblichem dagegen alle die gefärbten Verunreinigungen dadurch

chromatographischem Al₂O₃, das einen wäßrigen entfernt, daß man die gefärbten Verunreinigungen

Auszug mit pH um 7 liefert, 1,5 bis 2,0' 1 0,05 η-Ätz- in dem alkalischen Eluat zunächst mit Al₂O₃ in der

kalilösung zu und rührt bis zum pH 12 bis 13, läßt alkalischen Form bei einem pH-Wert von 8 bis 9

dann das Gemisch bis zum Erzielen einer schwachen 5 und dann mit Al₂O₃ in der sauren Form bei einem

Trübe stehen, zieht die überstehende Lösung ab und pH von 3 bis 4 sorbiert. Hierzu kommen die beiden

wäscht das Sorptionsmittel mehrere Male mit destil- zuvor genannten Al₂O₃-Formen,zum Einsatz,

liertem Wasser bis zum pH 10,0 der wäßrigen Die hohe spezifische Sorptionskraft der beiden

Schicht. Al₂O₃-Formen ermöglicht die Vorreinigung der

Die derart bereiteten Al₂O_s-SorptioT]ismittel zeigen io Substrate wesentlich zu vereinfachen, die Verluste

eine überaus hohe Fähigkeit, gefärbte Verunreini- in der Sorptionsstufe zu senken sowie die Zahl der

gungeu aus wäßrigen Lösungen zu adsorbieren, und nachfolgenden Reinigungsstufen zu verringern und

weisen eine merkliche Adsorptionsselektivität in im Endergebnis die Ausbeute an Zielprodukt zu

Abhängigkeit vom pH-Wert auf, wodurch diese erhöhen. Bedeutsam ist auch, daß die erfindungs-

Sorptionsmittel befähigt sind, sich mit den gefärbten 15 gemäße Hydrolyse und die beiden erfindungsgemä-

Stoffen verschiedener Art umzusetzen. Somit erwei- ßen Sorptionsstufen ohne Verwendung organischer

sen sich die beiden Al₂O₈-Formen gewissermaßen Lösungsmittel durchgeführt wird, wodurch die

als Ionenaustauscher, adsorbieren aber weder das Sicherheit bei der großtechnischen Vitamin-B₁₂-Ge-

Vitamin B₁₂ noch die Begleitkobalamine in einem winnung erhöht und diese außerdem billiger wird,
breiien pH-Bereich, so daß Kobalarninverluste in ao

der Sorptionsstufe unbedeutend sind. ^Die Nachbehandlungen

Die Behandlung mit den zwei Al₂O₃-Formen Die von den gefärbten Verunreinigungen durch führt man entweder unter dynamischen Bedingungen, die erfindungsgemäßen Sorptionsstufen gereinigten nämlich auf Säulen größeren Durchmessers unter Lösungen zyaniert man mit Zyaniden, wie Kalium-Zwangsfiltration oder unter statischen Bedingungen, as oder Natriumzyanid, im alkalischen Medium zur und zwar in einem Behälter, in dem man die zu Überführung des Vitamins B₁₂ und der Begleitkobalreinigende Lösung mit kleineren Anteilen des Sorp- amine in die Zyanform.

tionsmittels (je nach dem Volumen 10: 1 oder 20:1) Das Vitamin B₁₂ und die Begleitkobalamine in der verrührt und mehrere Male das Sorptionsmittel durch Zyanform extrahiert man in Trenntrichtern oder frisches ersetzt. Das verbrauchte Sorptionsmittel läßt 30 Extraktionsapparaten mit unpolaren organischen, sich leicht regenerieren. Man führt zweckmäßig die mit Wasser nicht oder schlecht mischbaren Lösungs-Sorptionsstufe unter dynamischen Bedingungen mitteln zum Abtrennen von Salzen, Eiweißstoffen durch, da dabei die Adsorptionskapa2ität des Sorp- und anderen Verunreinigungen. Als Lösungsmittel tionsmittels maximal ausgenutzt und dessen Waschen sind Gemische von Phenolen mit Chloroform, Tetraerleichtert wird. Um die Reste der das Vitamin B₁₂ 35 chlorkohlenstoff od. dgl. geeignet. Die organische enthaltenden Lösung zu entfernen, wird das ver- Schicht, welche die Kobalamine enthält, trennt man brauchte Sorptionsmittel mit kleinen Anteilen Wasser ab, gibt zu dieser unpolare Lösungsmittel sowie gewaschen, das bis zum pH 4,0 angesäuert oder bis Alkohole vom Butanoltyp zu. Vorzugsweise extrazum pH 8,0 alkalisiert ist, je nachdem, ob die saure hiert man mit dem Gemisch Phenol-Tetrachloroder die alkalische Al₂O₃-Form zur Anwendung 40 kohlenstoff 1:1,1 (volumenmäßig) und fügt zur gelangt. Durch gefärbte Stoffe, besonders verunrei- anschließenden Verdrängung des Vitamins B₁₂ ins nigte Hydrolysate bzw. Extrakte, unterwirft man Wasser Tetrachlorkohlenstoff und Butanol hinzu, einer Vorreinigung durch Adsorption der Kobal- Aus diesem Gemisch werden die Kobalamine mit amine auf Säulen mit monofunktionellen Karboxyl- Wasser extrahiert.

kationenaustauscher vom Polymerentyp in der 45 Durch diese Behandlung konzentriert man die

H^-Form beim pH 2,5 bis 3,0. Dabei wird das Kobalaminlösungen und entfernt einen bedeutenden

Vitamin B₁₂ auf dem Kationenaustauscher adsorbiert, Teil der Salze, Eiweißstoffe und anderer Verunreini-

während ein bedeutender Teil der Verunreinigungen gungen. Die Verluste an Vitamin B₁₂ sind dagegen

in der Lösung zurückbleibt und verworfen wird; unbedeutend.

das Vitamin B₁₂ eluiert man zuerst mit wäßrigem 50 Die Vitamin B₁₂ und die Begleitkobalamine entAmmoniak vom pH 10 bis 12 und anschließend mit haltenden wäßrigen Extrakte werden im Vakuum Ammoniak-Borat-Puffer. auf ein geringes Volumen eingedickt, mit mehr-

Diese Reinigungsmethode ist an sich bekannt fächern Volumen Aceton verdünnt und die nach für Hydrolysate und Extrakte, die aus Kulturflüssig- einem kurzzeitigen Verbleiben der Gemische in der keiten oder Biomassen von Actinomyceten, propion- 55 Kälte ausgefallenen Niederschläge abfiltriert und versauren und anderen Bakterien erhalten werden, bei worfen. Die verbleibenden wäßrigen dunkelroten welchen sie eine genügende Reinigung gewährleistet Aceton-Lösungen werden dagegen auf einer Al₂O₃-(vgl. USA.-Patentschrift 2 996 430). Jedoch sind die Säule aus wäßrigem Aceton oder wäßrigen niederen aus einigen Substraten, z. B. Kulturfliiissigkeiten der Alkanolen zum Abtrennen des Vitamins B₁₂ von den Methangärung, erhaltenen Eluate, wie oben ver- 60 Begleitkobalaminen chromatographiert, das Vitmerkt, noch so stark durch gefärbte Stoffe verunrei- amin B₁₂ mit wäßrigem Aceton oder Alkohol eluiert nigt, daß sie sich mit Hilfe jenes Verfahrens und und durch Zugabe von mehrfachem Volumen Aceton überhaupt der meisten bekannten Verfahren nicht oder Alkohol zum Kristallisieren gebracht Vorzugsweiter reinigen lassen. weise erfolgt die Kristallisation aus Aceton.

Erfindungsgemäß werden aus den nach dem gerade 65 Geht man von Kulturflüssigkeiten der Methanvorstehend beschriebenen Verfahren mit dem mono- gärung aus, so ist ein besonderer Arbeitsgang zum funktionellen Karboxylkationenaustauscher vom Abtrennen des Vitamins B₁₂ vom Begleitkobalamm, Polymerentyp in der H⁺-Form erhaltenen Eluaten dem sogenannten Faktor nf, notwendig, weil letzte-

"7000
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rer in größeren Mengen vorliegt und sich bei An- mehrere Male durch frisches ersetzt. Das Sorptionswendung üblicher chromatographischer Verfahren mittel trennt man durch Dekantieren ab und wascht vom Vitamin B₁₂ nicht trennen läßt. Das Abtrennen mit Wasser vom pH 8,0.

erreicht man jedoch durch Chromatographieren auf Das alkalische Dekantat und das Waschwasser j

Al₂O₃ aus wäßrigem 81- bis 80gewichtsprozentigem 5 säuert man mit Salzsäure bis zum pH 2,5 bis 3,0 an ^

Aceton (d = 0,840 bis 0,842), worauf nach der und behandelt mit Aluminiumoxid in der sauren f

scharfen Trennung der Zonen das Vitamin B₁₂ mit Form (pH des wäßrigen Auszuges 2,5 bis 3,0). Die |

wäßrigem 58- bis 57gewichtspro2:entigem Aceton Behandlung wird unter statischen Bedingungen, wie ί

(d = 0,897 bis 0,900) eluiert wird. Dieses Verfahren oben beschrieben, durchgeführt, indem man das ^!

benutzt man sowohl für die Behandlung der wäß- ίο Sorptionsmittel so lange durch frisches ersetzt, bis

rigen Acetonlösung des Kobalamingemisches wie zum Erzielen einer rosafarbenen Lösung mit einem

auch für die Reinigung des kristallinen Vitamins B₁₂, pH-Wert von 4,0. Das saure Sorptionsmittel wird

das durch den Faktor IH und andere !Cobalamine durch Dekantieren abgetrennt und mit Wasser vom l

verunreinigt ist. Erforderlichenfalls ist die Abtren- pH 4,0 sorgfältig gewaschen. j

nung des Vitamins B₁₂ vom Faktor III auch ohne 15 Das mit dem Waschwasser vereinigte saure De- ]

Einfühning einer zusätzlichen Arbeitsstufe unmittel- kantat wird mit 2 n-NaOH bis zum pH 8,0 alkalisiert j

bar in der Chromatographierstufe der gereinigten und die ausgefallene geringe Niederschlagsmenge ]

Lösung auf Aluminiumoxid im Aceton möglich, äbfiltriert. Das gereinigte Filtrat, dessen Gehalt an |

wodurch die Behandlung von den Faktor III ent- Kobalaminen 68,5%, bezogen auf die Ausgangs- j

haltenden Flüssigkeiten wesentlich erleichtert wird, to menge, beträgt, wird mit 0,03 Gewichtsprozent j

Die Maßnahmen zur Nachbehandlung, die vor- Kaliumzyanid behandelt. Aus der zyanierten, hell \ stehend beschrieben sind, gehören nicht zur vor- himbeerfarbenen Lösung extrahiert man die Kobal- \ liegenden Erfindung. Die erfindungsgemäß ange- amine mit dem Phenol-Tetrachlorkohlenstoff-Gewandten neuen Sorptions/nethoden haben gegenüber misch 1:1,1 (volumenmäßig) und aus der abgeden zahlreichen bekannten Reinigungsmethoden den as trennten organischen Schicht nach Zusatz von Vorteil, daß eine schnelle und auch bei stärkster 1,5 Volumen CCl₄ und 0,8 Volumen Butanol die \ Verschmutzung der Ausgangshydrolysate und -ex- Kobalamine mit kleinen Anteilen Wasser. Der erhaltrakte vollständige Reinigung und Entfärbung der tene himbeerfarbene wäßrige Extrakt, der nach Lösungen in einfacher und optimal wirtschaftlicher Waschen mit Äther 69,3 % Kobalamine, bezogen "■. Weise erzielt wird. 30 auf die Ausgangsmenge, enthält, wird im Vakuum

aiii ein geringes Volumen eingedickt, das Konzentrat

Beispiel l ^_nJ _mj_t ^er Volumen Aceton verdünnt und der

Man verwendet eine Kulturflüssigkeit, die durch beim Stehenlassen der Lösung ausgefallene Nieder-

thermophile Methangärung auf Aceton - Butyl- schlag der verunreinigenden Stoffe abfiltriert. \

Schlempe erhalten wurde und neben Vitamin B₁₂ 35 Das wäßrige Acetonfiltrat wird auf einer Säule

bedeutende Mengen des Faktors ΙΠ und anderer mit Aluminiumoxid zum Abtrennen des Vitamins B,,

Kobalamine enthält. von den Begleitkobalaminen Chromatographien. Die i

Zu 600 1 dieser Kulturflüssigkeit gibt man in Kobalamine werden mit wäßrigem 77gtwichtspio- ;

einem Hydrolysegefäß 3 kg Ammoniumrhodanid, zentigem Aceton getrennt dann mit wäßrigem 3 kg des Natriumsalzes des N-Chlorbenzolsulfamids 40 47gewichtsprozentigem Aceton eluiert. Die das Vit-

und Salzsäure bis zum Erreichen des pH 4,0 zu, amin B₁₂ mit einer Beimengung des Faktors III und

hydrolysiert das Gemisch eine Stunde lang bei 96 einiger anderer Kobalamine enthaltende Eluatfrak-

bis 98° C und hält danach noch eine Stunde ohne tion wird gesondert gesammelt. Aus dem wäßrigen r

Erhitzung. Das Hydrolysat säuert man mit Salzsäure dunkelroten Acetoneluat kristallisiert das Vitamin B₁₂ bis zum pH 2,5 bis 2,7 an, läßt einige Stunden 45 nach Zugabe einiger Volumen Aceton,

stehen und dekantiert dann die Flüssigkeit vom Die Ausbeute an lufttrockenen Kristalleo dunkel-

Niederschlag. Der Gehalt des Dekantats an Kobal- roter Farbe beträgt 59,1 %, bezogen auf den Gehalt

aminen beträgt 98,3 °/o, bezogen auf die in der der Ausgangskulturflüssigkeit an Kobalaminen, die

Kulturflüssigkeit enthalten gewesene Ausgangsmenge. Feuchtigkeit der Kristalle 12 °/o. Durch Elektro-

Das Dekantat mit einem pH-Wert von 2,5 bis 2,7 50 phorese und Papierchromatographie ergibt sich, daß

leitet man durch mit einem monofunktionellen Karb- die Kristalle aus einem Gemisch von 64»i Vit-

oxylkationenaustauscher vom Polymerentyp in der amin B₁₂, 29 % Faktor ΙΠ und 77% nicht identifi-

H⁺-Form gefüllte Säulen. Nach beendeter Adsorp- zierter Kobalamine bestehen, fremde, gefärbte Ver-

tion der Kobalamine wird der Kationenaustauscher unreinigungen jedoch fehlen.

mit Wasser vom pH 2,5 bis 2,7 gewaschen. Zur 55 Zum Abtrennen des Vitamins B₁₂ vom Faktor ΙΠ

Desorption der Kobalamine vom Kationenaustau- löst man das kristalline Rohpräparat in wäßrigem

scher führt man diesen in die NH₄+-Form durch Aceton (d = 0,840) auf und chromatographiert auf

Behandlung mit 1 n-wäßriger Ammoniaklösung über, Aluminiumoxid aus dem gleichen wäßrigen Aceton

wonach die Kobalamine mit Ammoniak-Borat- unter anschließendem Eluieren des Vitamins B₁₂ mit Puffer (5,2 g H₃BO₃ und 0,1 g NH₄CNS in 1 Liter 60 wäßrigem Aceton (d = 0,897). Aus dem wäßrigen

0,27 bis 0,33 η-wäßrigem Ammoniak) eluiert werden. Acetoneluat läßt man das Vitamin B₁₂, wie oben an-

Zu der dunkelbraunen alkalischen Lösung vom gegeben, kristallisieren.

pH um 11 gibt man Salzsäure bis zum Erzielen Das erhaltene reine kristalline Vitamin-B₁₂-Präpa-

des pH 8,0 zu und behandelt dann mit Aluminium- der Papierchromatographie 96,3 % Vitamin B₁, und oxid in der alkalischen Form (pH des wäßrigen 65 der Papierchromatographie 96,3 %Vitamin Bj und

Auszuges 10) unter statischen Bedingungen, indem 3,7 % nicht identifizierte Kobalamine, während der

man 0,1 Volumprozent Sorptionsmittel zugibt und Faktor ΙΠ fehlt. Die Ausbeute an lufttrockenen, in-

dieses bis zum Erzielen einer roten Lösung vom pH 9 tensiv roten Kristallen beträgt 29,8 %, bezogen auf

"7 O O O

11 12

den Gesamtinhalt an Kobalaminen in der Ausgangs- wart von 1,1 g Ammoniumrhodanid bei Zimmer-

kulturflüssigkeit, oder 57,3 °/o, bezogen auf den Ge- temperatur, schleudert die festen Teilchen ab, destil-

halt des Vitamins B_1S in dieser. Die Feuchtigkeit be- liert aus dem Zentrifugat das Aceton im Vakuum ab

trägt 12 %>. und verdünnt den wäßrigen Rückstand mit Wasser

Be'sniel 2 ^{5 au}^ *^ ¹^' ^'^{e erüa}^^tene wäßrige gelblich-rosa-

^p farbene Lögung, die 4,66 mg !Cobalamine enthält.

Man verwendet eine Biomasse, die aus der Kultur- unterwirft man einer Reinigung mittels der zwei

flüssigkeit des propionsauren Bakteriums Propioni- Al₂O₃-Formen.

bacterium shermanii abgetrennt wurde. Hierzu säuert man die Lösung mit 2 n-Salzsäure

In einem mit Rückflußkühler, Rührwerk und io bis zum pH 3,5 an und leitet sie durch eine Säule Thermometer versehenen Kolben säuert man das mit Al₂O₈ in der sauren Form gemäß Beispiel 2. Man Gemisch von 20 g Biomasse, 1,1 g Ammonium- erhält 105 ml rosafarbene Lösung vom pH 4,0 und fhodanid, 1,1 g des Natriumsalzes des N-Chlor- 70 ml Waschwasser vom pH 4,0. Diese Lösungen benzolsulfamids und 200 ml Wasser mit Salzsäure alkalisiert man mit 2n-NaOH bis zum pH 8,0 und bis rom pH 4,0 an und hydrolysiert gei«äß Bei- 15 leitet sie durch eine Säule mit Al₂O₃ in der alkalispiel 1. Nach Abschleudern der Teilchen reinigt man sehen Form gemäß Beispiel 2, nämlich zunächst die die überstehende gelbrosafarbene Flüssigkeit in einer Grundlösung und dann das Waschwasser und 15 ml Menge von 228 ml mit Hilfe der beiden Al₂O₈ For- Wasser vom pH 8,0. Man erhält 190 ml gereinigte men, indem man die 5,180 mg Kobalamine enthal- rosafarbene Lösung vom pH um 9. tende Lösung vom pH 3,5 durch Al₂O₃ in der sauren ao Diese gereinigte Lösung behandelt man weiter geForm (pH des wäßrigen Auszuges 3,0, Höhe der maß Beispiel 2; der danach photoelektrokolori-Sorptionssäule 3,5 cm, Durchmesser 2 cm) leitet; metrisch ermittelte Kobalamingehalt beträgt 3,710 mg man erhält 225 ml rosafarbene Lösung vom pH 4,0. oder 79,6 °/o, bezogen auf den Gehalt im wäßr xtn Das Sorptionsmittel wäscht man mit 120 ml Wasser Acetonextrakt. vom pH 4,0 zum Erzielen eines farblosen Eluats. as Nach Eindicken im Vakuum, Verdünnen mit Ace-

Die erhaltenen 225 ml Eluat werden mit 2 n-NaOH ton. Chromatogiaphieren auf Aluminiumoxid aus

bis zum pH 8,0 alkalisiert und durch mit Al₈O₈ in Aceton und anschließender Kristallisation gemäß

der alkalischen Form (pH des wäßrigen Auszugs 10, Beispiel 2 erhält man 2,1 mg lufttrockene Kristalle

Sorptionssäule 3 cm hoch und 2 cm im Durchmes- des Vitamins B₁₂, d. h. 44 Vo, bezogen auf den Kobal-

ser) geleitet; dann führt man durch dieselbe Säule 30 amingehalt im Ausgangsextrakt. Nach Befund der

das Waschwasser von der vorhergehenden Stufe, das Papierelektrophorese beträgt der Vitamin-B₁₂-Gehalt

zuvor bis zum pH 8,0 alkalisiert wurde, sowie noch der Kristalle 94,7 °/o, der an anderen Kobalaminen

10 ml Wasser vom pH 8,0. Das Gesamtvolumen der 5,3 °/o; fremde gefärbte Verunreinigungen fehlen, erhaltenen gereinigten rosafarbenen Lösung vom

pH 9 beträgt 350 ml. 35 Beispiel 4

Diese Lösung versetzt man mit 105 mg Kalium- Man verwendet ein gereinigtes wäßriges Konzen-

zyanid und extrahiert die Kobalamine quantitativ trat, erhalten aus der Kulturflüssigkeit der thenno-

mit dem Gemisch Phenol: CCl₄ 1 :1,1 (volumen- philen Methangärung gemäß Beispiel 1 und enthal-

mäßig). Aus der abgetrennten organischen Schicht tend 296 mg eines Kobalamingemisches, das nach

(84 ml) extrahiert man nach Zusatz von 126 ml CCI₄ 40 Befund der Elektrophorese und Papierchromatn-

und 67 ml Butanol die Kobalamine mit kleinen An- graphie aus 78 °/o Vitamin B₁₂, 15 ·/« Faktor III und

teilen Wasser und wäscht den vereinigten wäßrigen 7°/o übrigen Kobalaminen besteht. Das Konzentrat

Extrakt (100 ml) mit Äther. Der Gehalt der erhalte- verdünnt man mit Sfachem Volumen Aceton

nen Lösimg an Kobalaminen, ermittelt mit Hilfe (d — 0,786) und erhält eine wäßrige Lösung mit etwa

eines Photoelektrokolorimeters, beträgt 5,500 mg 45 81 bis 80 Gewichtsprozent Aceton. Der nach einem

oder 106 °/o vom Gehalt im Hydrolysat. kurzzeitigen Stehenlassen der Lösung ausgefällte

Diese Lösung wird im Vakuum auf ein geringes Niederschlag wird abfiltriert. Volumen eingedickt, mit vier Volumen Aceton ver- Die wäßrige Acetonlösung des Kobalanünge-

dünnt, auf einer AlgO₃-Säule aus wäßrigem 77gc- misches leitet man durch eine Säule mit chromato-

wichtsprozentigemAcetonchromatographiertund mit 5» graphischem Aluminiumoxid aus wäßrigem 81ge-

wäßrigem 47gewichtsprozentigem Aceton eluiert. wichtsprozentigem Aceton (d — 0,840), wobei die

Aus dem wäßrigen Acetoneluat (nach Verdünnen meisten Kobalamine eine rote Zone im oberen Tefl

mit einigen Volumen Aceton) kristallisiert das Vit- der Sorptionsmittelsäule bilden, wäscht dann die

•min B₁₂. Die Ausbeute an lufttrockenen Kristallen Säule mit dem gleichen wäßrigen Aceton, wobei das

!beträgt 3,7 mg oder 71,4 %>, bezogen auf den Kobal- 55 Vitamin B₁₂ einen roten Ring bildet, der sich von

mmingehalt in dem Ausgangshydrolysat. Nach Be- dem nachfolgenden Faktor HI und den meisten Be-

Ifund der Papierelektrophorese beträgt der Gehalt der gleitkobalaminen deutlich abtrennen läßt, während Kristalle an Vitamin B₁₂ 97,8 °'o, die Menge der der Faktor B, einige Kobalamine und das begleitende

übrigen Kobalamine 2,2 %; fremde gefärbte Ver- gelbe Begleitpigment mit den ersten Anteilen des

nnreinigungen fehlen. 60 genannten Eluats ausgewaschen werden. Sobald der

rote Ring des Vitamins B₁₂ das untere Drittel der

Beispiel 3 Sorptionssäule erreicht, beginnt man mit wäßrigem

58gewichtsprozenrigem Aceton (J = 0,897) zu elu-

20 g Biomasse des propionsauren Bakterinms ieren, wobei der Vorlauf und Nachlauf des Eluats

Propionibacterium shennanii mit einer Feuchtigkeit 65 des Vitamin-B^-Ringes getrennt gesammelt werden,

von 80 % bringt man in einen mit Ruckfmßkühler Aus dem dunkelroten Eluat kristallisiert das Vit-

nnd Rührer versehenen Kolben mit 50 ml Wasser amin B₁, nach Zugabe von 6 Volumen Aceton

nnd 15 ml Aceton, extrahiert 2 Stunden in Gegen- {d = 0,786).

Man erhält 117 mg lufttrockene Kristalle intensiv roter Farbe mit einer Feuchtigkeit von 10 %; die Ausbeute beträgt 55,4%, bezogen auf den Gehalt des Ausgangskonzentrats an Vitamin B₁₂.

Nach Befund der Elektrophorese und Papierchromatogr&phie bestehen die Kristalle aus 97 °/o Vitamin B₁₈ und 3°/o nicht identifizierten Kobalaminen; der Faktor ΙΠ und gelbe Pigmente fehlen.

Geringe Mengen Vitamin B₁₃ waren neben dem Faktor III und anderen Kokalaminen auch in den anderen Fraktionen, die beim Eluieren mit wäßrigem Aceton (d = 0,897) erhalten wurden, enthalten.

Claims (6)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung Patentanspruch: des Vitamins B12 aus Kulturflüssigkeiten oder Biomassen von Vitamin B1, produzierenden Mikro-Verfahren zur Isolierung des Vitamins B1, aus Organismen. der Kulturflüssigkeit oder der Biomasse" der 5 Das Vitamin B1, (5,6-Dimethylbenzimiriazolkobal- Mikroorganismen, die das genannte Vitamin pro- amin), das bekanntlich als ein biologischer Wirkstoff duzieren, an der Blutbildung teilnimmt und eine wichtige Rolle ,,,, ti j τ . -U-T. m ™ Stoffwechsel spielt, verwendet man in der Medi-

1. durch deren Hydrolyse bei erhöhten Tem- ^ _vor ^_{1n be}i verschiedenen Anämieformen soperaturen in saksaurem Mednun in Gegen- ₁₀ ^_{6 bei schweren} Verletzungen, besonders von Nerwart von Stabilisatoren oder durch deren _ven. _imd Knochengewebe. Für diese medizinische Extraktion mit wäßrig-organischen Ge- Verwendung wird ein Vitamin B₁₂ hohen Reinheits-

9 T^Cl^SnA _Η·ο α c · -· grades benötigt

2. durch daran, anschließende Sorpüonsreini- ^ _Das v-_ltamm B₁₂ begünstigt ferner das Wachstum ging der erhaltenen Hydrolysate bzw. der _{emi Tiere} ^¹^ _deshalb in der Viehzucht in Extrakte mit Aluminiumoxid im wäßrigen _Fo^ _{von Futterkonze}ntraten verschiedener Art verMedium oder durch daran anschließende _wendet

Sorptionsreinigung tier Hydrolysate mit _{Das vitamin B Mdet} sj_{ch durc]l} die Lebensemem monofunktionellen Karboxylkationen- ^g^it der Mikroorganismen, besonders der Mikroaustauscher von Polymerentyp in der _{ao flor}f _{des Bodens} ^ _des Magen-Darm-Kanais von

"n T!, u ^eiT^m P"-^Wert _t ^ⁿ 2'⁵J*¹⁸ Tier und Mensch, bei denen es in einigen Organen,

3,0 und durch ElUtK_3n des auf chesem Ka- ^ _{die Lebe geS}p_eichert wird. Die Leber war die

!ionenaustauscher adsorbierten Vitamins B_{12 erete Queüe} gg ^₆ Gewinnung von Vitamin-B₁₂-

^mLV Z ?^S" ^^omakl°^sung und an- _Konzentraten sowie kristallinen Präparaten. Später

schließend mit Ammomak-Borat-Puffer _verwendete man als Ausgangsstoffe verschiedene

3. durch daran anschließende Zyanierung der Mikroorganismen, hauptsächlich Actinomyceten, gereinigten Losungen zum Überführen des _{ρπ>ρίοη!}Γ_Ε11Γβ Bakterien und die mesophile und ther-Vitamins B₁₂ in die Zyanfoml· mophile Methangärung. Durch die Wahl spezieller

4. durch daran anschließende Extraktion der j«^«^ _und Kulturbedingungen für den jeweilizyanierten Losungen mit organischen Lo- _3O Ausgangsstoff konnte die Biosynthese des Vitsungsmitteln, ^ _ß ^ _{dessen Spe}i_{cherung m der} Kulturflüs-

5. durch daran anschließendes Chromatogra- _si^_dt ,j|_{deutend verstä}7_{kt wer}dln; da aber in den phieren auf Aluminiumoxid aus waßngen _Kulturflüssigkeitp.n auch andere verwandte Kobal-Acetonlosungen zum Abtrennen des Vit- ^^ besonders bei der Methangärung, gespeichert

« ^^.i^B^tkobalaminenund _werd ^_n, _{die Isolierung reinen} kristallinen Vit-

6. schließlich durch Kristallisation des abge- _amins β erschwert.

trennten Vitamins aus Aceton, _In Kulturflüssigkeiten liegen Vitamin Β,, und an-

dadurch gekennzeichnet, daß man die dere Kobalamine im allgemeinen an Eiweißstoffe